Cell Metab (1區，IF=37.0)｜腸菌來源Kpaa“改造”線粒體：SIRT3緩解HSP60苯乙酰化損傷，關聯MASH進展！(譚敏佳/葉邦策...

2026年6月24日，華東理工大學葉邦策團隊、中國科學院上海藥物研究所譚敏佳/許駿宇/李靜雅團隊等，聯合上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院、復旦大學、同濟大學等單位，在Cell Metabolism（中科院1區，IF=37.0）在線發表題為“Gut microbiota-derived lysine phenylacetylation impairs mitochondrial function and is alleviated by SIRT3”的研究論文。該文于2024年12月29日投稿，2026年1月27日修回，2026年5月29日接收，發表于 Cell Metabolism 38卷。

該研究發現了一種由膳食苯丙氨酸經腸道菌群代謝產生的新型賴氨酸翻譯后修飾——賴氨酸苯乙酰化（Kpaa）。研究顯示，腸菌來源苯乙酸（PAA）可在宿主肝臟中轉化為苯乙酰輔酶A（PAA-CoA），進而誘導蛋白Kpaa修飾；Kpaa主要富集在線粒體相關蛋白上，并可損傷線粒體功能、干擾胰島素信號。機制上，PAA誘導HSP60發生K481位點苯乙酰化，削弱HSP60/HSP10復合體功能，觸發線粒體未折疊蛋白反應（mtUPR）應激；而SIRT3具有去苯乙酰化作用，能夠緩解這一過程。人肝組織樣本進一步顯示，肥胖合并代謝功能障礙相關脂肪性肝炎（MASH）患者肝臟中Kpaa水平升高、SIRT3表達降低，二者與疾病活動度相關。該研究為理解“膳食—腸菌代謝物—宿主翻譯后修飾—線粒體功能障礙—MASLD/MASH進展”提供了新的機制線索。

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【摘 要】

腸道菌群（gut microbiota，GM）紊亂參與多種常見代謝性疾病的發生發展。短鏈脂肪酸不僅可作為信號分子，還可作為宿主蛋白翻譯后修飾的供體。本研究報道了一種新的賴氨酸修飾類型——賴氨酸苯乙酰化（lysine phenylacetylation，Kpaa），其來源于腸道菌群中依賴苯丙氨酸的苯乙酸（phenylacetic acid，PAA）代謝通路。

在高脂飲食誘導肥胖的小鼠中，肝臟Kpaa水平顯著升高，而去酰化酶sirtuin 3（SIRT3）可降低這一修飾水平。蛋白質組范圍內的底物分析顯示，Kpaa修飾底物顯著關聯于線粒體。PAA可破壞線粒體功能，并損害胰島素信號。機制上，PAA誘導HSP60發生K481位點苯乙酰化，觸發線粒體未折疊蛋白反應（mitochondrial unfolded protein response，mtUPR），而這一過程可被SIRT3逆轉。

最后，在肥胖并伴有代謝功能障礙相關脂肪性肝炎（metabolic dysfunction-associated steatohepatitis，MASH）的成人肝臟樣本中，較低的肝臟SIRT3水平與升高的Kpaa水平呈負相關。總體而言，本研究揭示了一種來源于腸道菌群的賴氨酸酰化修飾，并闡明其在代謝功能障礙相關脂肪性肝病（metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease，MASLD）/MASH發展中的生物學意義。

01

研究背景及科學問題

腸道菌群（GM）是一個復雜且空間異質性明顯的系統，由細菌、真菌、病毒等多種微生物組成。這些微生物不僅彼此相互作用，也與宿主發生密切聯系。越來越多研究表明，腸道菌群參與肥胖和2型糖尿病的發生，而這些疾病又與代謝功能障礙相關脂肪性肝病（MASLD）密切相關。小鼠研究和糞菌移植實驗提示，腸道菌群可能在MASLD進展中具有潛在因果作用。隨后的人群研究也開始描繪MASLD中的腸道菌群改變，并發現一些較為一致的微生物組特征，可區分健康人群、MASLD患者，以及進展至代謝功能障礙相關脂肪性肝炎（MASH）的患者。MASH進一步進展可導致肝硬化和/或肝細胞癌。然而，腸道菌群與MASLD/MASH之間相互作用的生理和病理機制仍未被充分闡明。

腸道微生物組可被視為一個龐大的遺傳信息庫，其攜帶的遺傳信息量超過人類基因組。腸道微生物代謝物是宿主—菌群互作的重要介質，可進入宿主組織并參與維持生理功能。當這些代謝物濃度發生異常改變時，也可能參與代謝性疾病的發生。宿主細胞內代謝物通常與特定代謝通路相聯系，其新的生物學功能正在不斷被揭示。近期研究顯示，多種短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs），如乙酸、丁酸和丙二酸，可作為蛋白翻譯后修飾（post-translational modifications，PTMs）的供體。這些修飾既可通過酶促方式發生，也可通過非酶促方式形成，提示PTMs可能通過影響代謝網絡發揮調控作用。

這一機制并不局限于宿主來源的細胞內代謝物。微生物代謝物及其衍生物同樣可作為PTM反應供體。例如，腸道菌群來源的3-羥基丙酸（3-hydroxypropionic acid，3-HPA）可誘導宿主整合素αIIb蛋白發生半胱氨酸羧乙基化，形成新抗原并刺激CD4+介導的自身免疫反應。因此，探索來源于腸道菌群的SCFAs及其與相應PTMs之間的聯系，有助于理解生理和病理狀態下宿主—腸道菌群互作機制。

苯乙酸（phenylacetic acid，PAA，也稱phenylacetylate）是腸道菌群利用膳食苯丙氨酸產生的微生物代謝產物。既往針對肥胖非糖尿病女性肝脂肪變性患者的分子表型組學和宏基因組學研究提示，PAA可促進肝臟脂質積累并觸發脂肪變性。PAA還可進一步被宿主肝臟酶催化生成苯乙酰谷氨酰胺（phenylacetyl-glutamine，PAGln），后者可通過α2A、α2B和β2腎上腺素能受體介導細胞事件，促進與心血管疾病相關的表型。盡管這些研究提示腸菌來源PAA在代謝和心血管疾病中具有重要作用，但PAA是否還能通過誘導蛋白翻譯后修飾等額外機制發揮調控作用，仍不清楚。

在本研究中，作者鑒定出一種由腸道菌群來源苯乙酸誘導的新型賴氨酸修飾，并將其命名為賴氨酸苯乙酰化（Kpaa）。對Kpaa調控酶的研究顯示，酰基輔酶A合成酶家族成員2（acyl-CoA synthetase family member 2，ACSF2）可作為苯乙酰輔酶A合成酶，將PAA轉化為苯乙酰輔酶A（PAA-CoA），進而參與Kpaa形成；而SIRT3表現出蛋白去苯乙酰化活性。全局底物分析顯示，Kpaa與線粒體功能密切相關。高水平Kpaa修飾可破壞線粒體功能，并與MASLD進展相關。

02

重要發現及亮點

腸菌宏蛋白組提示高脂飲食小鼠苯乙酸異常積累

為探究腸道菌群與MASLD之間的生理病理機制，研究者首先在高脂飲食（high-fat diet，HFD）誘導肥胖小鼠中開展腸道菌群多組學分析。研究采集HFD喂養小鼠和普通飼料（normal chow，NC）喂養小鼠的糞便樣本進行宏基因組分析。HFD小鼠表現出更高的體重、肝臟甘油三酯（triglyceride，TG）水平以及肝切片脂滴積累。

與此同時，研究者使用納升級液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）進行宏蛋白組分析。基于物種組成的主成分分析和基于KO豐度的宏蛋白組分析均能有效區分HFD組和NC組。糞便樣本物種注釋顯示，大約80%的宏基因組基因可在門水平完成注釋。在宏蛋白組定量到的112個物種中，31個物種發生顯著變化，主要分布于厚壁菌門和擬桿菌門，提示HFD和NC小鼠的腸道菌群在組成和功能上均存在差異。其中，30個物種在宏基因組和宏蛋白組兩個層面均發生顯著改變，且變化方向相似。

進一步分析KEGG代謝通路中的差異表達蛋白后，研究者發現HFD小鼠微生物苯丙氨酸代謝通路中4種酶顯著改變，包括amiE、paaK、tryB和dat。因此，作者推測苯丙氨酸代謝通路中的代謝物可能參與MASLD進展。宏蛋白組定量顯示，PAA生物合成相關蛋白發生改變，提示PAA在腸道菌群中積累。隨后，研究者通過LC-MS檢測糞便PAA水平，發現HFD小鼠腸道PAA顯著升高。由于PAA結構上類似苯甲酸，而苯甲酸可作為賴氨酸苯甲酰化（Kbz）的前體，研究者進一步假設：PAA可能在體內轉化為高能供體PAA-CoA，從而驅動Kpaa反應。HPLC-MS/MS結果證實，小鼠肝臟中存在PAA-CoA，并且HFD小鼠肝臟中PAA-CoA顯著升高。

圖1：腸道菌群宏蛋白組學揭示HFD喂養小鼠中苯乙酸濃度異常。（A）實驗流程示意圖。（B）宏基因組和宏蛋白組中顯著變化物種的倍數變化（n = 3）。（C）基于宏蛋白組的蛋白定量結果（n = 3）。（D）相關苯乙酸代謝通路示意圖。（E）小鼠糞便樣本中的苯乙酸水平（n = 3）。（F）PAA-CoA結構，以及從小鼠肝臟樣本中體內生成的PAA-CoA代表性MS/MS譜圖（n = 5）。數據以均值 ± SEM表示。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，采用Student’s t檢驗（C、E和F）。

Kpaa被鑒定為一種新的蛋白翻譯后修飾

Kpaa修飾發生在賴氨酸殘基上，對應+118.0418 Da的質量增加，其化學式為C8H6O，代表苯乙酰基。為驗證Kpaa是否在體內存在，研究者制備了泛抗苯乙酰賴氨酸抗體。該抗體能夠識別含有苯乙酰化賴氨酸的肽庫，而不能識別未修飾賴氨酸、乙酰賴氨酸或苯甲酰賴氨酸肽庫，說明其對Kpaa肽具有較好特異性。

利用該泛抗體，研究者發現PAA可在小鼠原代肝細胞和SW480細胞中以濃度依賴方式增加Kpaa水平。小鼠接受PAA處理后，肝臟Kpaa信號增加，但賴氨酸乙酰化（Kac）、苯甲酰化（Kbz）、丙二酰化（Kmal）和琥珀酰化（Ksucc）等其他酰化修飾并未同步升高。競爭實驗進一步顯示，苯乙酰化賴氨酸肽庫，而不是未修飾肽庫，能夠競爭掉全細胞裂解物中的多個Kpaa信號條帶。

為進一步驗證Kpaa修飾，研究者進行苯乙酰化肽親和富集和MaxQuant分析，在假陽性發現率（false discovery rate，FDR）<1%、Andromeda評分≥50的條件下，共鑒定到543個蛋白上的1,927個Kpaa位點。研究者隨后合成了與體內組蛋白H2B肽序列相同的候選苯乙酰化肽PEPAKpaaSAPAPK，并通過nano-HPLC-MS/MS比較體內肽段與合成肽段。結果顯示，二者MS/MS譜圖幾乎一致；體內肽段與合成肽段混合后，在HPLC中形成單一共洗脫峰。這些結果共同證明，+118.0418 Da的質量偏移來源于一種新的翻譯后修飾——Kpaa。

研究者還使用同位素標記方法追蹤PAA是否可作為Kpaa來源。小鼠原代肝細胞經20 mM D5-苯乙酸或普通苯乙酸處理24 h后，蛋白經胰蛋白酶消化，并通過抗Kpaa免疫沉淀富集輕/重標記Kpaa肽段用于HPLC-MS分析。結果鑒定出1,472個重標記Kpaa位點，其中62%同時檢測到輕標記苯乙酰化。典型肽段DPGNEVKpaaLR和SSISVQQEKpaaETIAK的MS/MS譜圖顯示，D5標記Kpaa位點出現額外+5.0314 Da質量偏移。這進一步證明Kpaa在體內存在，并確認PAA可作為Kpaa前體代謝物。

此外，研究者在Kpaa修飾肽段的MS/MS低質量區觀察到m/z 219.1492的線性亞胺離子（LinIm），以及更強的m/z 202.1232環狀亞胺離子（CycIm），后者可能由LinIm離子失去NH3形成。這些特征離子為Kpaa特異性質譜裂解模式提供了有力證據，提高了Kpaa鑒定置信度。

圖2：Kpaa的鑒定。（A）賴氨酸苯乙酰化（Kpaa）的結構。（B）泛抗Kpaa抗體的特異性。（C）PAA刺激誘導Kpaa。PAA處理24 h后，對PAA處理的小鼠原代肝細胞全細胞裂解物進行western blot分析。（D和E）小鼠原代肝細胞（D）和SW480細胞（E）全細胞裂解物的競爭分析。（F）體內PEPAKpaaSAPAPK肽段和合成肽段的標注MS/MS譜圖。（G）HPLC/MS/MS分析中體內來源肽段、對應合成Kpaa肽段及二者混合物的重構離子色譜圖。（H）體內富集的DPGNEVKpaa（+118.0418）LR肽段和DPGNEVK D5-paa（+123.0732）LR肽段的MS/MS譜圖。

Kpaa動態變化反映腸菌—宿主代謝軸

為了觀察Kpaa在體內不同組織中的分布，研究者使用抗Kpaa抗體進行western blot分析。結果顯示，小鼠多種組織中均可檢測到蛋白Kpaa信號。其中，PAA灌胃小鼠的肝臟Kpaa水平明顯高于其他組織。PAA定量分析顯示，口服PAA可顯著增加小鼠門靜脈PAA水平，提示PAA可被腸道有效吸收并輸送至肝臟。

隨后，western blot結果顯示，與NC小鼠相比，HFD小鼠在喂養1、4、8和16周后肝臟Kpaa水平均顯著升高。與PAA灌胃實驗一致，肝臟Kpaa水平明顯高于其他組織。這提示HFD小鼠腸道菌群中PAA水平升高，可能促進肝臟PAA濃度增加。值得注意的是，PAA或其前體苯丙氨酸給藥均可在小鼠肝臟中以劑量和時間依賴方式顯著增加細胞Kpaa水平。

由于腸道菌群是宿主體內PAA產生的重要來源，研究者進一步考察細胞蛋白Kpaa水平是否與腸菌來源PAA相關。抗生素混合物處理小鼠后，糞便和血清中微生物來源PAA明顯下降，同時肝臟和結腸組織Kpaa水平降低。研究者還構建了能夠在腸道中通過PAA生物合成酶PPDC和PPFOR產生PAA的工程化大腸桿菌Nissle 1917菌株（EcNPPDC + PPFOR）。與野生型EcNWT定植相比，EcNPPDC + PPFOR定植小鼠血清PAA顯著升高，盡管糞便PAA變化不顯著；western blot顯示，工程菌定植還提高了肝臟和結腸蛋白Kpaa水平。

進一步聚焦與腸道PAA代謝密切相關的梭菌屬后，研究者發現Clostridium asparagiforme在HFD小鼠中顯著增加。由于C. asparagiforme可在體外將苯丙氨酸轉化為PAA，作者選擇該菌進行進一步驗證。無菌（germ-free，GF）小鼠肝臟和結腸Kpaa水平顯著低于特定病原體陰性（specific pathogen-free，SPF）小鼠；但C. asparagiforme定植GF小鼠后，這些組織中的Kpaa水平恢復。血清和糞便PAA也呈相似變化趨勢。因此，HFD小鼠中PAA產生菌，如C. asparagiforme，豐度升高，被認為是Kpaa水平升高的重要因素。

研究者還發現，在大腸桿菌、釀酒酵母和秀麗隱桿線蟲全蛋白組裂解物中也能檢測到Kpaa信號，提示Kpaa在不同物種中可能具有一定進化保守性。

圖3：Kpaa水平的動態變化反映NC/HFD喂養小鼠中的腸菌—宿主代謝軸。（A）小鼠外周器官提取物中Kpaa存在情況的代表性分析。C57BL/6J小鼠口服給予載體（Veh）或PAA，連續3天。（B）HFD喂養小鼠和對照小鼠喂養1、4、8和16周后，肝臟全局Kpaa水平的代表性western blot分析（n = 4）。（C和D）抗生素（Abx）混合物對體內PAA產生（C）以及全局蛋白Kpaa對腸道菌群改變敏感性（D）的影響。6周齡雄性C57BL/6J小鼠口服給予Veh和Abx，連續14天（n = 5）。（E和F）PAA產生菌定植對PAA水平（E）以及肝臟和結腸Kpaa水平（F）的影響。6周齡雄性C57BL/6J小鼠口服給予EcNWT和EcNPPDC + PPFOR，連續14天（n = 5）。（G和H）C. asp定植對PAA水平（G）以及肝臟和結腸Kpaa水平（H）的影響。8周齡雄性SPF和GF C57BL/6J小鼠口服給予PBS和C. asp，連續14天（n = 3–4）。C. asp為C. asparagiforme。數據以均值 ± SEM表示。**p < 0.01，***p < 0.001，采用Student’s t檢驗（C和E）或單因素方差分析（G）。

SIRT3去除Kpaa，ACSF2則作為PAA-CoA合成酶

基于Kpaa與Kbz在結構上的相似性，研究者推測Kpaa可能由sirtuin家族酶去除。為驗證這一點，研究者以合成肽PEPAKpaaSAPAPK為底物，篩選sirtuin 1–7。HPLC-MS/MS分析顯示，SIRT1、SIRT2和SIRT3在體外具有去苯乙酰化活性，而SIRT4–SIRT7未顯示明顯去苯乙酰化活性。

為了進一步確認SIRT1–SIRT3在細胞中的去苯乙酰化活性，研究者在肝細胞中瞬時轉染并過表達SIRT1、SIRT2和SIRT3。結果發現，SIRT3過表達可降低肝細胞全局Kpaa水平，而SIRT1/2未見明顯影響。隨后，在野生型（WT）和Sirt3?/?（KO）小鼠中驗證SIRT3體內活性。結果顯示，無論是否給予PAA，Sirt3?/?小鼠肝臟全局Kpaa水平均高于WT小鼠。進一步檢測其他SIRT3調控的PTMs后發現，與PAA處理的WT對照相比，SIRT3-KO僅增加Kpaa和Kac水平，并未增加Kbz、Kmal或Ksucc等其他修飾。HFD小鼠中Kpaa水平升高的同時，SIRT3蛋白表達下降，提示SIRT3降低可能是HFD小鼠Kpaa積累的原因之一。

另一方面，研究者發現，與PAA相比，蛋白Kpaa對PAA-CoA更加敏感，在小鼠原代肝細胞裂解物中較低濃度PAA-CoA即可誘導反應。這提示PAA需要在細胞內轉化為高能中間體PAA-CoA，才能促進Kpaa形成。通過與細菌苯乙酰輔酶A合成酶PaaK進行同源性比對，研究者發現人源ACSF2可能具有苯乙酰輔酶A合成酶活性。體外孵育和HPLC-MS/MS結果證實，ACSF2可由PAA和CoA生成PAA-CoA。細胞驗證進一步顯示，HEK293T細胞過表達ACSF2后，在PAA處理條件下Kpaa水平顯著升高；相反，在小鼠原代肝細胞中敲低ACSF2可明顯降低Kpaa水平。組織特異性表達分析顯示，ACSF2主要在肝臟高表達，這與肝臟Kpaa水平較高相吻合，也解釋了肝臟中PAA可高效轉化為活性PAA-CoA的機制。

圖4：調控賴氨酸Kpaa水平的酶篩選。（A）根據色譜峰曲線下面積（area under the curve，AUC）計算的SIRT1–SIRT7去苯乙酰化活性百分比；另見圖S4A。（B）SIRT1、SIRT2和SIRT3可催化合成Kpaa肽段的體外去苯乙酰化反應。（C）分別轉染FLAG-vector、Sirt1-FLAG、Sirt2-FLAG和Sirt3-FLAG質粒的小鼠原代肝細胞，在有或無PAA處理后，全局Kpaa水平的western blot分析；另見圖S4B。（D）Veh灌胃、SIRT3-KO和WT小鼠肝臟中全局Kpaa水平和SIRT3表達的western blot分析。（E）HFD喂養小鼠肝臟中SIRT3表達水平的western blot分析，以NC喂養組作為對照。（F）通過與底物PAA和CoA孵育檢測ACSF2合成PAA-CoA的能力。MS/MS譜圖顯示合成PAA-CoA（上）和體外生成PAA-CoA（下）的特征碎片離子。柱狀圖定量顯示，與PBS對照相比，ACSF2產生的PAA-CoA相對水平（n = 3）。（G）ACSF2敲低后，小鼠原代肝細胞中Kpaa水平。數據以均值 ± SEM表示。**p < 0.01，采用Student’s t檢驗（F）。

Kpaa底物富集于線粒體，并損害線粒體功能

為系統表征Kpaa底物，研究者從PAA給藥后的小鼠肝臟中富集Kpaa肽段，并用HPLC-MS/MS進行分析。結果共鑒定到519個Andromeda評分≥50的Kpaa位點，分布在236個苯乙酰化蛋白底物上。其中約42.8%的蛋白具有兩個或更多苯乙酰化位點。

進一步比較Kpaa與其他賴氨酸酰化修飾位點，包括Kac、Ksucc和Kmal后，研究者分析了Kpaa位點周圍氨基酸偏好。結果顯示，在修飾賴氨酸前一位（?1）顯著富集賴氨酸或精氨酸，而后一位（+1）富集甘氨酸、組氨酸或異亮氨酸。Kpaa位點最多的蛋白是氨甲酰磷酸合成酶1（CPS1），共含30個Kpaa位點。KEGG通路分析顯示，Kpaa顯著富集于多種細胞代謝過程，包括纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解、脂肪酸降解以及丙酸代謝等。GO細胞組分分析顯示，Kpaa蛋白高度富集在線粒體中，超過本研究鑒定到的賴氨酸苯乙酰化蛋白的四分之三。STRING蛋白互作網絡進一步顯示，Kpaa富集于氧化磷酸化、脂肪酸降解、谷胱甘肽代謝、支鏈氨基酸降解、核糖體以及谷氨酰胺/谷氨酸代謝等相關模塊。

為了評估Kpaa對線粒體功能的影響，研究者使用Seahorse XFe96檢測細胞呼吸。結果顯示，PAA以濃度依賴方式降低氧耗率（oxygen consumption rate，OCR）。通過TMRE和JC-1染色檢測線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）后發現，PAA處理以及PAA與棕櫚酸（PA）共處理均顯著降低MMP，提示線粒體呼吸能力下降。DCFH-DA探針檢測顯示，PAA以劑量依賴方式增加活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平；抗氧化劑N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）可抑制PAA誘導的ROS升高，說明DCF信號對PAA刺激具有特異響應。

此外，隨著Kpaa水平升高，PAA處理24 h的小鼠原代肝細胞中AKT Ser473磷酸化明顯降低，提示PAA損害胰島素信號。C12-BODIPY染色結果進一步顯示，在人源THLE2和小鼠AML12肝細胞系中，PAA處理24 h可劑量依賴性增加脂滴積累，提示PAA對肝細胞具有直接促脂肪變性作用。

圖5：從位點、蛋白和通路水平表征Kpaa底物。（A）從健康小鼠經胃內給藥（i.g.）PAA后的肝組織中獲得Kpaa肽段，并進行親和富集；另見表S2A。（B）具有多個Kpaa位點的蛋白分布。（C）用于探索Kpaa生物學功能的KEGG通路分析；另見表S2C。（D）受Kpaa調控的蛋白—蛋白互作網絡。（E）Seahorse XFe96分析小鼠原代肝細胞經不同濃度PAA處理24 h后的細胞呼吸（n = 4）。（F）TMRE分析小鼠原代肝細胞經不同濃度PAA處理，并與PA或BSA Veh共處理24 h后的MMP（n = 5–6）。（G）流式細胞術圖譜顯示細胞經PAA（1、5、10和20 mM）刺激24 h后細胞內ROS生成情況。未處理組作為對照。DCFH-DA用作細胞內ROS探針（n = 9）。數據以均值 ± SEM表示。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001，采用單因素方差分析（E–G）。

HSP60的K481苯乙酰化損害mtUPR和線粒體功能

在線粒體苯乙酰化蛋白中，60 kDa熱休克蛋白（HSP60）位列前五。研究者通過抗HSP60或抗Kpaa共免疫沉淀（co-immunoprecipitation，coIP）實驗確認，PAA處理后HSP60確實發生Kpaa修飾。另一種線粒體蛋白HSPA9也通過抗HSPA9 coIP得到驗證。重要的是，從肝臟裂解物中免疫沉淀HSP60并進行western blot分析后發現，在PAA處理肝臟中，HSP60主要富集Kpaa，而不是其他4種酰化修飾；并且SIRT3-KO小鼠中HSP60的Kpaa進一步增加。

HSP60是由HSPD1編碼的重要分子伴侶蛋白，主要定位于線粒體，并在線粒體未折疊蛋白反應（mtUPR）通路中發揮關鍵作用。HSP60對于維持線粒體呼吸鏈完整性、線粒體功能和細胞存活至關重要。為確認Kpaa對HSP60功能的影響，研究者檢測了HSP60與共伴侶蛋白HSP10之間的相互作用，因為HSP10是HSP60介導蛋白正確折疊所必需的。coIP結果顯示，PAA處理顯著破壞HSP60-HSP10相互作用。

隨后，研究者使用TPE-MI染料檢測線粒體內未折疊蛋白負荷。TPE-MI熒光僅在標記游離半胱氨酸硫醇后被激活，而這些硫醇通常埋藏于球狀蛋白核心，在蛋白展開時暴露。結果顯示，PAA處理后，無論是否與PA共處理，TPE-MI與MitoTracker共定位均增加，提示HSP60介導的mtUPR受損。SIRT3過表達細胞則能夠抵抗PAA誘導的mtUPR損傷。研究者還檢測了激活轉錄因子5（ATF5）定位變化。正常情況下，ATF5定位于線粒體；在線粒體損傷應激下，ATF5轉位至細胞核，啟動mtUPR相關蛋白表達。結果顯示，BSA/PAA或PA/PAA處理肝細胞后ATF5核定位增加，而SIRT3過表達可恢復這一變化。

為確定HSP60中負責功能損傷的關鍵Kpaa位點，研究者使用PAA-NHS對重組HSP60進行化學苯乙酰化，并分析SIRT3介導的位點特異性去苯乙酰化。實驗在HSP60上鑒定到40個Kpaa位點，其中31個位點也出現在小鼠原代肝細胞和肝組織親和富集樣本中。經SIRT3處理后，13個Kpaa位點顯著下降超過50%；其中ISKpaaGANPVEIR肽段對應的K481位點苯乙酰化水平下降約82%。

進一步使用HSP60野生型和候選位點賴氨酸突變為丙氨酸的過表達質粒后，研究者發現10 mM PAA處理24 h顯著增強HSP60-WT的Kpaa修飾，而K58A、K133A、K359A和K481A突變顯著減弱Kpaa水平，提示這些賴氨酸殘基可能是HSP60苯乙酰化的主要靶點。功能實驗顯示，PAA顯著破壞HSP60-HSP10相互作用，而K133A、K359A和K481A突變可在較大程度上恢復這一相互作用。敲低HSP60后再回補WT或Kpaa抵抗突變體，TMRE和Seahorse實驗進一步證實，PAA對線粒體功能的影響直接依賴K481位點修飾。

最后，研究者設計并合成了5種線粒體靶向細胞穿膜肽（cell-penetrating peptides，CPPs），用于競爭性抑制HSP60特定位點Kpaa。免疫熒光證實這些CPP融合肽可與HEK293細胞線粒體共定位。coIP顯示，對應K58、K133、K359和K481的CPP融合肽可顯著降低HSP60上的Kpaa修飾水平。在功能上，靶向K481修飾的肽可有效挽救PAA誘導的線粒體呼吸損傷和MMP下降。總體而言，阻斷HSP60 K481位點Kpaa足以恢復HSP60/HSP10復合體組裝并保護線粒體功能，從而建立了HSP60-Kpaa修飾與線粒體功能損害之間的因果聯系。

圖6：HSP60的Kpaa修飾損害mtUPR和線粒體功能。（A–C）在PAA處理的小鼠原代肝細胞中，對HSP60及其Kpaa修飾進行共免疫沉淀（coIP）和western blot分析。（A）使用HSP60抗體進行coIP。（B）使用Kpaa抗體進行coIP。（C）FLAG-HSP60與血凝素（hemagglutinin，HA）-HSP10的coIP。（D和E）在HepG2細胞中，經指定處理后，使用TPE-MI和MitoTracker染色（D）并進行定量分析（E），評估線粒體內細胞未折疊蛋白負荷。比例尺，10 μm。（F和G）在PAA處理的小鼠原代肝細胞（F）和轉染ATF5質粒的肝細胞（G）中，對ATF5進行核質分離分析。（H和I）在轉染HSP60-WT及其突變體的小鼠原代肝細胞中，經PAA處理后，對HSP60及其Kpaa修飾（H）以及FLAG-HSP60和HA-HSP10（I）進行coIP和western blot分析。（J）在HSP60敲低的小鼠原代肝細胞中，轉染HSP60-WT及其突變體，在有或無PAA處理條件下，通過TMRE染色分析MMP（n = 6）。（K）在PAA處理的小鼠原代肝細胞中，并與HSP60 Kpaa修飾阻斷肽共處理后，對FLAG-HSP60及其Kpaa修飾進行coIP和western blot分析。（L）在PAA處理的小鼠原代肝細胞中，與HSP60 Kpaa阻斷肽K481共處理后，使用Seahorse XFe96分析細胞呼吸（n = 3）。（M）在PAA處理的小鼠原代肝細胞中，與HSP60 Kpaa阻斷肽K359或K481共處理后，通過TMRE染色分析MMP（n = 4–5）。數據以均值 ± SEM表示。*p < 0.05，**p < 0.01，****p < 0.0001，采用單因素方差分析（J、L和M）。

Kpaa升高與SIRT3下調及MASLD/MASH病理進展相關

線粒體是肝臟正常生理和細胞功能的核心。越來越多證據提示，針對線粒體功能障礙的干預可能是MASH治療的重要方向。為研究Kpaa在MASLD/MASH進展中的作用，研究者使用酪胺信號放大（tyramide signal amplification，TSA）多重免疫組織化學（multiplex immunohistochemistry，mIHC）檢測肥胖成人肝組織樣本中Kpaa水平和SIRT3表達，這些樣本來自伴MASH（n = 15）或不伴MASH（n = 15）的肥胖個體。

mIHC結果顯示，與無MASH肥胖個體相比，MASH患者肝臟Kpaa水平更高、SIRT3蛋白水平更低。肝臟Kpaa水平與非酒精性脂肪性肝病活動度評分（NAFLD activity score，NAS）呈正相關；肝臟SIRT3表達與NAS評分及Kpaa水平均呈負相關。隨后，研究者檢測正常個體（n = 8）以及上述肥胖伴或不伴MASH個體糞便樣本中的PAA濃度。靶向代謝組學顯示，與正常個體相比，肥胖個體糞便PAA濃度更高，尤其是MASH個體。然而，肝臟Kpaa水平與糞便PAA濃度無顯著相關性，而是與肝臟SIRT3表達呈負相關。這提示觀察到的肝臟Kpaa升高可能主要歸因于SIRT3降低，強調了SIRT3在肝內調控中的關鍵作用。

為進一步研究SIRT3在MASLD進展中調控Kpaa的作用，研究者讓HFD喂養16周的小鼠經尾靜脈注射shSIRT3-AAV，實現肝臟特異性SIRT3敲低，并繼續觀察16周（n = 10）。盡管體重和器官重量未發生明顯變化，SIRT3敲低仍促進了更嚴重的病理狀態，表現為血漿丙氨酸氨基轉移酶（ALT）和天冬氨酸氨基轉移酶（AST）顯著升高，提示肝損傷加重；H&E和油紅O染色顯示脂質積累更嚴重；肝臟TG和總膽固醇（total cholesterol，TC）水平升高，證實脂質代謝功能障礙。HFD喂養和SIRT3敲低均可上調肝臟Kpaa水平。

此外，為評估長期PAA暴露效應，研究者使用含0.8% PAA的定制飼料干預C57BL/6J小鼠。結果顯示，PAA飲食增加小鼠體重，但不改變肝重/體重比；血清ALT和AST升高；肝臟TG含量增加，但TC未受影響。肝切片組織學檢查顯示，與普通飼料對照相比，PAA喂養小鼠肝臟脂滴積累更明顯。總體來看，肥胖合并MASH患者肝臟樣本中存在更高Kpaa修飾水平和更低SIRT3表達水平，二者均與NAS評分和疾病進展相關。

圖7：高水平Kpaa修飾和SIRT3下調伴隨MASH病理進展。（A–C）通過TSA檢測，在伴MASH（n = 15）或不伴MASH（n = 15）的肥胖個體肝切片中進行Kpaa和SIRT3多重免疫組織化學（mIHC）染色。比例尺，20 μm。肝臟Kpaa水平（B）和SIRT3水平（C）的定量分析。（D和E）在伴MASH（n = 15）或不伴MASH（n = 15）的肥胖個體肝切片中，分析肝臟Kpaa水平（D）和SIRT3水平（E）與NAS評分的相關性。（F）在伴MASH（n = 15）或不伴MASH（n = 15）的肥胖個體肝切片中，分析肝臟Kpaa水平與SIRT3水平的相關性。（G和H）NC飲食或HFD喂養的AAV-shScramble和AAV-shSirt3小鼠血清ALT和AST水平（n = 10）。（I）NC喂養或HFD喂養的AAV-shScramble和AAV-shSirt3小鼠肝切片H&E染色和油紅O染色。（J和K）指定小鼠組肝臟中甘油三酯（TG，J）和總膽固醇（TC，K）水平（n = 10）。（L）指定小鼠組肝臟中SIRT3表達和Kpaa水平的代表性western blot分析。數據以均值 ± SEM表示。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001，采用Student’s t檢驗（B和C）或單因素方差分析（G、H、J和K）。

【貢獻】★★★★★

本研究揭示了一種新的蛋白翻譯后修飾——賴氨酸苯乙酰化（Kpaa）。Kpaa來源于腸道菌群產生的PAA，而PAA可由膳食苯丙氨酸經腸道菌群代謝生成。研究顯示，PAA在肝臟中可經ACSF2轉化為PAA-CoA，從而促進宿主蛋白發生Kpaa修飾；SIRT3則具有去苯乙酰化活性，可降低Kpaa水平。

功能上，Kpaa高度關聯線粒體通路。PAA誘導HSP60發生Kpaa修飾，尤其是K481位點苯乙酰化，削弱HSP60/HSP10復合體組裝，擾亂HSP60介導的線粒體未折疊蛋白反應，并損害線粒體呼吸、線粒體膜電位和細胞氧化還原穩態。SIRT3可緩解這一過程。

在人肝組織樣本和小鼠模型中，MASH相關病理狀態伴隨Kpaa升高和SIRT3降低。作者認為，腸道菌群來源代謝物通過調控宿主蛋白翻譯后修飾影響線粒體穩態，可能是MASLD/MASH發生發展的重要機制之一。與此同時，研究也指出，臨床樣本量仍相對有限，腸道菌群在臨床情境中是否發揮相同作用仍需更大規模研究驗證；除HSP60之外，PAA是否還作用于其他直接底物或調控其他功能，也有待進一步探索。

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