Adv Funct Mater (IF=19.9)｜抗體治療邁向實時監測：CP1.1雙傳感平臺同步檢測阿達木單抗與抗藥抗體！(陳嘯飛/樊芳/張鳳/劉耀陽/李全團隊)

2026年7月6日，海軍軍醫大學藥學系陳嘯飛/樊芳教授團隊聯合第二附屬醫院張鳳教授、第三附屬醫院劉耀陽教授團隊，在Advanced Functional Materials (中科院1區，TOP期刊，IF=19.9）發表題為“Paratope-Specific Recognition Biosensing Materials for Real-Time Monoclonal Antibody Detection and Personalized Therapy”的研究論文。該文于2025年11月30日投稿，2026年5月30日修回，2026年6月22日接收。

海軍軍醫大學藥學系陳嘯飛、樊芳，第二附屬醫院張鳳，第三附屬醫院劉耀陽為論文的共同通訊作者；研究生陳雨、張雨欣，第二附屬醫院/同濟大學醫學院附屬淞南鎮社區衛生服務中心龐濤為論文的共同第一作者。該研究開展過程中得到大學“深藍人才工程”特聘導師東南大學李全教授，藥學系柴逸峰教授，第二附屬醫院陳萬生教授的關鍵指導。

單克隆抗體藥物已廣泛用于腫瘤、自身免疫病和感染性疾病治療，但臨床療效常受到抗藥抗體（anti-drug antibody，ADA）產生的影響。如何快速、準確、動態監測患者體內單抗藥物濃度和ADA水平，是實現個體化給藥和精準治療的重要前提。

該研究以阿達木單抗（adalimumab，ADL）為模型藥物，提出一種雙重生物傳感策略：一方面，研究建立基于F(ab′)2片段的雙向正/負噬菌體展示篩選方法，成功篩選出可識別ADL抗原結合位點的環肽CP1；另一方面，研究利用ADL來源單鏈可變片段（single-chain variable fragment，scFv）作為ADA識別單元。隨后，團隊將優化后的CP1.1和c-scFv分別修飾到金納米顆粒（AuNPs）表面，構建CP1.1@AuNPs和c-scFv@AuNPs傳感材料，實現ADL和ADA的快速定量檢測。

結果顯示，該體系可在約2分鐘內完成檢測，與傳統ELISA結果高度一致，并已應用于33例強直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）患者的ADL和ADA動態監測。研究提示，該類“抗原結合位點特異性識別”生物傳感材料有望為單抗藥物治療中的治療藥物監測（therapeutic drug monitoring，TDM）、免疫原性評估和個體化用藥調整提供新工具。

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【摘 要】

單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）治療藥物已成為腫瘤、自身免疫性疾病和感染性疾病的重要治療手段。然而，抗藥抗體（anti-drug antibody，ADA）的形成常會削弱其療效。準確、動態檢測mAb藥物和ADA，對于早期免疫原性評估和個體化給藥具有重要意義。

本研究以阿達木單抗（adalimumab，ADL）為模型，開發了一種雙重生物傳感策略，可同時定量檢測mAb藥物和ADA。為解決mAb檢測中缺乏抗原結合位點特異性識別元件的問題，研究建立了基于F(ab′)2片段的雙向正/負噬菌體展示篩選方法，用于去除同源IgG干擾。通過該方法，研究成功鑒定出一種ADL抗原結合位點特異性識別肽CP1，其與ADL具有較高親和力，解離常數KD為7.84 μM。

對于ADA識別，研究采用ADL來源的單鏈可變片段（single-chain variable fragment，c-scFv）作為靶向ADA抗原結合位點的識別單元。隨后，研究將CP1和c-scFv分別偶聯至金納米顆粒（gold nanoparticles，AuNPs），構建用于ADL和ADA檢測的生物傳感材料CP1.1@AuNPs和c-scFv@AuNPs。該體系可在2分鐘內實現快速定量，其檢測結果與ELISA結果高度相關，相關系數R2=0.99。

這些經抗原結合位點特異性識別元件功能化的生物傳感器，已成功用于33例強直性脊柱炎患者體內ADL和ADA的實時檢測。該策略可支持個體化治療方案優化，并為mAb治療的精準管理提供一種實用方法。

01

研究背景及科學問題

單克隆抗體（mAb）治療藥物因具有高度特異性和良好臨床療效，已被廣泛用于腫瘤、自身免疫性疾病和感染性疾病的靶向治療。2024年，全球銷量排名前十的藥物中，mAb藥物占據半數，遠超小分子藥物，其臨床應用仍在逐年增長。然而，隨著mAb藥物臨床應用不斷增加，一些關鍵問題逐漸顯現，包括治療過程中難以快速、準確監測藥物暴露水平，以及抗藥抗體（ADA）產生等。

當外源性mAb被機體識別為外來抗原時，免疫系統會啟動反應并產生ADA。中和性ADA可直接結合治療性抗體，阻斷其與靶點相互作用，從而消除藥物活性。非中和性ADA雖然不直接干擾藥物功能，但可與藥物形成免疫復合物并加速清除，導致血清藥物濃度持續偏低，無法維持治療水平。因此，動態監測mAb濃度和ADA水平具有重要臨床價值，可用于早期預警、準確診斷和及時干預。

然而，mAb、ADA與內源性IgG在結構上高度相似，僅在抗原結合位點結構域中存在少數氨基酸差異，因此同時準確檢測mAb和ADA非常困難。造成這一困境的主要原因在于：絕大多數mAb藥物缺乏特異性識別元件，同時也缺少實時動態檢測方法。

肽類分子因分子量低、穩定性好、結構可調，被認為是mAb理想識別元件。與抗體或適配體相比，肽探針在傳感界面上可實現更高表面密度和更均一固定，從而獲得穩定一致的識別性能。目前，開發mAb靶向肽的策略主要包括計算機輔助設計和噬菌體展示篩選。前者依賴已知抗原結合位點結構，預測結果與實驗驗證之間往往一致性有限；后者在篩選過程中常受到非特異性IgG結合干擾。由于抗體Fc區域高度同源，如何消除IgG干擾并篩選出真正抗原結合位點特異性肽，仍是重要挑戰。

為解決這一問題，本研究開發了基于F(ab′)2片段的雙向正/負噬菌體展示篩選策略。該方法使用酶切獲得的F(ab′)2片段作為靶分子，從而使噬菌體優先結合抗體可變區。同時，該策略在三輪篩選中結合針對IgG的負篩選和針對F(ab′)2片段的正向富集，可有效去除IgG交叉反應肽，并保留高抗原結合位點特異性結合序列。由于不同患者產生的ADA具有差異，通用肽探針并不適用于ADA檢測，因此研究采用單鏈可變片段（scFv）作為識別單元。該片段可保留抗體特異性和結合能力，同時在不同pH和溫度條件下具有更好的穩定性。

阿達木單抗（ADL）是臨床最常用的mAb藥物之一，因此本研究選擇其作為模型，用于開發藥物和ADA水平動態監測策略。目前，臨床上ADL和ADA檢測方法尚未標準化。雖然已有多種基于ELISA的方法，但其依賴TNF-α蛋白和ADL作為識別元件，存在成本高、穩定性差、制備復雜等限制。

本研究將篩選獲得的ADL靶向環肽CP1（ACNPAHNNYCGGGS）和ADL來源單鏈可變片段c-scFv偶聯至AuNPs，分別形成用于ADL檢測的CP1.1@AuNPs和用于ADA檢測的c-scFv@AuNPs。該系統檢測結果與ELISA結果的一致性達到0.99，并可用于強直性脊柱炎患者ADL和ADA水平的實時監測，為抗體藥物精準給藥提供了新的方法。

02

重要發現及亮點

建立基于F(ab′)2片段的雙向正/負噬菌體展示篩選策略

噬菌體展示技術可通過反復篩選富集高親和力肽結合物，但在識別mAb特異性肽時，會受到大量內源性IgG的強烈干擾。mAb保守結構，尤其是Fc區域，會限制其抗原結合位點特異性；同時，生物樣本中IgG水平遠高于藥物抗體，因此所需肽探針必須具備極高特異性和親和力。

為克服這些限制，研究設計了基于F(ab′)2片段的正/負篩選策略。該方法去除Fc區域，以減少非特異性IgG結合，同時富集識別ADL特異性互補決定區（complementarity-determining regions，CDRs）的克隆。通過先去除IgG結合噬菌體，再篩選固定化ADL-F(ab′)2，該連續篩選流程可有效排除交叉反應克隆，并富集對ADL具有高特異性的肽序列。

圖1：ADL抗原結合位點特異性識別肽篩選流程，以及將其功能化至AuNPs用于ADL和ADA精準檢測的總體示意圖。（a）采用基于F(ab′)2的正/負噬菌體展示篩選策略，篩選ADL特異性環肽。（b）利用功能化AuNPs建立ADL和ADA定量分析方法；功能化元件包括環肽以及ADL的scFv片段，圖由BioRender繪制。（c）所開發的ADL和ADA同步檢測方法可用于AS患者實時監測，圖由BioRender繪制。通過整合參數分析和強直性脊柱炎疾病活動評分（Ankylosing Spondylitis Disease Activity Score，ASDAS）評估，該方法為臨床精準用藥提供了一條新路徑。

篩選獲得ADL抗原結合位點特異性識別肽CP1

研究采用IgG正/負雙相噬菌體展示策略，以ADL-F(ab′)2片段為靶標，對環狀七肽噬菌體文庫進行篩選。在三輪篩選中，每輪均預先去除對IgG具有親和力的噬菌體，以提高靶向特異性。

結果顯示，在各輪輸入噬菌體滴度基本一致的情況下，回收率逐步升高：第一輪為1.13×10?6，第三輪升至1.61×10?4。回收率持續升高說明具有目標特異性親和力的噬菌體被成功擴增和富集，也證明洗脫和篩選步驟有效。

在第三輪篩選后，研究進一步采用包被ADL-F(ab′)2或IgG的微孔板進行噬菌體滴定實驗。ADL-F(ab′)2包被板中，即使稀釋至104倍，噬菌斑仍多到難以計數，直到106倍稀釋才出現可見藍色噬菌斑；相反，IgG結合噬菌體在102倍稀釋后僅有43個噬菌斑，103倍稀釋后僅有4個噬菌斑。該結果進一步說明富集噬菌體對ADL-F(ab′)2具有特異性，而與IgG交叉反應較弱。

隨后，研究從第三輪滴定板中隨機挑選30個陽性單克隆噬菌體進行Sanger測序。共鑒定出6種不同肽序列，并按出現頻率命名為CP1至CP6。其中CP1出現15次，占所有序列的50.00%，為最富集序列；CP2和CP3各出現4次，占13.33%；CP4出現3次，占10.00%；CP5和CP6各出現2次，占6.67%。

圖2：F(ab′)2片段雙向正/負噬菌體展示篩選結果。（a）各輪篩選中噬菌體輸入量和回收率比較。（b）洗脫噬菌體克隆得到的肽序列。（c）第三輪洗脫液與陽性抗體ADL-F(ab′)2及陰性抗體IgG之間的藍色噬菌斑計數比較。（d）最終一輪篩選所得噬菌體的測序結果。

CP1表現出對ADL的較高親和力和特異性

獲得陽性克隆序列后，研究首先采用噬菌體ELISA初步評估CP1—CP6的特異性。結果顯示，展示CP1、CP2、CP4、CP5和CP6的噬菌體與ADL-F(ab′)2結合時的響應值顯著高于IgG對照，而CP3的差異不明顯。這提示CP1、CP2、CP4、CP5和CP6對ADL-F(ab′)2具有一定特異性，但仍需進一步驗證親和力。

隨后，研究采用表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）技術評價合成肽的特異性和親和力。所有6種環肽均通過固相合成制備，純度均超過95%，并經高效液相色譜（HPLC）和液相色譜-質譜（LC-MS）確認。研究分別將ADL和IgG固定于CM5傳感芯片，再注入不同濃度肽以檢測結合相互作用。

SPR結果顯示，CP1與ADL具有較高親和力和顯著特異性，解離常數KD為7.84 μM，并且與IgG無可檢測結合。相比之下，CP2、CP3和CP4不同程度地同時結合ADL和IgG，說明特異性有限；CP5和CP6對ADL或IgG均未顯示可測量結合。綜合噬菌體ELISA和SPR結果，CP1被確定為最有潛力的候選肽，用于后續開發。

研究進一步利用分子對接和分子動力學模擬解析CP1與ADL-F(ab′)2之間的相互作用。AutoDock Tools 1.5.6對接結果顯示，CP1與ADL-F(ab′)2具有較強結合親和力，結合能為?7.99 kcal·mol?1。通常結合能低于?7.00 kcal·mol?1提示相互作用較強，負值則說明結合可自發發生，支持二者形成穩定復合物。結構模型顯示，CP1與ADL-F(ab′)2之間的相互作用主要由氫鍵網絡穩定。

殘基水平結合能分析表明，ADL-F(ab′)2中的Thr-173、Phe-174和Tyr-95對結合貢獻最大，結合能分別為?1.90、?1.80和?1.40 kcal·mol?1，提示這些殘基在維持復合物穩定性中發揮關鍵作用。此外，Glu-156、Val-160和Glu-165等殘基也參與相互作用，但貢獻相對較小。這些關鍵殘基位于配體結合口袋附近，可共同構建協同相互作用網絡。

分子動力學模擬進一步顯示，ADL-F(ab′)2–CP1復合物的均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）在0.2—0.4 nm之間波動，相較游離ADL-F(ab′)2僅略有降低，提示整體結構穩定。均方根波動（root mean square fluctuation，RMSF）分析顯示，兩種體系具有相似波動模式，整體數值約為1 nm，在Thr-173附近存在輕微差異，與分子對接結果一致。回轉半徑（radius of gyration，Rg）在模擬過程中穩定在約2.4 nm，說明CP1結合不會引起明顯構象改變。氫鍵分析顯示，CP1與ADL-F(ab′)2之間可持續維持4—7個氫鍵，最多可達11個，提示存在穩定分子間相互作用。溶劑可及表面積（solvent-accessible surface area，SASA）分析顯示，兩者曲線幾乎重疊，穩定波動于約200 nm2，進一步說明CP1結合未顯著改變ADL-F(ab′)2整體結構。自由能景觀分析顯示，ADL-F(ab′)2以及ADL-F(ab′)2–CP1復合物均形成明確最低能量簇，復合物雖能量分布略寬，但仍處于穩定低能狀態。MM/GBSA計算得到平均結合自由能為?31.88 kcal·mol?1，進一步證明CP1與ADL-F(ab′)2之間存在較強且有利的結合。

圖3：環肽與ADL結合的驗證。（a）噬菌體ELISA實驗原理與流程圖，由BioRender繪制。（b）環肽CP1—CP6對ADL和IgG對照的噬菌體ELISA響應。數據以均值±標準差（S.D.）表示（n=3）。（c）SPR分析CP1與ADL及IgG的結合親和力。（d）ADL-F(ab′)2與CP1相互作用的分子模擬。（e）ADL蛋白中參與CP1結合的氨基酸殘基能量貢獻。（f–j）分子動力學（molecular dynamics，MD）分析：（f）RMSD，（g）RMSF，（h）Rg，（i）界面氫鍵，以及（j）SASA。（k）ADL-F(ab′)2上方部分和ADL-F(ab′)2–CP1下方部分的自由能分布圖。

構建用于ADL和ADA特異性識別的AuNPs生物傳感平臺

鑒于CP1具有較高親和力和特異性，研究進一步將其修飾到AuNPs表面，用于構建ADL檢測傳感器。首先，為提高CP1水溶性并便于其與AuNPs偶聯，研究將CP1 C端GGGS序列替換為KKKC，得到水溶性更好的CP1.1（ACNPAHNNYCKKKC）。CP1.1經LC-MS和HPLC表征確認。SPR結果顯示，CP1.1與ADL仍具有良好結合親和力，KD為3.76 μM，低于CP1，且與IgG無非特異性結合。這說明CP1.1是一種可特異性結合ADL且水溶性良好的肽探針。

隨后，研究通過Au–S鍵將CP1.1偶聯到AuNPs表面，構建CP1.1@AuNPs生物傳感器。由于CP1.1分子尺寸較小、表面堆積密度較高，肽功能化僅在相鄰納米顆粒之間產生較小空間位阻。UV–vis光譜顯示，偶聯后表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）吸收帶無明顯變化，說明單純肽接枝不會導致顯著等離子體耦合。透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）進一步顯示，表面修飾后雖發生輕微顆粒間關聯，但AuNPs仍基本保持球形形貌和較窄粒徑分布。這提示短肽配體主要發揮表面穩定作用，僅引起有限納米顆粒聚集。

與此同時，研究將c-scFv作為較大的生物識別元件用于捕獲ADA，并通過Au–S鍵偶聯至AuNPs，得到c-scFv@AuNPs生物傳感器。與CP1.1相比，c-scFv分子尺寸更大、表面堆積密度更低，因此在納米顆粒界面引入更明顯空間效應。AuNPs的UV–vis光譜顯示，c-scFv偶聯后SPR峰輕微紅移，提示局部介電環境發生一定變化，但此階段尚未出現強等離子體耦合。TEM圖像顯示，其形貌總體與CP1.1@AuNPs相似，表現為輕度聚集，同時整體粒徑均一性仍得以保留。

為評價CP1.1@AuNPs和c-scFv@AuNPs分別對ADL和ADA的響應能力，研究系統檢測其光學性質。當向56 μg/mL CP1.1@AuNPs中加入200 μg/mL ADL后，526 nm處SPR吸收峰明顯下降，同時溶液顏色由粉紅色轉為淺藍紫色，說明CP1.1@AuNPs可有效識別ADL。TEM圖像證實，加入ADL后CP1.1@AuNPs出現靶標誘導聚集。動態光散射（dynamic light scattering，DLS）進一步顯示，水合粒徑由約32.70 nm增加至約50.70 nm，提示發生由肽介導的顆粒間交聯引起的中等程度聚集。

類似地，向0.5 ng/mL c-scFv@AuNPs中加入200 μg/mL ADA后，526 nm吸收峰明顯降低，并伴隨顏色變化，證實c-scFv@AuNPs對ADA具有特異性響應。TEM結果顯示，加入ADA后形成廣泛互聯的聚集網絡。DLS檢測顯示，粒徑由約58.80 nm急劇增加至約712.00 nm，提示形成大規模顆粒間組裝，并產生更強等離子體耦合效應。

值得注意的是，c-scFv@AuNPs誘導的聚集較CP1.1@AuNPs更明顯。這一差異可能與scFv分子量較大有關。scFv約25—30 kDa，而CP1.1約1—2 kDa。較大的分子尺寸導致scFv表面接枝密度較低，但提供更長有效結合距離和更大構象靈活性，從而有利于ADA識別時橋接相鄰AuNPs，形成更大聚集體并增強等離子體耦合。相比之下，緊湊肽層雖可實現高表面覆蓋，但主要通過短程相互作用介導聚集，因此形成的組裝體相對較小，光譜位移也較弱。

圖4：用于ADL和ADA檢測的功能化AuNPs生物傳感器構建。（a）CP1.1與ADL之間、CP1.1與IgG之間結合親和力的SPR分析。（b）通過CP1.1和c-scFv與AuNPs偶聯構建CP1.1@AuNPs和c-scFv@AuNPs傳感器的示意圖，由BioRender繪制，并分別用于ADL和ADA檢測。（c）AuNPs、CP1.1@AuNPs和CP1.1@AuNPs@ADL的TEM圖像。（d）CP1.1@AuNPs@ADL的動態光散射圖譜。（e）AuNPs、c-scFv@AuNPs和c-scFv@AuNPs@ADA的TEM圖像。（f）c-scFv@AuNPs@ADA的動態光散射圖譜。（g）AuNPs、CP1.1@AuNPs以及與200 μg/mL ADL孵育后的CP1.1@AuNPs的UV–vis光譜。（h）AuNPs、c-scFv@AuNPs以及與90 AU/mL ADA孵育后的c-scFv@AuNPs的UV–vis光譜。（i）CP1.1@AuNPs（10 μg/mL）對多種mAb的UV–vis響應。數據以均值±S.D.表示（n=3）。（j）c-scFv@AuNPs（0.5 ng/mL）對多種mAb的UV–vis響應。數據以均值±S.D.表示（n=3）。（k）CP1.1@AuNPs（56 μg/mL）與不同濃度ADL（0、0.5、1、2、5、10、15、20和30 μg/mL）孵育后的UV–vis光譜。插圖顯示CP1.1@AuNPs（56 μg/mL）對不同濃度ADL的檢測溶液顏色變化，以及0.5—30 μg/mL范圍內A526 nm與ADL濃度的關系圖。數據以均值±S.D.表示（n=3）。（l）c-scFv@AuNPs（0.5 ng/mL）與不同濃度ADA（1、10、25、50、70和90 AU/mL）孵育后的UV–vis光譜。插圖顯示c-scFv@AuNPs對不同ADA濃度的檢測溶液顏色變化，以及1—90 AU/mL范圍內A542 nm與ADA濃度的關系圖。

CP1.1@AuNPs和c-scFv@AuNPs具有良好選擇性并可實現實時定量檢測

考慮到生物體系十分復雜，研究進一步評估CP1.1@AuNPs對ADL以及c-scFv@AuNPs對ADA的特異性。研究選擇12種臨床常用mAb以及IgG、IgA、IgE和IgM作為潛在干擾物，包括3種抗PD-1 mAb，即帕博利珠單抗（pembrolizumab，PEM）、替雷利珠單抗（tislelizumab，TIS）、納武利尤單抗（nivolumab，NIV）；2種TNF-α抑制劑，即ADL、英夫利昔單抗（infliximab，IFX）；3種EGFR抑制劑，即貝伐珠單抗（bevacizumab，BEV）、西妥昔單抗（cetuximab，CET）、尼妥珠單抗（nimotuzumab，NIM）；以及1種HER2抑制劑維迪西妥單抗（disitamab，DIS）。每種mAb以100 μg/mL加入CP1.1@AuNPs或c-scFv@AuNPs溶液，并監測吸光度變化。

結果顯示，CP1.1@AuNPs僅對ADL產生響應，其他mAb未引起明顯UV吸收變化，說明CP1.1@AuNPs可特異性響應ADL。同樣，c-scFv@AuNPs僅在ADA存在時吸光度發生明顯改變，證實其對ADA具有特異性。重要的是，僅含ADL或ADA的溶液出現明顯顏色變化，分別由粉紅色轉為淡紫色、由紅色轉為紫色。這進一步證明CP1.1@AuNPs和c-scFv@AuNPs分別對ADL和ADA具有較高特異性。

為進一步考察其檢測能力，研究開展UV滴定實驗。對于CP1.1@AuNPs，隨著ADL濃度從0升高至30 μg/mL，526 nm處吸收峰逐漸降低。在該濃度范圍內，A526 nm與ADL濃度呈良好線性關系，檢測限（limit of detection，LOD）估計為0.45 μg/mL。同時，檢測溶液顏色隨ADL濃度升高由粉紅色逐漸轉為淡紫色，最終趨于透明，便于肉眼觀察ADL水平。值得注意的是，所有測量均可在混合后1分鐘內完成，提示CP1.1@AuNPs對ADL具有快速響應能力。

對于c-scFv@AuNPs，隨著ADA濃度升高，542 nm處吸光度逐漸降低并略有藍移。在1—90 AU/mL范圍內，A542 nm與ADA濃度呈良好線性關系，線性方程為Y=?0.003766X+0.6715（R2=0.9831），LOD估計為0.89 AU/mL。溶液顏色也隨ADA濃度增加由紅色變為紫色。這些結果表明，c-scFv@AuNPs可根據ADA濃度產生UV吸收變化，適合用于ADA高靈敏定量分析。

基于二者對ADL和ADA的良好響應性能，研究進一步評估其在臨床血清樣本中的檢測能力。考慮到血清背景噪聲和基質效應可能造成干擾，研究建立了改良檢測流程，用于準確量化血清中的ADL和ADA。為模擬臨床條件，研究向正常血清中加入不同濃度ADL，并與CP1.1@AuNPs孵育后檢測吸光度。結果顯示，當血清中ADL濃度從0升至30 μg/mL時，526 nm處吸收峰按比例降低，ADL濃度與吸光度之間具有強線性相關，線性方程為Y=?0.003729X+0.5200（R2=0.9951）。這證實CP1.1@AuNPs可在人體血清中準確定量ADL，動態范圍適合臨床檢測。

對于ADA定量，血清中ADA濃度在1—90 AU/mL范圍內升高時，530 nm處UV吸收峰逐漸下降，并表現出良好線性關系。線性方程為Y=?0.001319X+0.4122（R2=0.9925），說明c-scFv@AuNPs可有效用于血清中ADA定量檢測。

隨后，研究將CP1.1@AuNPs和c-scFv@AuNPs用于接受ADL治療患者的血清樣本檢測。結果顯示，納米顆粒檢測方法與傳統ELISA結果高度相關，ADL和ADA檢測的相關系數分別為0.9921和0.9936。與其他已報道ADL檢測方法相比，該方法具有更好的臨床相關性、更低檢測限、更快響應速度和更簡便操作。上述結果說明，CP1.1@AuNPs和c-scFv@AuNPs可可靠檢測臨床血清樣本中的ADL和ADA，為床旁檢測（point-of-care，POC）分析提供實用準確工具，也可用于評估ADL和ADA血藥水平，支持個體化精準治療干預。

圖5：使用功能化AuNPs進行血清樣本分析。（a）所開發的基于功能化AuNPs的ADL和ADA檢測流程與傳統ELISA方法之間的示意性比較，由BioRender繪制。（b）CP1.1@AuNPs（56 μg/mL）與血清中不同濃度ADL孵育后的UV–vis光譜。（c）0.5—30 μg/mL范圍內A526 nm與ADL濃度的校準曲線。（d）采用Passing–Bablok回歸分析比較本研究UV–vis檢測法與商業試劑盒在ADL定量中的方法準確性；p表示統計學顯著性。（e）c-scFv@AuNPs（0.5 ng/mL）與血清中不同濃度ADA孵育后的UV–vis光譜。（f）1—90 AU/mL范圍內A530 nm與ADA濃度的校準曲線。（g）采用Passing–Bablok回歸分析比較本研究UV–vis檢測法與商業試劑盒在ADA定量中的方法準確性；p表示統計學顯著性。

ADL和ADA動態監測可輔助AS患者個體化治療優化

強直性脊柱炎（AS）是一種慢性自身免疫性疾病，通常需要長期抗炎治療，ADL是最常用的一線生物制劑之一。ASDAS常用于臨床評估疾病活動度和治療效果。根據ASDAS-C反應蛋白（C-reactive protein，CRP）評分標準，評分≥2.1提示高疾病活動度，1.3≤評分<2.1提示低疾病活動度，評分<1.3提示疾病不活動。

然而，臨床實踐中可見部分患者即使ASDAS評分提示低活動度或不活動，仍持續存在疼痛、疲乏等癥狀。研究團隊既往研究也提示，一些ASDAS評分較低的AS患者仍可檢測出ADA陽性，并需要使用鎮痛或助眠藥物。這可能與藥物濃度不足或ADA觸發免疫反應有關。因此，ADA檢測可能成為評價ADL療效的重要補充，為臨床醫生在傳統疾病活動度評分之外提供基于生物標志物的參考。

本研究共收集35份AS臨床樣本，其中33例獲得ASDAS-CRP評分，另2例因缺少CRP數據而無法計算。結果顯示，54.3%患者（n=19）ASDAS-CRP<1.3，屬于疾病不活動；20%患者（n=7）ASDAS-CRP≥2.1，屬于高疾病活動度；其余7例為低疾病活動度。

隨后，研究采用本研究建立的CP1.1@AuNPs和c-scFv@AuNPs系統，以及傳統ELISA方法檢測樣本中的ADL濃度和ADA水平。結果顯示，回收率分別為80.6%—116.1%和86.7%—116.1%，提示臨床樣本中具有良好準確性和重復性。該結果與傳統ELISA高度一致，相關系數分別為0.9921和0.9936。

由于CRP和紅細胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）常用于評價炎癥，研究進一步比較了不同疾病活動度組的這些指標。結果顯示，僅CRP水平在疾病不活動組與高活動組之間存在顯著差異（p=0.005）。相關性分析進一步顯示，ADA水平與CRP水平呈正相關，而ASDAS-CRP評分也與CRP水平相關。這間接提示，ADA水平可能與ASDAS-CRP評分相關，并隨ASDAS-CRP升高而升高。因此，血清ADA水平可能作為評價ADL療效的重要補充指標，為臨床決策提供生物標志物證據。

基于上述結果，研究進一步開展2年隨訪，利用CP1.1@AuNPs和c-scFv@AuNPs系統動態監測3例AS患者血清ADL和ADA水平。結果顯示，不同患者之間以及同一患者不同時點之間，ADL和ADA水平均存在明顯變化。總體而言，個體內ADL濃度相對穩定或逐漸升高，其中患者1和患者3約為5 μg/mL，患者2約為10—30 μg/mL；相比之下，ADA水平波動更明顯。

對于ADA，檢測閾值用于區分樣本為陽性或陰性，>10 AU/mL定義為陽性，<10 AU/mL定義為陰性。該10 AU/mL閾值基于檢測方法驗證，并符合美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）監管指南要求。盡管閾值可能隨檢測方法，如ELISA或增強化學發光（enhanced chemiluminescence，ECL），以及疾病類型不同而變化，但>10 AU/mL這一設置已在臨床實踐中使用超過20年，旨在提供一致且可比的數據以支持治療決策，并被“阿達木單抗抗藥抗體擬議WHO國際生物參考制劑”推薦。

隨訪顯示，患者1基線ADA陽性，患者3為ADA陰性，而患者2在隨訪過程中由ADA陰性轉為ADA陽性，提示ADA免疫原性隨時間逐漸增強。患者1基線ADA為11.23 AU/mL，同時使用非甾體抗炎藥（non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs），劑量為1.2 g/天；10個月后NSAIDs劑量增加至4.0 g/天。患者2初始ADA陰性，為4.63 AU/mL，但10個月后轉為陽性，升至21.77 AU/mL。值得注意的是，該患者出現疼痛和睡眠障礙，因此加入中藥改善睡眠和緩解疼痛，提示ADL在緩解難治性疼痛和睡眠障礙方面療效有限。患者3 ADA陰性（<10 AU/mL），除因轉氨酶升高使用保肝藥物外，未使用其他附加藥物。

研究同時收集了3例患者的臨床指標。結果顯示，患者1在2年隨訪期間CRP水平和ASDAS-CRP評分持續下降。10個月后，CRP降至正常范圍（<0.5 ng/mL），ASDAS由低活動度轉為不活動，并保持穩定。患者2和患者3在整個研究期間CRP水平均維持正常，ASDAS-CRP評分提示疾病不活動（<1.3）。然而，值得注意的是，盡管患者2的CRP和ASDAS-CRP顯示臨床改善，其ADA水平仍持續升高，并伴隨睡眠障礙和疼痛加重。這說明ADA水平在臨床療效評估中具有重要補充價值。

因此，定期監測血清ADL水平，例如每3—6個月監測一次，同時監測ADA水平，對于早期發現潛在免疫原性風險十分重要。即使ADL濃度保持穩定、藥物暴露充足，患者也可能在某個時間點出現ADA突然升高，提示療效下降或治療失敗風險。一旦檢測到ADA陽性，可及早優化治療方案，從而提高臨床干預效率。考慮到TNF抑制劑治療費用較高，且患者臨床反應差異明顯，ADL個體化治療策略十分必要，可減少治療不足和過度治療。為此，研究提出應嚴格開展ADL谷濃度和ADA的治療藥物監測，以優化藥物使用、提高療效，并最終改善患者結局和生活質量。

圖6：33例AS患者臨床樣本中ADL和ADA水平評估。（a）使用CP1.1@AuNPs和c-scFv@AuNPs檢測ADL和ADA，用于臨床療效評估和治療干預。（b）高活動度、低活動度和不活動AS患者之間CRP、ESR、ADL水平和ADA水平比較。（c）3例AS患者中ADL和ADA水平的圖形化展示。（d、e）3例AS患者常用合并用藥和臨床參數。統計學方法：在使用Brown–Forsythe檢驗確認方差齊性后，采用單因素方差分析進行數據分析；p<0.05認為差異具有統計學意義。

【貢獻】★★★★★

本研究提出了一種新型雙重生物傳感平臺，可實現ADL和ADA的同步、實時監測，從而回應治療性mAb管理中的關鍵難題。為解決傳統mAb檢測中缺乏特異性識別元件的問題，研究開發了基于F(ab′)2片段的創新正/負雙向噬菌體展示篩選策略。該方法成功鑒定出高親和力肽CP1，可選擇性識別ADL，并最大限度減少IgG干擾；SPR驗證顯示其KD為7.84 μM。

對于ADA檢測，研究采用c-scFv片段作為穩定且適應性良好的識別單元。通過整合這些識別元件，研究構建了兩種基于AuNPs的生物傳感器，即CP1.1@AuNPs和c-scFv@AuNPs，用于快速、定量檢測ADL和ADA。將該方法應用于接受ADL治療的AS患者血清樣本后，檢測結果表現出良好準確性，并與ELISA結果高度一致（R2=0.99）。

因此，該體系可用于治療療效的實時評估和個體化治療優化。作者認為，這是首個能夠同步監測ADL和ADA血藥水平的系統，為臨床治療性抗體精準使用提供了新的策略。需要注意的是，本研究主要聚焦ADL/ADA檢測平臺構建及AS患者樣本驗證，未來仍需在更大規模、多中心、不同單抗藥物和不同疾病人群中進一步驗證其臨床適用性、標準化閾值和長期治療決策價值。

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