Acta Pharm Sin B (IF=14.6)｜靶向膿毒癥炎癥新靶點DNAJC9：丹參酮共價衍生物A12調控HSP70–NF-κB軸！(柳紅/唐煒...

2026年6月18日，中國科學院上海藥物研究所柳紅、唐煒、周虎、王江、周晨等團隊，聯合南京中醫藥大學、上海科技大學、安徽醫科大學等單位，在Acta Pharmaceutica Sinica B（中科院1區，IF=14.6）發表題為 “Discovery of a potent covalent inhibitor for the treatment of sepsis targeting DNAJC9: Identification of a druggable target for inflammation” 的研究論文。該文于2026年1月30日收稿，2026年6月9日修回，2026年6月18日接收。

該研究圍繞膿毒癥相關急性全身炎癥缺乏特異性藥物治療這一問題，從天然產物丹參酮 IIA 出發，引入共價彈頭進行結構改造，發現了具有較強抗炎活性的丹參酮共價衍生物 A12。研究顯示，A12 在脂多糖（LPS）誘導的巨噬細胞炎癥模型和小鼠內毒素血癥模型中，均可降低 TNF-α、IL-6、IL-12 等促炎因子水平。機制上，A12 可共價結合 DNAJC9，影響 HSP 復合體，并進一步抑制 NF-κB 相關炎癥反應。該研究提出 DNAJC9 可能是炎癥調控中的一個新型可成藥靶點，也為膿毒癥相關急性系統性炎癥干預提供了新的候選分子和機制線索。

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【摘 要】

膿毒癥是重癥監護病房（ICU）患者死亡的重要原因之一，目前臨床上仍缺乏針對膿毒癥的特異性治療藥物。本研究報道了一種含有共價彈頭的丹參酮衍生物 A12。該化合物在體外和體內均表現出較強的抗炎作用。

在脂多糖（LPS）誘導的小鼠內毒素血癥和急性全身炎癥模型中，A12 顯著降低 TNF-α、IL-6 和 IL-12 水平。不同于現有抗炎小分子，A12 具有獨特作用機制：它可共價結合 DNAJC9，從而調控熱休克蛋白（HSP）復合體，并抑制下游炎癥反應。

本研究首次將共價藥物設計原則應用于天然產物丹參酮的結構改造，并揭示了 DNAJC9 在炎癥疾病中此前未被認識的作用，為膿毒癥相關急性全身炎癥的干預提供了新的治療靶點。

01

研究背景及科學問題

膿毒癥是由宿主對感染反應失調所導致的器官功能障礙。全球每年約有 1800 萬例新發膿毒癥病例，死亡率約為 28%—40%；對于發生膿毒性休克的患者，死亡率更高，可達 50%—85%。因此，膿毒癥是全球 ICU 患者死亡的主要原因之一。

盡管膿毒癥發病率高、預后差，但目前臨床上仍缺乏特異性藥物治療。膿毒癥的發病機制尚未完全闡明，其中過度炎癥反應是推動疾病進展的重要因素，可導致多器官功能障礙和組織損傷。因此，及時、合理地調節炎癥反應，對于改善膿毒癥患者結局具有重要意義。圍繞炎癥干預開發抗膿毒癥藥物，也可能為這一危重疾病帶來新的治療思路。

丹參酮 IIA 是中藥丹參（Salvia miltiorrhiza）中含量最豐富的脂溶性成分之一，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤和抗動脈粥樣硬化等多種藥理活性，因此被認為是具有潛力的先導化合物。研究團隊長期關注天然產物的結構改造與藥理活性研究，并構建了具有多樣骨架結構的丹參酮衍生物庫。通過在 LPS 誘導的 RAW264.7 細胞中進行表型篩選，研究者發現了一系列能夠有效降低 TNF-α 和 IL-6 分泌水平的抗炎丹參酮小分子。

進一步的構效關系研究發現，引入共價彈頭后，化合物 A12 的抗炎活性顯著增強。與原本較弱的抗炎活性相比，A12 的活性提升約 100 倍，達到亞微摩爾水平。此外，在 LPS 誘導的小鼠膿毒癥樣系統性急性炎癥模型中，口服 A12 可顯著降低促炎細胞因子 TNF-α、IL-6 和 IL-12 水平，從而有效抑制炎癥反應。

天然產物藥物發現中的一個重要挑戰，是靶點探索與鑒定。鑒于 A12 在體內外均顯示出良好的抗炎活性，研究者進一步開展了靶點發現研究。通過合理設計分子探針，研究者合成了兩個陽性探針和一個陰性探針，快速識別出靶蛋白 DNAJC9，即 Dnaj 熱休克蛋白家族（HSP40）成員 C9，并闡明了 A12 獨特的抗炎機制。

研究進一步驗證了 DNAJC9 在炎癥中的作用，并提出 A12 可能通過與 DNAJC9 發生共價相互作用，影響 HSP 復合體，進而抑制下游炎癥反應。由于 DNAJC9 是參與 HSP70 調控的重要輔助伴侶蛋白，A12 與 DNAJC9 的相互作用可能影響更廣泛的 HSP70 分子伴侶系統。HSP70 分子伴侶系統在細胞蛋白穩態維持中發揮關鍵作用，并參與炎癥反應調控。

HSP40，也稱 Dnaj，是 HSP70 分子伴侶系統的重要組成部分，可通過刺激 ATP 水解調節 HSP70 蛋白功能。HSP70 在應激條件下大量產生，在維持蛋白穩態中具有核心作用。此外，細胞內 HSP70 還具有抗炎特性，可抑制 TNF-α、IL-12、IL-1 等細胞因子的產生及其促炎作用。

本研究報道了通過表型藥物篩選發現的新型抗炎小分子共價抑制劑 A12。通過共價藥物設計策略，研究者在 A12 的設計中引入共價彈頭，使丹參酮 IIA 原本有限的抗炎活性提高約 100 倍。A12 在體外 LPS 誘導炎癥模型和體內膿毒癥小鼠系統性急性炎癥模型中，均可顯著降低 TNF-α 和 IL-6 的表達，并抑制細胞因子風暴相關反應。

更重要的是，研究者通過化學探針設計合成及化學蛋白質組學方法，發現 A12 通過抑制 Dnajc9 發揮抗炎作用。基因組學和蛋白質組學研究共同提示 Dnajc9 是一個新的抗炎靶點。后續分子生物學實驗進一步闡明了其在炎癥調控中的作用，為抗炎藥物研發提供了新的方向。作者指出，這是首次報道 Dnajc9 在炎癥發生和調控中的作用，為抗炎藥物開發提供了新的靶點。

02

重要發現及亮點

引入共價彈頭顯著增強丹參酮 IIA 的抗炎活性

丹參酮 IIA 本身具有一定抗炎活性，但總體較弱，其對 IL-6 的 IC50 大于 30 μmol/L，對 TNF-α 的 IC50 大于 50 μmol/L。為了增強其抗炎活性，研究者在丹參酮 IIA 的 C1 位引入共價彈頭，設計并合成了一系列新型丹參酮 IIA 衍生物。

研究團隊利用 LPS 誘導的 RAW264.7 細胞模型，對這些化合物進行體外抗炎活性篩選。結果顯示，共價修飾衍生物 A1–A12 對 IL-6 和 TNF-α 分泌均表現出明顯抑制作用，其 IC50 分別為 0.67–4.51 μmol/L 和 0.87–13.21 μmol/L，明顯優于丹參酮 IIA。

其中，含有（E）-4-（二甲基氨基）丁-2-烯酰胺末端共價彈頭的衍生物 A12，體外抗炎活性最強：其對 IL-6 的 IC50 為 0.87 μmol/L，對 TNF-α 的 IC50 為 0.67 μmol/L。與對照藥物丹參酮 IIA 和阿普米司特相比，A12 表現出更強效的活性，也驗證了篩選平臺的可靠性。

在體內轉化潛力方面，藥代動力學分析顯示，A12 具有較好的口服生物利用度（10.7%）和系統暴露水平。為了驗證結構改造是否轉化為更好的治療效果，研究者將 A12 與母體化合物丹參酮 IIA 進行了直接比較。結果顯示，在預防性給藥和治療性給藥模式下，口服 A12 對血清細胞因子的抑制作用均顯著強于丹參酮 IIA。

組織學檢查進一步證實，A12 可明顯緩解 LPS 誘導的肺泡壁增厚和腸黏膜損傷。在 10 mg/kg 劑量下，口服 A12 的抑制效果與陽性對照地塞米松相當，而地塞米松給藥方式為 5 mg/kg 腹腔注射。這提示 A12 具有較好的體內抗炎效果。此外，A12 還可有效恢復系統穩態，表現為預防膿毒癥相關低體溫，并在 24 h 時阻斷晚期炎癥介質，如 iNos。在更具臨床相關性的盲腸結扎穿孔（CLP）模型中，A12 處理顯著延長了膿毒癥小鼠的生存時間窗。這些體內數據支持 A12 作為后續機制研究的有力先導候選物。

圖1：A12 降低模型小鼠中 TNF-α、IL-6 和 IL-12 的分泌水平。（a）化合物 A12 的設計與發現。（b）A12 在體內降低 LPS 誘導內毒素血癥小鼠模型中 TNF-α、IL-6 和 IL-12 水平的作用。A12（10、20、40 mg/kg，口服）和糖皮質激素地塞米松（DEX，5 mg/kg，腹腔注射）于小鼠腹腔注射 LPS（5 mg/kg）前 0.5 h 給藥。每組 n = 6–9 只小鼠。所有數據均以均值 ± SEM 表示。與 vehicle 組相比，***P < 0.001，**P < 0.01；與 normal 組相比，## < 0.001。

A12 重塑巨噬細胞炎癥相關基因表達

為了闡明 A12 在炎癥疾病中發揮作用的潛在機制，研究者對 RAW264.7 細胞進行了 RNA-Seq 分析。在 LPS 刺激的 RAW264.7 細胞中，與未處理細胞相比，有 253 個基因顯著上調，987 個基因下調。熱圖結果顯示，不同樣本組之間存在明顯不同的表達模式，提示組間差異顯著。

隨后的京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析顯示，多個信號通路受到擾動，其中 NF-κB 信號通路富集明顯。基因本體生物過程（GOBP）和 KEGG 分析進一步提示，A12 影響的細胞功能主要與炎癥反應有關。值得注意的是，Il-6、Il-1β 和 Nos2 等關鍵促炎基因明顯下調，且這一結果通過 qPCR 得到驗證。

此外，研究者發現，在炎癥條件下，A12 顯著抑制巨噬細胞中活性氧（ROS）的產生。A12 的類似抗炎活性也在小鼠原代骨髓來源巨噬細胞（BMDM）和人源巨噬細胞模型 PMA-THP1 中得到確認。

圖2：化合物 A12 對巨噬細胞基因表達的影響。（a）與未處理 RAW264.7 細胞相比上調和下調的基因（左圖）。火山圖展示了定量基因，紅點表示上調基因，藍點表示下調基因。右圖顯示 LPS 刺激組中顯著變化基因的層次聚類結果。（b）A12 處理后顯著變化基因的 GOBP 和 KEGG 富集分析。（c）RAW264.7 細胞中促炎基因的 qPCR 驗證。（d）RAW264.7 細胞中的活性氧水平。（e）通過 ELISA 檢測 BMDM 培養物中 TNF-α、IL-6 和 IL-12 水平。（f）在 PMA-THP1 細胞中，經 LPS 和 A12 處理后，通過 qPCR 檢測促炎基因表達。這些結果代表 3 次獨立實驗。所有數據均以均值 ± SEM 表示。與僅 LPS 處理組相比，***P < 0.001，**P < 0.01；與 blank 組相比，## < 0.001，# < 0.01。

DNAJC9 被鑒定為 A12 的直接作用靶點

A12 對巨噬細胞表現出強效抑制作用，促使研究者進一步尋找其分子靶點。為了避免影響 A12 與靶點之間的特異性結合，同時考慮合成可行性，研究者選擇在 D 環引入生物素分子，設計探針分子。基于 A12 結構，研究者設計并合成了 3 個生物素化探針 B1、B2 和 B3。

其中，B1 和 B2 保留了顯著抗炎活性，而 B3 基本無活性。因此，B1 和 B2 被作為活性探針，B3 作為陰性探針。隨后，研究者開展 pull-down 實驗，從 RAW264.7 細胞裂解液中分離 A12 的潛在蛋白靶點。簡要而言，探針被固定于鏈霉親和素包被的磁珠上，并與細胞裂解液孵育。結合蛋白隨后經胰蛋白酶消化，并采用液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）進行分析。研究者進一步通過非標記定量方法，比較四個實驗組之間的相對蛋白豐度。

與生物素處理對照組 B 相比，陽性探針 B1 和 B2 組分別顯著富集 103 個和 113 個蛋白。兩個陽性探針組之間共有 77 個重疊蛋白。這些重疊蛋白主要參與 RNA 加工和免疫反應等生物過程。為了開展蛋白豐度統計分析，研究者將對照組中未被定量的蛋白強度統一設為 100。在這些蛋白中，與對照組相比，30 個蛋白在 B1 和 B2 中均顯著富集。進一步結合陰性探針 B3 進行聯合分析后，僅有 4 個蛋白在 B1 和 B2 中顯著富集、但未在 B3 中檢測到，因此被視為潛在靶點。

在這 4 個候選蛋白中，Dnajc9 在 B1 和 B2 中均顯示最高倍數變化，且兩組比較的 P 值均小于 0.05，提示 Dnajc9 可能是 A12 抗炎作用的關鍵潛在靶點。

隨后，pull-down 分析通過考馬斯亮藍染色和免疫印跡驗證了 A12 與內源性 Dnajc9 之間的相互作用。為了嚴格排除非特異性結合，研究者還證實，僅含 linker 和 biotin 結構片段的對照分子既不能富集 DNAJC9，也不能抑制細胞因子釋放。

為了驗證 A12 與 DNAJC9 之間的直接物理結合，研究者進一步進行了藥物親和反應靶點穩定性（DARTS）實驗。該實驗基于這樣一個生物物理學原理：配體結合可在熱力學上穩定靶蛋白結構，從而降低蛋白酶可及性，并增強其對酶解降解的抵抗力。結果顯示，與 vehicle 對照相比，A12 處理明顯增強了 DNAJC9 的蛋白酶水解耐受性。需要注意的是，這一觀察結果反映的是 A12 與 DNAJC9 的直接結合和結構接合，而不是 DNAJC9 表達水平或生物活性的穩定化。

圖3：DNAJC9 被鑒定為 A12 的潛在靶點。（a）探針 B1、B2 和 B3 的化學結構。（b）靶點篩選流程概覽。（c）維恩圖展示不同實驗組之間顯著富集蛋白靶點的重疊情況。上方圖比較 B1 和 B2 相對于生物素對照組 B 的結果；下方圖進一步排除了在陰性探針 B3 組中也被檢測到的靶點。B3 組中的 964 個蛋白是未被富集的蛋白，即無可用定量數據。（d）B1 和 B2 組重疊潛在靶點的 GO 生物過程富集分析。柱旁數字表示每個生物過程中富集的基因數量。（e）散點圖顯示同時在 B1 和 B2 組中鑒定到的靶點，紅點代表在兩個比較組中 P 值均小于 0.05 的靶點，即 B1 vs B 和 B2 vs B。（f）列出 4 個候選靶點，這些靶點在 B1 和 B2 組中富集，但不在 B 組和 B3 組中富集。（g）生物素化 A12 探針 pull-down 實驗的 Western blot 分析（左）。DARTS 分析顯示，A12 可增強 Dnajc9 的蛋白酶抵抗性（右）。這些結果代表 3 次獨立實驗。

A12 與 DNAJC9 發生共價相互作用

為了研究靶蛋白 DNAJC9 與 A12 之間的相互作用，研究者首先采用熱轉移實驗檢測 A12 是否可直接作用于 DNAJC9。加入 A12 后，DNAJC9 出現負向 Tm 位移，提示 A12 可能降低 DNAJC9 的熱穩定性。這些結果說明 A12 能夠與 DNAJC9 結合。

與熱轉移實驗結果一致，DNAJC9:A12 混合物的配體觀察 CPMG 和飽和轉移差譜（STD）核磁共振結果也呈陽性。加入 DNAJC9 后，CPMG 譜顯示 A12 的核磁共振信號出現明顯線寬化和衰減，提示 A12 能與 DNAJC9 相互作用。同時，在 DNAJC9 存在條件下也檢測到 A12 的陽性 STD 信號，進一步支持 A12 與 DNAJC9 之間存在相互作用。

此外，研究者通過 LC-MS 分析比較了 DNAJC9 在有無 A12 處理條件下的質譜差異。結果顯示，DNAJC9 的蛋白分子量穩定增加 492 Da，提示 1 個 A12 分子共價結合 1 個 DNAJC9 單體。

為了確定 A12 通過其靶向半胱氨酸的丙烯酰胺共價彈頭修飾的具體殘基，研究者對 DNAJC9 的 3 個半胱氨酸殘基 C7、C150 和 C243 進行了定點突變，構建了單點突變體 C7A、C150A、C243A 以及三突變體 C7A/C150A/C243A。在 C7A 和 C150A 突變體中仍可觀察到提示 A12 修飾的分子量位移，但在 C243A 或三突變體中未觀察到該位移。該結果表明，A12 特異性共價修飾 DNAJC9 的 C243 殘基。進一步的表面等離子體共振（SPR）實驗測得 Kd 值為 12.8 μmol/L。上述結果共同說明，A12 可與靶蛋白 DNAJC9 發生共價結合。

此外，研究者還利用 ICE Bioscience 篩選平臺，對 A12 進行了 40 種激酶面板測試，以評估其脫靶活性。在 10 μmol/L 濃度下，A12 對多種激酶的抑制作用均較弱，抑制率小于 30%。這些結果支持 A12 具有較好的選擇性，并提示其可作為特異性 DNAJC9 抑制劑進一步開發。

圖4：化合物 A12 與 DNAJC9 發生共價相互作用。（a）加入 A12 后，DNAJC9 的 Tm 位移值呈劑量依賴性變化。（b）配體觀察 CPMG 和 STD 譜數據表明 A12 可直接與 DNAJC9 相互作用。CPMG 譜分別在無 DNAJC9 條件下的 A12（紅色）和加入 DNAJC9（5 μmol/L，青色）條件下的 A12 中采集。A12 的 STD 譜在存在 5 μmol/L DNAJC9 的條件下記錄。（c）A12 結合后重組 DNAJC9 的質譜分析。混合樣品中 DNAJC9:A12 = 1:40。兩個主要峰分別代表未修飾的 DNAJC9（M）及其 N 端葡萄糖酰化形式（M + 178 Da）。右側兩個小峰分別對應 M 和 M + 178 Da 與化合物 A12 形成的共價加合物。（d）SPR 實驗顯示 A12–DNAJC9 相互作用的動力學過程。這些結果代表 3 次獨立實驗。

干預 DNAJC9 可產生抗炎作用

HSP40/DNAJ 蛋白是 HSP 家族中最大的亞家族，在調控 HSP70 和 HSP90 蛋白活性方面發揮重要作用。其中，DNAJC9 的特點在于其參與整合 ATP 依賴的 HSP70 蛋白功能，并影響 HSP70 介導的炎癥反應。已有研究將 DNAJC9 基因與腫瘤發生聯系起來，并提示其可能作為乳腺癌生存相關候選生物標志物，但關于其在炎癥反應中的作用研究較少。

為了探究 DNAJC9 是否參與炎癥調控，研究者在 RAW264.7 細胞或原代巨噬細胞中建立了 siRNA 介導的 DNAJC9 敲低系統。DNAJC9 敲低后，TNF-α、IL-6 和 IL-12 等關鍵炎癥介質釋放顯著下降，提示 DNAJC9 在炎癥過程調控中具有重要作用。關鍵的是，在 DNAJC9 敲低的 BMDM 中加入 A12，與單獨 siRNA 處理組相比，并未進一步顯著降低炎癥水平。這提示 A12 的抗炎效應在很大程度上依賴于 DNAJC9。

RNA-seq 分析提示，A12 的抗炎作用涉及若干重要通路，其中包括 NF-κB 通路。進一步實驗顯示，A12 處理或 DNAJC9 敲低均可顯著抑制 IκBα 磷酸化，從而提示 NF-κB 通路，尤其是 IκBα 調控，與 DNAJC9 介導的生物學效應之間存在關聯。

由于 HSP70 通常被認為是與 DNAJC9 整合發揮作用的關鍵蛋白，研究者進一步關注 HSP70 相關的細胞內事件。結果顯示，A12 處理明顯促進 HSP70 在細胞核內聚集。已有研究支持，在熱應激和炎癥等強烈外源刺激條件下，核內 HSP70 聚集對于維持核仁穩定性具有重要作用。類似地，使用 siRNA 敲低 DNAJC9 后，也觀察到 HSP70 在細胞核內聚集增加。

與此同時，研究者在巨噬細胞中過表達 DNAJC9，發現其可促進炎癥細胞因子的轉錄水平升高，而 A12 仍可降低這些基因表達。值得注意的是，生化實驗顯示，A12 并不直接抑制 HSP70–DNAJC9 復合體的 ATPase 活性，提示其機制可能基于構象性空間位阻，而非酶活性抑制。這說明 A12 的抗炎機制與 HSP 家族存在密切關聯。

圖5：干預 DNAJC9 可產生抗炎作用。（a）通過 ELISA 檢測 RAW264.7 細胞培養物中 TNF-α 和 IL-6 水平。（b）通過 ELISA 檢測 BMDM 培養物中 TNF-α、IL-6 和 IL-12 水平。（c）代表性 Western blot 顯示，在 BMDM 中存在 A12 或 siRNA 的條件下，不同指定時間點的 IκBα 和 p-IκBα 水平。（d）BMDM 經 LPS 和 A12 處理后，用抗 HSP70 抗體進行染色。（e）Dnajc9 敲低的 BMDM 經 LPS 處理后，用抗 HSP70 抗體進行染色。綠色箭頭表示 HSP70 在細胞核內聚集。比例尺，10 μm。（f）U937 細胞轉染 pCDNA3.0_DNAJC9 質粒后，經 LPS 和 A12 處理，并通過 qPCR 檢測促炎基因表達。這些結果代表 3 次獨立實驗。所有數據均以均值 ± SEM 表示。***P < 0.001，**P < 0.01，*P < 0.05；ns 表示無顯著性；比較方式如圖中所示。

【貢獻】★★★★★

綜上，本研究發現了小分子共價丹參酮衍生物 A12，并將其鑒定為一種抗炎抑制劑。通過引入共價彈頭，A12 將丹參酮 IIA 原本較弱的抗炎活性提高約 100 倍，使其達到亞微摩爾活性水平。

鑒于目前膿毒癥臨床有效治療手段有限，A12 顯示出一定治療潛力。該化合物可口服給藥，并表現出與陽性對照地塞米松相當的療效。通過合理設計陽性和陰性探針，研究者篩選出 A12 擾動的關鍵信號通路，并以充分證據鎖定 DNAJC9 為其作用靶點。

研究發現，DNAJC9 可通過影響 HSP 復合體及其下游反應，參與炎癥發生與調控。研究者進一步推斷，A12 通過與 DNAJC9 共價結合發揮抗炎作用。整體而言，本研究驗證了 DNAJC9 是一個具有可成藥性的靶點，并確立 A12 作為具有潛力的候選藥物，為膿毒癥及相關炎癥性疾病的新治療策略設計、靶點探索和藥物開發提供了綜合思路。

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