同一份單細胞數據：別人發 CNS，我只看出「細胞種類多」（附資料包和禮品）

導師咬牙給我做了單細胞測序，數據回來了，我盯著屏幕三天，一個字都憋不出來。

老板

數據分析得咋樣？文章框架寫好了嗎？

在看了在看了

老板

看出什么了？

……細胞種類還挺多的。

空氣安靜了三秒。

相信大多數科研新手都有這種體驗，單細胞測序跑完了，幾十 G 的數據整整齊齊躺在硬盤里。但下一步要講一個什么故事，哪些數據是「真金白銀」的發現？審稿人最欣賞哪一套論證邏輯？

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在看別人的「套路」之前，下面這些單細胞測序的基本功，可以先搞清楚：

一、什么是單細胞測序？

單細胞轉錄組測序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）是一種通過分析單個細胞內的轉錄組信息，以揭示細胞異質性、發育軌跡及疾病機制的關鍵技術。與傳統 Bulk RNA-seq 不同，Bulk 測序獲得的是大量細胞的平均信號，難以捕捉單個細胞之間的真實差異，限制了對細胞異質性的精確理解。而單細胞測序技術將每個細胞作為獨立樣本進行精準分析，使研究者能夠識別那些在群體平均中被掩蓋的細胞亞型和基因表達變異。

二、標準實驗流程

盡管單細胞測序的方法多種多樣，但它們都遵循類似的一般流程，主要包括四個核心步驟：

（1）單細胞分離：將組織或液體樣本制備成單細胞懸液，通過微流控技術、流式細胞術或顯微操作技術將單個細胞從混合群體中分離出來。細胞活性是決定數據質量的關鍵參數，通常要求細胞活性高于 80%（如果珍稀類樣本能達到 70% 也可以嘗試）。

（2）高通量細胞分選：取制備完成的質控合格的懸液，借助微流控芯片將細胞與攜帶有細胞標簽序列（cell barcode）的凝膠珠（bead）共同包裹至液滴內部；液滴內細胞發生裂解，釋放的 mRNA 隨即與凝膠珠上的細胞標簽序列結合，以此完成大規模單細胞分離。

（3）反轉錄與 cDNA 合成：將提取的微量 mRNA 反轉錄為 cDNA。這一環節的核心挑戰在于 mRNA 起始量低，需要通過優化反轉錄過程和反轉錄酶來穩定獲得高質量 cDNA。

（4）文庫構建與測序：通過 PCR 對 cDNA 進行擴增，將擴增后的 cDNA 構建為測序文庫，上機測序獲取單個細胞的轉錄組信息。

三、實驗操作規范要點

（1）解離條件優化：解離液的配制需兼顧消化效率與細胞活性保護。過度解離會損傷細胞膜完整性，誘導應激及凋亡相關基因的表達上調，從而引入實驗偏倚；解離不充分則導致細胞團塊殘留，堵塞芯片并降低有效細胞捕獲率。

（2）低溫操作：所有解離及細胞收集步驟建議在冰上或在 4 ℃ 條件下完成，使用的離心管、移液器吸頭、緩沖液等器材和試劑應提前預冷，以維持細胞活性。

（3）快速上機：單細胞懸液制備完成后應盡快進行單細胞捕獲及建庫，縮短樣本離體至建庫的時間窗口，最大程度降低離體培養條件對細胞轉錄組狀態的人為擾動，確保測序數據能夠真實反映樣本的原始生物學狀態。

四、數據分析核心任務

（1）數據預處理：質控（過濾低質量細胞、空液滴和雙細胞）、reads 比對和表達量化。常用的質控指標包括基因檢出數（通常過濾基因數 < 200 的細胞）和線粒體基因比例（通常過濾 > 20% 的細胞）。

（2）數據處理：標準化、批次效應校正、特征選擇（高變基因篩選）、降維（PCA、UMAP/t-SNE）與聚類分析。

（3）細胞類型注釋：將每個細胞群與參考數據庫中已知細胞類型的基因表達譜進行比對，通過相似性打分確定細胞身份。

（4）下游擴展分析：包括擬時序分析（重建細胞分化軌跡）、細胞間相互作用（CellChat）、通路富集分析、基因調控網絡推斷等。

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內容策劃：沈佳鈺

內容審核：朱卿

題圖來源：圖蟲創意