意難平！這位華裔泰斗發(fā)明的引物延伸法，直接催生兩大諾獎(jiǎng)，本人卻終生無(wú)緣諾獎(jiǎng)

在科學(xué)界，有這樣一位「無(wú)冕之王」：他雖然一生與諾貝爾獎(jiǎng)擦肩而過(guò)，但 1980 年與 1993 年的兩項(xiàng)諾貝爾獎(jiǎng)核心技術(shù)，都建立在他親手敲下的底層邏輯之上。他是國(guó)際學(xué)術(shù)界公認(rèn)的生物科學(xué)泰斗 —— 吳瑞先生。

圖片來(lái)源：Ray Wu Fund [1]

一位頂級(jí)科學(xué)家的貢獻(xiàn)，一種在于他親手推開(kāi)了多少扇真理的大門(mén)，另一種則在于他為后輩點(diǎn)亮了多少盞指路明燈。吳瑞先生不僅做到了前者，更把后半生的全部心血傾注在了后者。

01 解碼「DNA 天書(shū)」的第一行

1968 年，距離沃森和克里克發(fā)現(xiàn) DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)已過(guò)去 15 年，科學(xué)界早已明確 DNA 是遺傳信息的載體，由 A、T、C、G 四種堿基組成。早在 1955 年，桑格（Frederick Sanger）就已測(cè)定出胰島素的氨基酸序列，但面對(duì) DNA，整個(gè)學(xué)術(shù)界卻陷入了困境，DNA 測(cè)序被視為無(wú)法突破的禁區(qū)。

當(dāng)時(shí)的技術(shù)條件存在諸多局限：DNA 成分單一，只有 4 種堿基，化學(xué)性質(zhì)極其相似，很難像氨基酸那樣逐一剝離。而且鏈條過(guò)長(zhǎng)，動(dòng)輒數(shù)萬(wàn)個(gè)堿基，當(dāng)時(shí)的提純技術(shù)無(wú)法獲得足夠純凈且長(zhǎng)度適中的片段。當(dāng)時(shí)限制性?xún)?nèi)切酶（Restriction Enzymes）尚未被廣泛發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用（直到 1970 年才首次發(fā)現(xiàn)），科學(xué)家無(wú)法精準(zhǔn)地切割 DNA。

人類(lèi)已經(jīng)知道了 DNA 是遺傳信息的載體，卻對(duì)如何「讀取」它一籌莫展。

彼時(shí)，受桑格早期研究的影響，學(xué)術(shù)界的主流思維一直局限于如何通過(guò)化學(xué)或核酸酶將 DNA 鏈「降解」來(lái)分析。而吳瑞反其道而行之，首創(chuàng)了「邊合成邊測(cè)序」的方法 ——

他沒(méi)有去切割 DNA，而是以噬菌體 λ DNA 末端游離的 12 個(gè)單鏈堿基作為模板，其互補(bǔ)鏈內(nèi)凹的 3'-羥基（3'-OH）則天然充當(dāng)了聚合酶結(jié)合的起點(diǎn)。在反應(yīng)體系中，吳瑞精確地交替加入帶有放射性同位素（如 32P）標(biāo)記的脫氧核苷酸（dNTPs）。聚合酶每延伸補(bǔ)齊一個(gè)堿基，放射性信號(hào)便被錨定在新合成的鏈上。通過(guò)控制反應(yīng)時(shí)間和逐一添加堿基的策略，他精確測(cè)量了被納入鏈中的堿基種類(lèi)和數(shù)量。[2]

這一突破確立了「酶促合成測(cè)序法」的范式，標(biāo)志著生命科學(xué)研究從「觀察分子形態(tài)」的宏觀時(shí)代，正式跨越到了「解碼遺傳代碼」的微觀時(shí)代，為后續(xù) DNA 測(cè)序技術(shù)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。

02 他奠定了兩項(xiàng)諾獎(jiǎng)技術(shù)基礎(chǔ)

如果說(shuō) 1968 年的突破是實(shí)現(xiàn)了對(duì)特定 DNA 片段的「首度解碼」，那么1971 年，吳瑞則為全人類(lèi)發(fā)明了讀取 DNA 遺傳密碼的「通用指南」。

在那個(gè)生化反應(yīng)尚顯粗糙的年代，吳瑞首次提出引物延伸（Primer Extension）原理——

通過(guò)人工合成一段短小的寡核苷酸（即引物），使其與模板 DNA 的特定位置雜交（Hybridization），就能引導(dǎo)聚合酶從精準(zhǔn)的起始點(diǎn)開(kāi)始定向合成 [3]。

這一發(fā)現(xiàn)，徹底重塑了現(xiàn)代生物科學(xué)。

1980 年諾獎(jiǎng)得主 Sanger 的雙脫氧法，本質(zhì)上就是在吳瑞的引物延伸體系里，巧妙地加入了一個(gè)終止堿基（ddNTP）。斬獲 1993 年諾獎(jiǎng)的 PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)，其核心動(dòng)力學(xué)完全建立在雙引物介導(dǎo)的延伸之上。

可以說(shuō)，今天我們做的每一次核酸檢測(cè)、每一項(xiàng)基因測(cè)序，都離不開(kāi)吳瑞在 1971 年的這項(xiàng)偉大發(fā)明。

在重組 DNA 技術(shù)發(fā)展的初期，異源 DNA 片段的「末端不兼容」仍是該領(lǐng)域面臨的瓶頸。盡管限制性?xún)?nèi)切酶能夠?qū)固囟ㄐ蛄羞M(jìn)行切割，但物理剪切或不同內(nèi)切酶產(chǎn)生的平末端（Blunt ends）及非互補(bǔ)粘性末端，嚴(yán)重阻礙了連接酶的催化效率，導(dǎo)致基因片段無(wú)法實(shí)現(xiàn)通用的跨物種拼接。

1976 年，吳瑞實(shí)驗(yàn)室打破了這一技術(shù)僵局。

他們率先將化學(xué)合成技術(shù)與酶學(xué)手段相結(jié)合，發(fā)明了DNA 聯(lián)接子（Linkers）[4] 與銜接子（Adaptors）[5]。這項(xiàng)技術(shù)通過(guò)在目的片段末端共價(jià)附加含有特定核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列的短雙鏈寡核苷酸，賦予了任意 DNA 片段人工定制的「粘性末端」。

后來(lái)我們熟知的利用大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素、構(gòu)建各類(lèi)工程菌，均繞不開(kāi)這套高效的 DNA 組裝方案，直接奠定了現(xiàn)代生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的基礎(chǔ)。

03 老先生傳奇的一生

在 20 世紀(jì) 70 年代末，許多尖端實(shí)驗(yàn)協(xié)議（Protocols）僅在少數(shù)頂尖實(shí)驗(yàn)室口耳相傳，缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性極低。

吳瑞先生承擔(dān)了科學(xué)界極其重要的一項(xiàng)基建工程：他主編了學(xué)術(shù)界「圣經(jīng)」——《酶學(xué)方法》（Methods in Enzymology）中關(guān)于重組 DNA（Recombinant DNA）的關(guān)鍵卷次（如第 68、100、101 卷等）[6]。

這種標(biāo)準(zhǔn)化的推廣，使得即便是資源有限的發(fā)展中國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，也能開(kāi)展復(fù)雜的分子克隆研究。吳瑞先生讓生物技術(shù)從少數(shù)科學(xué)家的領(lǐng)地，變成了全球共享的科學(xué)生產(chǎn)力。

如果說(shuō) 1968 年和 1971 年的發(fā)現(xiàn)是吳瑞在分子層面上書(shū)寫(xiě)傳奇，那么他后半生的重心，則轉(zhuǎn)向了更為宏大的命題 —— 科學(xué)知識(shí)的代際傳承與跨國(guó)界的人才播種。

在 80 年代初期，中國(guó)生命科學(xué)領(lǐng)域面臨嚴(yán)重的人才斷層。吳瑞敏銳地意識(shí)到，單純引進(jìn)技術(shù)是不夠的，必須將中國(guó)最優(yōu)秀的學(xué)生送往世界頂尖的實(shí)驗(yàn)室。

1981 年，吳瑞用自己作為頂尖科學(xué)家的個(gè)人信譽(yù)作為擔(dān)保，給幾十所美國(guó)名校寫(xiě)信游說(shuō)，說(shuō)服他們接受由他專(zhuān)門(mén)組織的一套「CUSBEA 專(zhuān)項(xiàng)考試」。[7]

他動(dòng)用自己的人脈，每年邀請(qǐng)、甚至親自陪同美國(guó)頂尖大學(xué)的知名教授（如康奈爾大學(xué)的 Richard McCarty 教授等）飛到北京和廣州，去給中國(guó)學(xué)生做一對(duì)一的全英文面試。[8]

CUSBEA 的項(xiàng)目從 1981 年開(kāi)始，到 1989 年結(jié)束，在這 8 年間，共選拔派出了 422 名優(yōu)秀的中國(guó)學(xué)生赴美頂尖高校攻讀生命科學(xué)領(lǐng)域的博士學(xué)位 ——

袁鈞瑛（第一屆學(xué)者）： 現(xiàn)任哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院終身教授、美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院士。她發(fā)現(xiàn)了控制細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵基因，隨后開(kāi)創(chuàng)了細(xì)胞程序性壞死（Necroptosis）這一全新研究領(lǐng)域。

王曉東（第三屆學(xué)者）：41 歲即當(dāng)選美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院士，他在細(xì)胞凋亡的生化途徑解析上做出了諾獎(jiǎng)級(jí)別的突破性貢獻(xiàn)，并于 2003 年回國(guó)創(chuàng)辦了深刻影響中國(guó)科研體制的北京生命科學(xué)研究所（NIBS）。

施揚(yáng)（第一屆學(xué)者）： 現(xiàn)任牛津大學(xué)路德維希癌癥研究所主任，他在 2004 年發(fā)現(xiàn)了人類(lèi)歷史上第一個(gè)組蛋白去甲基化酶（LSD1），推翻了學(xué)術(shù)界幾十年的教條，為癌癥靶向治療提供了大量全新靶點(diǎn)。

解密神經(jīng)環(huán)路的駱利群、發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞關(guān)鍵機(jī)制的林海帆、推動(dòng)中國(guó)科研體制改革的王小凡 ……

這份熠熠生輝的名單很長(zhǎng)。這 422 人，匯聚成了推動(dòng) 21 世紀(jì)生命科學(xué)狂飆突進(jìn)的中堅(jiān)力量。

2007 年，饒毅和清華大學(xué)教授施一公、美國(guó)杜克大學(xué)教授王小凡共同給國(guó)務(wù)院起草了一份建議書(shū)，建議增加中國(guó)研究生的待遇，包括吳瑞在內(nèi)的 50 多位學(xué)者在上面簽名。饒毅說(shuō)「這應(yīng)該是他生命中簽名的最后一份提議」[9]—— 吳瑞先生于 2008 年去世。

在吳瑞先生的追思會(huì)上，他實(shí)驗(yàn)室的資深研究員阿杰 · 加格（Ajay Garg）說(shuō)道：「吳教授是一位真正的遠(yuǎn)見(jiàn)卓識(shí)者，他總是鼓勵(lì)實(shí)驗(yàn)室成員去探索創(chuàng)新的想法，并始終致力于確保他的科研成果能夠造福全世界盡可能多的人?！筟10]

吳瑞先生一生與諾貝爾獎(jiǎng)擦身而過(guò) ——盡管今天的測(cè)序技術(shù)已經(jīng)跨越到了第三代，但吳瑞先生發(fā)明的「引物延伸法」作為其核心邏輯，至今仍未改變 [11]。許多諾獎(jiǎng)得主（如 James Watson）都是他的摯友，而他在康奈爾大學(xué)親手帶出的博士生杰克 · 紹斯塔克（Jack Szostak），也憑借端粒酶的發(fā)現(xiàn)斬獲了2009 年的諾貝爾獎(jiǎng)。

對(duì)于吳瑞先生未能摘取諾貝爾獎(jiǎng)的遺憾，學(xué)術(shù)界常常為之惋惜。

2016 年，時(shí)任哈佛大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院教授的頂尖計(jì)算生物學(xué)家劉小樂(lè)（Xiaole Shirley Liu），曾對(duì)此作過(guò)一段極其深刻的評(píng)價(jià)：

「作為一名 50 年代初到美國(guó)的華裔移民，吳瑞當(dāng)時(shí)所面臨的社會(huì)與種族挑戰(zhàn)無(wú)疑是極其巨大的。在缺乏社會(huì)背景和人脈支撐的情況下，他完全是憑借其卓越的科學(xué)天分與一顆純粹的向善之心，才登上了事業(yè)的頂峰。如果他是一位來(lái)自英美的白人科學(xué)家，哪怕只是身處當(dāng)今這個(gè)時(shí)代，他的科學(xué)貢獻(xiàn)理應(yīng)得到更高的贊譽(yù)與認(rèn)可。但或許，我們有時(shí)不必過(guò)分執(zhí)著于獎(jiǎng)項(xiàng)或 H 指數(shù)（H-index），而應(yīng)以一個(gè)人對(duì)科學(xué)界的整體影響，來(lái)客觀地評(píng)價(jià)他?！筟11]

「功成不必在我，功成必定有我」或許就是他最無(wú)憾的注腳。

參考資料：

[1]https://raywufund.org

[2]Wu R, Kaiser AD. Structure and base sequence in the cohesive ends of bacteriophage lambda DNA. J Mol Biol. 1968 Aug 14;35(3):523-37. doi: 10.1016/0022-2836(68)80012-9. PMID: 4299833.

[3]Wu R. Nucleotide sequence analysis of DNA. I. Partial sequence of the cohesive ends of bacteriophage lambda and 186 DNA. J Mol Biol. 1970 Aug;51(3):501-21. doi: 10.1016/0022-2836(70)90004-5. PMID: 4321727.

[4]Bahl CP, Marians KJ, Wu R, Stawinsky J, Narang SA. A general method for inserting specific DNA sequences into cloning vehicles. Gene. 1976;1(1):81-92. doi: 10.1016/0378-1119(76)90008-1. PMID: 1052323.

[5]Roychoudhury R, Jay E, Wu R. Terminal labeling and addition of homopolymer tracts to duplex DNA fragments by terminal deoxynucleotidyl transferase. Nucleic Acids Res. 1976 Jan;3(1):101-16. doi: 10.1093/nar/3.1.101. PMID: 765970; PMCID: PMC342881.

[6]Wu R. Methods in Enzymology volume 68 recombinant DNA. Methods Enzymol. 1979;68:1-555. doi: 10.1016/0076-6879(79)68001-1. PMID: 94418.

[7]https://news.sciencenet.cn/sbhtmlnews/200772694821625185420.html

[8]https://news.sciencenet.cn/htmlnews/200794113332342188572.html

[9]https://www.bio.pku.edu.cn/homes/Index/news_cont/4/3805.html

[10]https://news.cornell.edu/stories/2008/06/friends-and-family-gather-kendal-remember-ray-wu

[11]Luo L, Wu R. Ray Wu, fifth business or father of DNA sequencing? Protein Cell. 2016 Jul;7(7):467-70. doi: 10.1007/s13238-016-0271-8. Epub 2016 Jun 6. PMID: 27271424; PMCID: PMC4930775.

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