Phytomedicine (1區(qū)-TOP)丨靶向心肌再灌注鐵死亡：毛冬青三萜皂苷IP-26抑制Hmga2-as1/Sox10/GPX4軸！(劉中秋/程...

2026年5月，廣州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院、國際中醫(yī)藥轉(zhuǎn)化研究院劉中秋團(tuán)隊(duì)、程媛媛團(tuán)隊(duì)等，在Phytomedicine（中科院1區(qū)TOP，TOP期刊，最新Impact Factor=8.3）在線發(fā)表題為“Triterpene saponin from Ilex pubescens attenuates ferroptosis in myocardial ischemia/reperfusion injury by inhibiting the lncRNA Hmga2-as1/Sox10/GPX4 axis”的研究論文。該文于2025年12月18日投稿，2026年4月10日修回，2026年5月5日接收，2026年5月6日在線發(fā)表。

心肌缺血/再灌注損傷（MI/RI）是急性心肌梗死再灌注治療后影響預(yù)后的重要病理環(huán)節(jié)，其中鐵死亡被認(rèn)為是心肌細(xì)胞死亡的重要機(jī)制之一。長鏈非編碼RNA（lncRNA）及m6A修飾近年來被發(fā)現(xiàn)可參與心血管疾病調(diào)控，但二者如何共同影響MI/RI中的鐵死亡仍不清楚。毛冬青（Ilex pubescens）作為傳統(tǒng)藥用植物，其三萜皂苷成分具有一定抗炎、抗氧化研究基礎(chǔ)，但其是否可通過lncRNA相關(guān)通路發(fā)揮心肌保護(hù)作用，也缺乏明確機(jī)制解釋。

本研究圍繞lncRNA Hmga2-as1展開，結(jié)合PCI術(shù)后心肌梗死患者臨床樣本、大鼠MI/RI模型和H9c2細(xì)胞OGD/R模型，發(fā)現(xiàn)Hmga2-as1在臨床樣本、動(dòng)物心臟組織和細(xì)胞損傷模型中均顯著升高。進(jìn)一步通過AAV9-shRNA實(shí)現(xiàn)心臟特異性敲低Hmga2-as1后，大鼠MI/RI后的心功能得到改善，心肌梗死面積縮小，血清CK-MB水平下降。機(jī)制檢測顯示，Hmga2-as1敲低主要抑制鐵死亡，而不是明顯改變凋亡或焦亡等細(xì)胞死亡標(biāo)志物，表現(xiàn)為GSH升高、MDA和脂質(zhì)ROS降低，并伴隨GPX4和xCT表達(dá)上調(diào)。

在機(jī)制層面，研究發(fā)現(xiàn)Hmga2-as1主要定位于細(xì)胞核，可與轉(zhuǎn)錄因子Sox10相互作用，并阻礙Sox10結(jié)合GPX4啟動(dòng)子中的保守“CTGTGT”基序，從而抑制GPX4轉(zhuǎn)錄并促進(jìn)鐵死亡。更進(jìn)一步，MI/RI會降低Hmga2-as1的m6A甲基化水平，使Hmga2-as1與Sox10結(jié)合增強(qiáng)，削弱Sox10-GPX4啟動(dòng)子相互作用；對Hmga2-as1的m6A位點(diǎn)進(jìn)行突變（GGACA→TCTGT）可模擬這一效應(yīng)，說明該調(diào)控過程具有m6A依賴性。

在天然產(chǎn)物篩選部分，作者從毛冬青三萜皂苷中篩選Hmga2-as1抑制劑，最終確定IP-26為代表性候選化合物。IP-26可與Hmga2-as1結(jié)合，Kd為81.5 μM，并在體內(nèi)外模型中降低Hmga2-as1表達(dá)，上調(diào)GPX4和xCT，減輕鐵死亡，改善MI/RI相關(guān)心肌損傷。值得注意的是，Hmga2-as1過表達(dá)會阻斷IP-26的心臟保護(hù)效應(yīng)，提示IP-26的作用與Hmga2-as1抑制密切相關(guān)。

該研究提出了MI/RI中一條新的m6A-Hmga2-as1-Sox10-GPX4調(diào)控軸，并將毛冬青來源三萜皂苷IP-26與lncRNA靶向調(diào)控聯(lián)系起來，為心肌缺血/再灌注損傷中鐵死亡干預(yù)提供了新的機(jī)制依據(jù)和天然產(chǎn)物候選分子。

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【摘要】

研究背景：心肌缺血/再灌注損傷（myocardial ischemia-reperfusion injury，MI/RI）仍是導(dǎo)致急性心肌梗死患者預(yù)后不良的重要因素，其中鐵死亡（ferroptosis）是介導(dǎo)心肌細(xì)胞死亡的關(guān)鍵機(jī)制之一。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）和N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）修飾是重要的表觀遺傳調(diào)控因素，但二者在MI/RI誘導(dǎo)鐵死亡過程中的相互作用仍不清楚。

研究目的：本研究旨在探討lncRNA Hmga2-as1在MI/RI中的作用及其分子機(jī)制，并篩選具有潛在治療價(jià)值的天然化合物。

研究方法：研究使用了經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）后的心肌梗死（myocardial infarction，MI）患者臨床樣本、大鼠MI/RI模型以及H9c2細(xì)胞氧糖剝奪/復(fù)氧（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R）模型。研究通過qPCR檢測Hmga2-as1表達(dá)，并采用AAV9-shRNA實(shí)現(xiàn)心臟特異性敲低。機(jī)制研究使用亞細(xì)胞分離、熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)、電泳遷移率變動(dòng)分析（EMSA）、RNA免疫沉淀（RIP）、染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）以及m6A位點(diǎn)突變等方法。研究還篩選了毛冬青來源的三萜皂苷，以尋找Hmga2-as1抑制劑。

研究結(jié)果：Hmga2-as1在PCI術(shù)后MI患者、MI/RI大鼠心臟以及OGD/R處理的H9c2細(xì)胞中均顯著上調(diào)。心臟特異性敲低Hmga2-as1可改善MI/RI大鼠心功能、縮小梗死面積，并降低血清肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）水平。Hmga2-as1敲低選擇性抑制鐵死亡，表現(xiàn)為谷胱甘肽（GSH）升高，丙二醛（MDA）和脂質(zhì)活性氧（lipid ROS）下降，同時(shí)GPX4和xCT表達(dá)上調(diào)；而凋亡、焦亡等相關(guān)標(biāo)志物未發(fā)生明顯改變。機(jī)制上，定位于細(xì)胞核的Hmga2-as1可與轉(zhuǎn)錄因子Sox10相互作用，破壞Sox10與GPX4啟動(dòng)子中保守“CTGTGT”基序的結(jié)合。MI/RI會降低Hmga2-as1的m6A甲基化水平，從而增強(qiáng)Hmga2-as1/Sox10結(jié)合，并削弱Sox10與GPX4啟動(dòng)子的相互作用。對Hmga2-as1 m6A位點(diǎn)進(jìn)行突變（GGACA→TCTGT）可再現(xiàn)上述效應(yīng)，證實(shí)該調(diào)控過程具有m6A依賴性。值得注意的是，在毛冬青三萜皂苷中，IP-26被鑒定為一種有效的Hmga2-as1抑制劑。IP-26可與Hmga2-as1以中等親和力結(jié)合（Kd=81.5 μM），上調(diào)GPX4和xCT，減輕鐵死亡，并在體內(nèi)外模型中保護(hù)心肌免受MI/RI損傷。Hmga2-as1過表達(dá)可阻斷IP-26的心臟保護(hù)作用。

研究結(jié)論：lncRNA Hmga2-as1通過抑制Sox10/GPX4轉(zhuǎn)錄軸驅(qū)動(dòng)MI/RI中的鐵死亡。天然化合物IP-26可能通過抑制Hmga2-as1發(fā)揮心臟保護(hù)作用，為MI/RI治療提供了一種新的干預(yù)思路。

01

研究背景及科學(xué)問題

心肌缺血/再灌注損傷（MI/RI）仍是急性心肌梗死臨床治療中的核心難題之一，可導(dǎo)致大量心肌細(xì)胞丟失，并促進(jìn)不良心室重構(gòu)。雖然及時(shí)再灌注能夠恢復(fù)冠狀動(dòng)脈血流，但隨之而來的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)以及包括鐵死亡在內(nèi)的程序性細(xì)胞死亡級聯(lián)反應(yīng)，仍會持續(xù)加重心肌損傷。

長鏈非編碼RNA（lncRNA）已被認(rèn)為是心臟病理生理過程的重要調(diào)節(jié)因子，但其在MI/RI中的具體功能和調(diào)控機(jī)制，特別是與N6-甲基腺苷（m6A）等表觀轉(zhuǎn)錄修飾之間的關(guān)系，仍未被充分闡明。與此同時(shí)，天然產(chǎn)物，尤其是來自傳統(tǒng)藥用植物的活性成分，是發(fā)現(xiàn)潛在心臟保護(hù)藥物的重要來源。毛冬青（Ilex pubescens）三萜皂苷長期用于傳統(tǒng)中醫(yī)藥心血管相關(guān)疾病研究，并顯示出一定抗炎和抗氧化活性。然而，其精確分子靶點(diǎn)，以及是否能夠在MI/RI過程中調(diào)控特定lncRNA通路，目前仍不清楚。

鐵死亡是一種依賴鐵、由脂質(zhì)過氧化驅(qū)動(dòng)的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡形式，已被認(rèn)為是MI/RI中心肌細(xì)胞丟失的重要機(jī)制。谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）是抑制鐵死亡的核心分子，能夠通過清除脂質(zhì)過氧化物保護(hù)心肌細(xì)胞；GPX4下調(diào)則會加重心肌損傷。此外，m6A修飾是RNA中最常見的表觀轉(zhuǎn)錄修飾，可調(diào)控RNA穩(wěn)定性、定位和蛋白結(jié)合能力，但其在lncRNA介導(dǎo)的MI/RI鐵死亡調(diào)控中的作用仍有待探索。

本研究顯示，lncRNA Hmga2-as1在MI/RI過程中被特異性上調(diào)。Hmga2-as1的m6A修飾降低會增強(qiáng)其與Sox10的相互作用，從而干擾Sox10介導(dǎo)的GPX4轉(zhuǎn)錄激活，并促進(jìn)鐵死亡。進(jìn)一步通過系統(tǒng)篩選毛冬青來源的三萜皂苷，研究鑒定出IP-26是一種有效的Hmga2-as1抑制劑，可減輕鐵死亡并改善MI/RI。本研究揭示了MI/RI中的一條新的m6A-Hmga2-as1-Sox10-GPX4調(diào)控軸，并提出一種具有潛力的植物來源心肌保護(hù)候選化合物。

02

重要發(fā)現(xiàn)及亮點(diǎn)

MI/RI后Hmga2-as1表達(dá)升高

為探討Hmga2-as1是否參與MI/RI發(fā)生過程，研究團(tuán)隊(duì)首先分析了多種模型中的Hmga2-as1表達(dá)。臨床樣本顯示，與健康個(gè)體相比，心肌梗死患者接受PCI治療后血漿Hmga2-as1水平顯著升高。類似地，在左前降支冠狀動(dòng)脈（left anterior descending，LAD）結(jié)扎建立的大鼠MI/RI模型中，再灌注階段血漿Hmga2-as1水平也明顯升高。進(jìn)一步分析MI/RI后的大鼠心臟組織以及OGD/R處理的H9c2心肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Hmga2-as1在再灌注6小時(shí)這一時(shí)間點(diǎn)顯著上調(diào)。此外，Hmga2-as1表達(dá)與CK-MB水平呈正相關(guān)。上述結(jié)果共同說明，在臨床樣本、動(dòng)物體內(nèi)模型、心臟組織和細(xì)胞模型中，MI/RI后Hmga2-as1均明顯升高。

圖1：MI/RI后Hmga2-as1表達(dá)升高。（A）PCI術(shù)后MI患者血漿中Hmga2-as1水平。健康組，n=9；PCI患者組，n=6；健康組 vs PCI患者組，**p<0.01。（B）MI/RI后大鼠血漿中Hmga2-as1水平。n=6；Sham組 vs MI/RI組，*p<0.05。（C）MI/RI后大鼠心臟組織中Hmga2-as1表達(dá)。n=3；Sham組 vs MI/RI組，**p<0.01。（D）H9c2心肌細(xì)胞在OGD/R損傷條件下Hmga2-as1表達(dá)。n=3；control組 vs OGD/R injury組，***p<0.001。（E）MI/RI后Hmga2-as1與CK-MB之間的相關(guān)性。n=12，r=0.9793。

心臟特異性敲低Hmga2-as1可減輕MI/RI

為明確Hmga2-as1在MI/RI中的因果作用，研究團(tuán)隊(duì)采用AAV9遞送shRNA，在大鼠心臟中特異性敲低Hmga2-as1。結(jié)果顯示，沉默Hmga2-as1可顯著改善MI/RI后的心功能，表現(xiàn)為射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction，EF）和短軸縮短率（fractional shortening，F(xiàn)S）升高，同時(shí)左心室收縮末期容積（LVESV）降低。血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)也明顯改善，包括代表收縮功能的+dp/dtmax升高，以及代表舒張功能的-dp/dtmax改善。

更重要的是，敲低Hmga2-as1可明顯減少心肌梗死面積，并顯著降低血清CK-MB水平。組織學(xué)分析顯示，Hmga2-as1敲低后炎癥減輕，心肌結(jié)構(gòu)得到較好保存。研究還建立了Hmga2-as1敲低和過表達(dá)H9c2細(xì)胞模型。Hmga2-as1敲低可提高H9c2細(xì)胞在OGD/R損傷下的細(xì)胞活力，而Hmga2-as1過表達(dá)則降低細(xì)胞活力。基于這些結(jié)果，作者認(rèn)為Hmga2-as1能夠促進(jìn)MI/RI損傷。

圖2：Hmga2-as1敲低在體內(nèi)和體外減輕MI/RI。（A）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)流程圖。（B）代表性超聲心動(dòng)圖。（C-E）MI/RI后Hmga2-as1敲低對LVEF、LVFS和LVESV的影響。n=6，NC-Sham組 vs NC-MI/RI組，#<0.01，##<0.001；NC-MI/RI組 vs shRNA-MI/RI組，*p<0.05，**p<0.01。（F-G）MI/R損傷后Hmga2-as1敲低對+dp/dt和-dp/dt的影響。n=5。NC-Sham組 vs NC-MI/RI組，##<0.001；NC-MI/RI組 vs shRNA-MI/RI組，*p<0.05。（H）MI/R損傷后Hmga2-as1敲低對CK-MB水平的影響。n=3。NC-Sham組 vs NC-MI/RI組，##<0.001；NC-MI/RI組 vs shRNA-MI/RI組，***p<0.001。（I）MI/RI后Hmga2-as1敲低對心肌梗死面積的影響。n=5。NC-MI/RI組 vs shRNA-MI/RI組，*p<0.05；shRNA：針對Hmga2-as1的shRNA。（J）代表性H&E染色圖像。比例尺：50 μm。（K）H9c2細(xì)胞中Hmga2-as1沉默效果。n=3，siNC組 vs 不同濃度si-Hmga2-as1組，***p<0.001。（L）OGD/R損傷條件下Hmga2-as1敲低對細(xì)胞活力的影響。n=3，NC-control組 vs NC-OGD/R injury組，#<0.01；NC-OGD/R組 vs si-Hmga2-as1-OGD/R組，*p<0.05。（M）H9c2細(xì)胞中Hmga2-as1過表達(dá)。n=3，NC組 vs Hmga2-as1 o.e.組，**p<0.01。（N）OGD/R損傷條件下Hmga2-as1過表達(dá)對細(xì)胞活力的影響。n=3，NC-control組 vs NC-OGD/R injury組，##<0.001；NC-OGD/R組 vs Hmga2-as1-OGD/R組，***p<0.001。

Hmga2-as1主要調(diào)控MI/RI中的鐵死亡

為明確Hmga2-as1影響哪一種程序性細(xì)胞死亡形式，研究團(tuán)隊(duì)分別使用針對凋亡、焦亡和鐵死亡的選擇性藥理抑制劑，即Z-VAD-FMK、CY-09和Ferrostatin-1（Fer-1）。結(jié)果顯示，在Hmga2-as1過表達(dá)的H9c2細(xì)胞中，只有Fer-1能夠?qū)GD/R誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷產(chǎn)生保護(hù)作用，這提示Hmga2-as1可能與鐵死亡密切相關(guān)。

進(jìn)一步檢測不同細(xì)胞死亡通路的標(biāo)志物后發(fā)現(xiàn)，Hmga2-as1敲低并未改變凋亡相關(guān)標(biāo)志物cleaved caspase-3、Bcl-2和Bax，焦亡相關(guān)蛋白GSDMD和NLRP3，壞死性凋亡相關(guān)蛋白p-MLKL，以及自噬相關(guān)蛋白LC3B的表達(dá)。相反，Hmga2-as1沉默顯著上調(diào)鐵死亡關(guān)鍵抑制因子GPX4。為直接驗(yàn)證Hmga2-as1是否參與鐵死亡，研究團(tuán)隊(duì)使用經(jīng)典鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin和RSL-3處理Hmga2-as1沉默細(xì)胞。結(jié)果顯示，Hmga2-as1敲低能夠有效抵消Erastin和RSL-3導(dǎo)致的GPX4下調(diào)，進(jìn)一步說明Hmga2-as1參與鐵死亡調(diào)控。

圖3：鐵死亡是Hmga2-as1影響的關(guān)鍵程序性細(xì)胞死亡形式。（A）在加入不同程序性細(xì)胞死亡抑制劑條件下，Hmga2-as1過表達(dá)對OGD/R損傷下細(xì)胞活力的影響。凋亡抑制劑為Z-VAD-FMK，焦亡抑制劑為CY-09，鐵死亡抑制劑為Ferrostatin-1（Fer-1）。n=3，control組 vs OGD/R injury組，##<0.001；OGD/R injury組 vs Fer-1組，***p<0.001。（B-E）OGD/R損傷條件下Hmga2-as1沉默對細(xì)胞凋亡的影響。n=3。（F-H）OGD/R損傷條件下Hmga2-as1沉默對焦亡的影響。n=3，siNC組 vs siNC-OGD/R組，***p<0.001。（I-K）OGD/R損傷條件下Hmga2-as1沉默對壞死性凋亡和自噬的影響。n=3，siNC組 vs siNC-OGD/R組，***p<0.001。（L-N）OGD/R損傷條件下Hmga2-as1沉默對鐵死亡的影響。n=3，siNC組 vs siNC-OGD/R組，*p<0.05；siNC-OGD/R組 vs siHmga2-as1-OGD/R組，***p<0.001。（O）Erastin誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中，Hmga2-as1沉默對GSH水平的影響。n=3，siNC組 vs siNC+Erastin組，***p<0.001；siNC+Erastin組 vs siHmga2-as1+Erastin組，***p<0.001。（P-Q）Erastin誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中，Hmga2-as1沉默對Gpx4表達(dá)的影響。n=3，siNC組 vs siNC+Erastin組，***p<0.001；siNC+Erastin組 vs siHmga2-as1+Erastin組，*p<0.05。（R）RSL-3誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中，Hmga2-as1沉默對GSH水平的影響。n=3，siNC組 vs siNC+RSL-3組，***p<0.001；siNC+RSL-3組 vs siHmga2-as1+RSL-3組，***p<0.001。（S-T）RSL-3誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中，Hmga2-as1沉默對Gpx4表達(dá)水平的影響。n=3，siNC組 vs siNC+RSL-3組，***p<0.001；siNC+RSL-3組 vs siHmga2-as1+RSL-3組，**p<0.01。

Hmga2-as1過表達(dá)增強(qiáng)OGD/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞鐵死亡

為進(jìn)一步確認(rèn)Hmga2-as1在MI/RI鐵死亡中的作用，研究團(tuán)隊(duì)系統(tǒng)檢測了Hmga2-as1操作條件下的鐵死亡標(biāo)志。體外實(shí)驗(yàn)顯示，Hmga2-as1過表達(dá)可加重鐵死亡：在OGD/R損傷后，細(xì)胞內(nèi)GSH水平顯著降低，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA升高，脂質(zhì)過氧化（lipid peroxidation，LPO）和脂質(zhì)ROS生成增加，同時(shí)鐵死亡防御蛋白xCT和GPX4下調(diào)。這說明Hmga2-as1升高會削弱細(xì)胞抗鐵死亡能力，使心肌細(xì)胞更容易受到OGD/R損傷。

圖4：Hmga2-as1過表達(dá)增強(qiáng)OGD/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中的鐵死亡。（A）OGD/R損傷條件下Hmga2-as1過表達(dá)對GSH水平的影響。n=3，NC組 vs NC-OGD/R組，***p<0.001；NC-OGD/R組 vs Hmga2-as1-OGD/R組，***p<0.001。（B）OGD/R損傷條件下Hmga2-as1過表達(dá)對MDA水平的影響。n=3，NC組 vs NC-OGD/R組，***p<0.001；NC-OGD/R組 vs Hmga2-as1-OGD/R組，**p<0.01。（C-D）OGD/R損傷條件下Hmga2-as1過表達(dá)對脂質(zhì)過氧化物（LPO）水平的影響。n=3，NC組 vs NC-OGD/R組，***p<0.001；NC-OGD/R組 vs Hmga2-as1-OGD/R組，*p<0.05；比例尺：50或25 μm。（E-F）OGD/R損傷條件下Hmga2-as1過表達(dá)對脂質(zhì)ROS水平的影響。n=3，NC組 vs NC-OGD/R組，**p<0.01；NC-OGD/R組 vs Hmga2-as1-OGD/R組，*p<0.05。（G-I）OGD/R損傷條件下Hmga2-as1過表達(dá)對xCT和Gpx4表達(dá)的影響。n=3，NC組 vs NC-OGD/R組，*p<0.05，***p<0.001；NC-OGD/R組 vs Hmga2-as1-OGD/R組，*p<0.05，**p<0.01。

Hmga2-as1沉默抑制OGD/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞鐵死亡

與過表達(dá)結(jié)果相反，Hmga2-as1沉默在OGD/R損傷后表現(xiàn)出明顯抗鐵死亡作用。具體而言，Hmga2-as1敲低可升高GSH水平，降低MDA水平，抑制LPO和脂質(zhì)ROS積累，并上調(diào)xCT和GPX4表達(dá)。這些結(jié)果說明，降低Hmga2-as1能夠增強(qiáng)心肌細(xì)胞鐵死亡防御能力。

圖5：Hmga2-as1沉默抑制OGD/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中的鐵死亡。（A）OGD/R損傷條件下Hmga2-as1沉默對GSH水平的影響。n=3，siNC組 vs siNC-OGD/R組，***p<0.001；siNC-OGD/R組 vs siHmga2-as1-OGD/R組，***p<0.001。（B）OGD/R損傷條件下Hmga2-as1沉默對MDA水平的影響。n=3，siNC組 vs siNC-OGD/R組，**p<0.01；siNC-OGD/R組 vs siHmga2-as1-OGD/R組，*p<0.05。（C-D）OGD/R損傷條件下Hmga2-as1沉默對脂質(zhì)過氧化物（LPO）水平的影響。n=3，siNC組 vs siNC-OGD/R組，**p<0.01；siNC-OGD/R組 vs siHmga2-as1-OGD/R組，*p<0.05；比例尺：25或8 μm。（E-F）OGD/R損傷條件下Hmga2-as1沉默對脂質(zhì)ROS水平的影響。n=3，siNC組 vs siNC-OGD/R組，*p<0.05；siNC-OGD/R組 vs siHmga2-as1-OGD/R組，*p<0.05。（G-I）OGD/R損傷條件下Hmga2-as1沉默對xCT和Gpx4表達(dá)的影響。n=3，siNC組 vs siNC-OGD/R組，**p<0.01，***p<0.001；siNC-OGD/R組 vs siHmga2-as1-OGD/R組，**p<0.01。

Hmga2-as1敲低在MI/RI大鼠體內(nèi)抑制鐵死亡

研究進(jìn)一步在心肌I/R動(dòng)物模型中驗(yàn)證上述鐵死亡調(diào)控作用。與對照組相比，Hmga2-as1沉默可顯著升高總谷胱甘肽（T-GSH）和GSH水平，并降低心肌MDA含量。透射電鏡觀察提供了直接形態(tài)學(xué)證據(jù)：NC-MI/RI組線粒體出現(xiàn)典型鐵死亡特征，包括線粒體嵴明顯減少和廣泛空泡化；而Hmga2-as1敲低組線粒體結(jié)構(gòu)明顯保存較好，嵴丟失和空泡化程度均低于NC-MI/RI組。此外，Hmga2-as1沉默還可提高M(jìn)I/RI后心臟組織中GPX4和xCT表達(dá)。整體來看，數(shù)據(jù)揭示了lncRNA Hmga2-as1在MI/RI中驅(qū)動(dòng)鐵死亡的新的、較為特異性的調(diào)控作用。

圖6：MI/RI后Hmga2-as1敲低抑制大鼠鐵死亡。（A-C）MI/RI條件下Hmga2-as1敲低對T-GSH、GSSH和GSH水平的影響。n=6，NC-sham組 vs NC-MI/RI組，*p<0.05；NC-MI/RI組 vs shHmga2-as1-MI/RI組，*p<0.05。（D）MI/R損傷條件下Hmga2-as1敲低對MDA水平的影響。n=6，NC-sham組 vs NC-MI/RI組，**p<0.01；NC-MI/RI組 vs shHmga2-as1-MI/RI組，**p<0.01。（E）MI/RI條件下Hmga2-as1敲低對心肌線粒體形態(tài)的影響。（F-H）MI/R損傷條件下Hmga2-as1敲低對xCT和Gpx4表達(dá)的影響。n=6，NC-sham組 vs NC-MI/RI組，***p<0.001；NC-MI/RI組 vs shHmga2-as1-MI/RI組，***p<0.001。

核定位Hmga2-as1通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控Sox10-GPX4軸影響MI/RI中的鐵死亡防御

由于lncRNA功能高度依賴其亞細(xì)胞定位，研究首先確定Hmga2-as1在細(xì)胞內(nèi)的位置。RNALocate v2.0生物信息學(xué)預(yù)測顯示，Hmga2-as1主要定位于細(xì)胞核/核仁。隨后，研究通過嚴(yán)格的亞細(xì)胞分離結(jié)合RT-qPCR，在H9c2心肌母細(xì)胞中證實(shí)超過99%的Hmga2-as1轉(zhuǎn)錄本位于細(xì)胞核內(nèi)，其中核內(nèi)比例為99.71%±0.16%，胞質(zhì)比例為0.29%±0.16%。

功能上，Hmga2-as1過表達(dá)會抑制Gpx4 mRNA，而Hmga2-as1敲低則提高Gpx4 mRNA，說明核定位Hmga2-as1參與GPX4轉(zhuǎn)錄調(diào)控。為解析這一抑制機(jī)制，研究團(tuán)隊(duì)開展了跨物種轉(zhuǎn)錄因子篩選。JASPAR CORE數(shù)據(jù)庫預(yù)測顯示，盡管大鼠和人GPX4啟動(dòng)子的共調(diào)控復(fù)雜性不同，但保守分析最終鎖定兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子：Sp1和Sox10。定量親和力分層顯示，Sox10相對得分更高，因此被認(rèn)為是主要介導(dǎo)因子。

隨后，研究驗(yàn)證Sox10是否直接結(jié)合GPX4啟動(dòng)子。通過GPX4啟動(dòng)子截短實(shí)驗(yàn)，研究定位出核心結(jié)合區(qū)域位于1.5–2.0 kb區(qū)間。進(jìn)一步對該區(qū)域三個(gè)候選基序進(jìn)行定點(diǎn)突變，發(fā)現(xiàn)破壞“GCAACATAGCG”的Mut1突變造成最明顯的功能缺陷，提示其是人GPX4中的優(yōu)勢結(jié)合位點(diǎn)。跨物種保守性分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，人和大鼠GPX4中共享兩個(gè)保守基序，即“CTGTGT”和“CCTTGT”。EMSA結(jié)果證實(shí)，在大鼠H9c2心肌細(xì)胞中，Sox10可特異性結(jié)合“CTGTGT”。H9c2細(xì)胞中的熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Sox10過表達(dá)增強(qiáng)野生型GPX4啟動(dòng)子活性，而突變“CTGTGT”后這一效應(yīng)消失。沉默SOX10則降低H9c2細(xì)胞中GPX4表達(dá)。上述結(jié)果說明，Sox10是GPX4的直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，Hmga2-as1并不影響Sox10的mRNA或蛋白表達(dá)。研究隨后考察Hmga2-as1是否在不改變Sox10表達(dá)的情況下影響Sox10-DNA相互作用。OGD/R損傷條件下，EMSA和ChIP-qPCR顯示，OGD/R本身會顯著削弱Sox10與保守“CTGTGT”基序的結(jié)合，而Hmga2-as1敲低可逆轉(zhuǎn)這一缺陷，增強(qiáng)Sox10-“CTGTGT”結(jié)合。這說明核定位Hmga2-as1會阻礙Sox10接近GPX4啟動(dòng)子，從而解釋GPX4被抑制的現(xiàn)象。也就是說，在缺血再灌注應(yīng)激中，Hmga2-as1通過“截留”Sox10，使其無法結(jié)合目標(biāo)啟動(dòng)子，最終降低GPX4轉(zhuǎn)錄并驅(qū)動(dòng)鐵死亡。

圖7：核定位Hmga2-as1通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控Sox10-GPX4軸協(xié)調(diào)MI/RI中的鐵死亡防御。（A）Hmga2-as1在細(xì)胞核和胞質(zhì)中的定位。（B）OGD/R損傷條件下Hmga2-as1沉默對Gpx4 mRNA水平的影響。n=3，siNC組 vs siNC-OGD/R組，*p<0.05；siNC-OGD/R組 vs siHmga2-as1-OGD/R組，*p<0.05。（C）OGD/R損傷條件下Hmga2-as1過表達(dá)對Gpx4 mRNA水平的影響。n=3，NC組 vs NC-OGD/R組，***p<0.001；NC-OGD/R組 vs Hmga2-as1-OGD/R組，*p<0.05。（D）通過JASPAR CORE數(shù)據(jù)庫預(yù)測Hmga2-as1和Gpx4共同轉(zhuǎn)錄因子的維恩圖。（E）啟動(dòng)子截短實(shí)驗(yàn)，用于定位HEK-293T細(xì)胞中GPX4啟動(dòng)子上的Sox10調(diào)控區(qū)域。（左）截短型GPX4啟動(dòng)子構(gòu)建體示意圖。（右）在Sox10過表達(dá)構(gòu)建體條件下報(bào)告實(shí)驗(yàn)計(jì)算得到的熒光素酶值。n=3，***p<0.001，vs Con080組；##<0.001，vs Gpx4-1組。（F）在HEK-293T細(xì)胞中使用Mut1、Mut2、Mut3和Mut all突變體進(jìn)行雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)。n=3，***p<0.001，vs Con080組；<0.05，##<0.001，vs Gpx4-4組。（G）EMSA實(shí)驗(yàn)檢測H9c2細(xì)胞中不同Gpx4 DNA位點(diǎn)與Sox10之間的相互作用。（H）H9c2細(xì)胞中Mut突變體的雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)。n=3，*p<0.05。（I）SOX10沉默對GPX4表達(dá)的影響。n=3，***p<0.001，vs siNC組。（J）Hmga2-as1沉默對Sox10 mRNA水平的影響。（K）Hmga2-as1過表達(dá)對Sox10 mRNA水平的影響。（L）Hmga2-as1沉默對Sox10蛋白水平的影響。（M）在OGD/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中，Hmga2-as1沉默后，采用EMSA實(shí)驗(yàn)檢測Sox10與Gpx4“CTGTGT”位點(diǎn)之間的相互作用。（N）Hmga2-as1沉默后各組ChIP-qPCR結(jié)果。***P<0.001，n=3。

m6A依賴性重塑Hmga2-as1/Sox10/GPX4軸并加重MI/RI中的鐵死亡

MeRIP-seq和qPCR結(jié)果顯示，無論在體外還是體內(nèi)缺血再灌注過程中，Hmga2-as1的m6A甲基化水平均下降，并且這種下降與Hmga2-as1表達(dá)升高呈負(fù)相關(guān)。隨后，研究在H9c2細(xì)胞中過表達(dá)METTL3，發(fā)現(xiàn)METTL3可降低Hmga2-as1表達(dá)，說明m6A修飾會影響Hmga2-as1表達(dá)水平。

此外，MI/RI會增強(qiáng)核內(nèi)Hmga2-as1與Sox10的結(jié)合，同時(shí)削弱Sox10與GPX4啟動(dòng)子保守“CTGTGT”基序的結(jié)合。為了驗(yàn)證因果關(guān)系，研究團(tuán)隊(duì)對Hmga2-as1的m6A基序進(jìn)行位點(diǎn)特異性突變（Mut-m6A；GGACA→TCTGT）。在METTL3過表達(dá)背景下，采用RIP-Sox10-qPCR和ChIP-Sox10-qPCR分別檢測Hmga2-as1與Sox10的相互作用，以及Sox10與GPX4啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合。結(jié)果顯示，Hmga2-as1 m6A位點(diǎn)突變會增強(qiáng)其與Sox10的結(jié)合，同時(shí)抑制Sox10結(jié)合GPX4啟動(dòng)子。這些結(jié)果提示，Hmga2-as1的m6A修飾可能通過調(diào)節(jié)Sox10與Hmga2-as1之間的相互作用，進(jìn)而影響GPX4表達(dá)。

圖8：m6A依賴性重塑Hmga2-as1/Sox10/GPX4軸并加重MI/RI中的鐵死亡。（A）MI/RI后Hmga2-as1的m6A水平。n=3，Sham組 vs MI/RI組，*p<0.05。（B）OGD/R損傷后Hmga2-as1的m6A水平。n=3，Sham組 vs OGD/R injury組，***p<0.001。（C）MI/RI模型中Hmga2-as1與m6A水平的相關(guān)性。n=6。（D）OGD/R模型中Hmga2-as1與m6A水平的相關(guān)性。n=6。（E-F）Mettl3過表達(dá)對Hmga2-as1表達(dá)的影響。n=3，NC組 vs Mettl3組，*p<0.05，***p<0.001。（G）MI/RI后心臟組織中，采用RIP-qPCR檢測Sox10與Gpx4啟動(dòng)子區(qū)域之間的相互作用。**p<0.01，***p<0.001，n=3。（H）在Mettl3過表達(dá)的H9c2細(xì)胞中，Hmga2-as1發(fā)生m6A突變后，采用RIP-qPCR檢測Sox10與Hmga2-as1之間的相互作用。***p<0.001，n=3。（I）在Mettl3過表達(dá)的H9c2細(xì)胞中，Hmga2-as1 m6A位點(diǎn)突變后，采用ChIP-qPCR檢測Sox10與Gpx4之間的相互作用。**p<0.01，n=3。

藥理性降低Hmga2-as1可減輕MI/RI中的鐵死亡

在OGD/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞模型中，研究團(tuán)隊(duì)篩選了可抑制Hmga2-as1表達(dá)的毛冬青三萜皂苷。結(jié)果顯示，9種毛冬青三萜皂苷單體均可不同程度抑制Hmga2-as1表達(dá)，其中IP-16、IP-21、IP-23、IP-24和IP-26作用較明顯。研究還檢測了這9種單體成分對GPX4表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)IP-23、IP-24、IP-25和IP-26可顯著增強(qiáng)GPX4表達(dá)。綜合這些結(jié)果，研究選擇IP-26作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的代表性藥物。微量熱泳動(dòng)（MST）實(shí)驗(yàn)顯示，IP-26與Hmga2-as1具有較高結(jié)合親和力，Kd為81.5 μM。

隨后，研究在體內(nèi)外評估IP-26對MI/RI的影響。體外實(shí)驗(yàn)顯示，IP-26在低于10 μM濃度下對H9c2細(xì)胞無明顯細(xì)胞毒性，并在1.25–10 μM范圍內(nèi)劑量依賴性保護(hù)H9c2細(xì)胞免受OGD/R損傷。IP-26可降低OGD/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中Hmga2-as1表達(dá)，并增強(qiáng)xCT和GPX4表達(dá)。

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，IP-26可劑量依賴性升高M(jìn)I/RI后EF和FS，其中30 mg/kg IP-26的效果與Fer-1陽性對照組相近。IP-26還可降低MI/RI后的CK-MB水平并縮小心肌梗死面積。H&E染色顯示，IP-26組心肌細(xì)胞排列相對整齊，炎癥細(xì)胞浸潤減少。IP-26也可降低MI/RI心臟組織中Hmga2-as1表達(dá)，并上調(diào)xCT和GPX4表達(dá)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)心肌細(xì)胞過表達(dá)Hmga2-as1后，IP-26的保護(hù)作用被阻斷，同時(shí)IP-26對心肌細(xì)胞鐵死亡的抑制作用也被削弱。因此，這些結(jié)果提示，IP-26可能通過抑制Hmga2-as1介導(dǎo)的鐵死亡來保護(hù)心肌細(xì)胞，并發(fā)揮抗MI/RI作用。

圖9：藥理性降低Hmga2-as1可減輕MI/RI中的鐵死亡。（A）IP26的化學(xué)結(jié)構(gòu)。（B-C）MST檢測IP26與Hmga2-as1之間的相互作用。（D）IP26劑量依賴性抑制Hmga2-as1表達(dá)。n=3，Control組 vs OGD/R injury組，##<0.001；OGD/R組 vs IP26-OGD/R組或Fer-1-OGD/R組，***p<0.001。（E-G）OGD/R損傷條件下IP26對xCT和Gpx4表達(dá)的影響。n=3，Control組 vs OGD/R injury組，***p<0.001；OGD/R組 vs IP26-OGD/R組或Fer-1-OGD/R組，##<0.001。（H）代表性超聲心動(dòng)圖。（I-J）MI/RI后IP26對LVEF和LVFS的影響。n=6，Sham組 vs MI/R injury組，***p<0.001；MI/RI組 vs IP26-MI/RI組或Fer-1-MI/RI組，<0.05，##<0.001。（K）MI/RI后IP26對CK-MB水平的影響。n=6，Sham組 vs MI/RI組，**p<0.01；MI/RI組 vs IP26-MI/RI組或Fer-1-MI/RI組，#<0.01。（L-M）MI/RI后IP26對心肌梗死面積的影響。n=5，MI/RI組 vs IP26-MI/RI組或Fer-1-MI/RI組，*p<0.05，**p<0.01。（N）代表性H&E染色圖像。比例尺：50 μm。（O-Q）MI/RI后IP26對xCT和Gpx4表達(dá)的影響。n=3，Sham組 vs MI/RI組，***p<0.001；MI/RI組 vs IP26-MI/RI組或Fer-1-MI/RI組，#<0.01；##<0.001。（R）Hmga2-as1過表達(dá)后，IP-26對H9c2細(xì)胞抗OGD損傷細(xì)胞活力的影響。數(shù)據(jù)以Mean±SD表示（n=3），Control組 vs OGD/R injury組，**p<0.01；OGD/R組 vs IP26-OGD/R組，#<0.01。（S-U）Hmga2-as1過表達(dá)后，OGD/R損傷條件下IP26對xCT和Gpx4表達(dá)的影響。n=3，Control組 vs OGD/R injury組，***p<0.001；OGD/R組 vs IP26-OGD/R組，##<0.001。

【Citation】:Tian X, Lou Y, Yao X, Yang Y, Gao X, Liu Z, Cheng Y. Triterpene saponin from Ilex pubescens attenuates ferroptosis in myocardial ischemia/reperfusion injury by inhibiting the lncRNA Hmga2-as1/Sox10/GPX4 axis.Phytomedicine.2026;156:158274.

【貢獻(xiàn)】★★★★★

Hmga2-as1的m6A修飾降低會通過截留Sox10、抑制GPX4表達(dá)并促進(jìn)鐵死亡，從而加重MI/RI。本研究揭示了一種新的m6A依賴性機(jī)制，將lncRNA Hmga2-as1與MI/RI中的鐵死亡聯(lián)系起來，并為相關(guān)干預(yù)提供了新的思路。毛冬青來源的三萜皂苷IP-26可通過抑制lncRNA Hmga2-as1/Sox10/GPX4軸，減輕心肌缺血/再灌注損傷中的鐵死亡。

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