基于NGS的腫瘤全景變異檢測探針設計專家共識（2026版）

中國抗癌協會腫瘤病理專業委員會. 基于NGS的腫瘤全景變異檢測探針設計專家共識（2026版）[J]. 中華腫瘤雜志, 2026, 48(4): 491-501. DOI: 10.3760/cma.j.cn112152-20250722-00356.

摘 要

隨著腫瘤精準醫學發展，基于二代測序（NGS）的腫瘤全景變異（CGP）檢測成為臨床診療的主流檢測手段。然而，作為NGS檢測的起始環節，探針設計尚未建立技術標準或評估體系。中國醫學科學院北京協和醫學院腫瘤醫院聯合中國抗癌協會病理專委會、中國食品藥品檢定研究院等權威機構組織臨床專家、病理專家及第三方醫學檢驗機構深入研討，參考國內外文獻，結合中國臨床實踐，針對CGP檢測產品的目標基因及目標區域選擇、基因組合方式、探針性能評估、探針變更等多個關鍵環節達成6條綱領性的技術共識，系統提出探針池設計全流程技術規范。共識通過探針設計標準化、多層級性能驗證體系的構建及探針動態變更管理，填補了腫瘤NGS探針設計技術標準空白，為國家藥品監督管理局對腫瘤NGS實驗室自建方法的合規性審查提供科學依據，推動腫瘤基因檢測從“臨床可用”向“臨床可信”轉變。

【關鍵詞】惡性腫瘤；二代測序；腫瘤全景變異檢測；目標基因選擇；目標區域選擇；基因組合方式；探針性能評估；探針變更管理

在精準醫療快速發展的時代背景下，二代測序（next generation sequencing， NGS）技術憑借其高通量特性和發現未知基因變異能力的獨特優勢，已成為臨床實踐中腫瘤基因檢測的主流技術和首選方法。全景變異（comprehensive genomic profiling， CGP）檢測是一種基于NGS技術的基因檢測方法，可同時評估數百個以上基因的多種類型變異，包括單核苷酸變異（single nucleotide variant， SNV）、插入/缺失（insertion-deletion， InDel）、拷貝數變異（copy number variations， CNV）和結構變異（structure variation， SV）等，還可以檢測腫瘤突變負荷（tumor mutation burden， TMB）、微衛星不穩定性（microsatellite instability， MSI）和同源重組缺陷（homologous recombination deficiency， HRD）等復雜的基因組標志物，從而在單次檢測中提供全面的腫瘤相關的基因組信息，最大限度地提高檢測的全面性和準確度。目前市場上涵蓋全面基因組標志物的腫瘤CGP檢測產品均屬于實驗室自建方法（laboratory developed tests， LDT），尚缺乏統一的監督管理規范。

近年來，我國針對腫瘤NGS基因檢測產品的全流程質量管理規范，已形成多維度指導體系。中國臨床腫瘤學會（Chinese Society of Clinical Oncology， CSCO）、北京市臨床檢驗中心、中國抗癌協會腫瘤病理專業委員會等權威機構，聯合臨床專家、臨床病理等多領域專家，相繼制定了《二代測序技術在腫瘤精準醫學診斷中的應用專家共識》、《高通量測序技術臨床規范化應用北京專家共識（第一版腫瘤部分）》、《實驗室自建腫瘤全景變異檢測性能確認中國專家共識（2024版）》、《腫瘤二代測序臨床報告解讀共識》等多項重要指導文件。這些共識系統規范了NGS檢測的樣本處理、文庫構建、生物信息分析及臨床報告解讀等關鍵環節。然而值得注意的是，作為NGS檢測產品的初始核心環節—探針設計，目前仍缺乏統一的行業標準、臨床指南或專家共識。探針設計質量直接影響探針的靶向捕獲效率和均一性，從而影響檢測產品的檢測靈敏度與特異性。因此，建立系統的探針設計、驗證及變更標準將成為保障NGS檢測產品精準性和臨床有效性的關鍵基石。

基于腫瘤NGS基因檢測產品研發規范與臨床應用的迫切需求，國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫學研究中心/中國醫學科學院北京協和醫學院腫瘤醫院聯合中國抗癌協會病理專委會、中國食品藥品檢定研究院，組織多學科臨床專家組通過系統論證與審慎研判，針對NGS檢測技術關鍵環節中的探針設計達成綱領性技術共識。該共識不僅為各級臨床病理中心及第三方醫學檢驗機構建立了基于NGS技術的腫瘤基因檢測探針設計標準化框架，更通過建立統一的技術標準，強化實驗室間檢測結果的可比性，進而為臨床精準診療決策提供可驗證的技術支持體系，同時為個性化醫療場景下的基因檢測產品遴選提供循證依據。

本共識采用的推薦級別見表1。

一

目標基因和區域的選擇

1.目標基因的選擇：檢測產品的臨床預期用途、基因的臨床價值以及證據等級是選擇目標基因的主要依據。檢測產品的預期用途及基因的臨床價值主要包括為臨床醫師及患者提供遺傳篩查、輔助診斷、藥物療效預測、預后評估以及復發監測等方面的指導價值。目前，有多個針對腫瘤生物標志物臨床意義解讀的循證醫學分級系統，包括2017年美國分子病理學協會（Association for Molecular Pathology， AMP）/美國臨床腫瘤學會（American Society of Clinical Oncology， ASCO）/美國病理學家協會（College of American Pathologists， CAP）聯合制定的體細胞變異解讀指南，2020年由歐洲腫瘤內科學會（European Society of Medical Oncology， ESMO）發布的ESMO分子靶點臨床可操作性量表（ESMO Scale for Clinical Actionability of molecular Targets， ESCAT），紀念斯隆?凱特琳癌癥中心的精準醫療腫瘤數據庫（Precision Oncology Knowledge Base， OncoKB）證據等級規則，以及美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration， FDA）、器械和放射衛生中心依據臨床證據的可靠程度進行的基因突變等級分類。不同的解讀指南變異等級劃分有著細微差別，總體可以把基因變異劃分為具有明確臨床意義、具有潛在臨床意義、臨床意義未明、無害或可能無害變異四個大類（表2）。此外，2022年臨床基因組資源中心、癌癥基因組聯盟和癌癥變異解讀聯盟聯合發布了體細胞變異致癌性分類標準，能夠更好地對一些變異的分類提供標準，該標準旨在解決以往體細胞變異分類中存在的不一致問題，為惡性腫瘤相關體細胞變異的致癌性提供了一套系統、全面的分類方法。

本專家共識首先針對基因的證據等級分類進行討論并達成一致意見，即建立中國專家共識的基因及變異分級標準。綜合上述腫瘤生物標志物臨床意義解讀證據等級體系，2017年AMP/ASCO/CAP聯合制定的體細胞變異解讀指南等級體系是目前國內影響范圍最廣的基因變異分級體系，也是國內各類腫瘤NGS檢測最廣泛采用的報告解讀證據等級體系。因此，本共識考慮了檢測產品在我國推廣應用的可行性，在2017年AMP/ASCO/CAP指南的基礎上對目標變異的分級進行了本地化（圖1），其中Ⅰ類變異的A類證據除了FDA批準還包括國家藥品監督管理局（National Medical Products Administration， NMPA）批準療法，專業指南主要包括CSCO以及美國國立綜合癌癥網絡（National Comprehensive Cancer Network， NCCN）、ASCO、ESMO等權威機構推薦的臨床指南。同樣，對于Ⅱ類變異的C級證據也增加了國內NMPA的批準療法。此外，該共識首次提出了基因的分類等級，參考基因變異等級將基因分成3類：包括具有明確臨床意義的Ⅰ類基因（即包含Ⅰ類變異的基因）、具有潛在臨床意義的Ⅱ類基因（即包含Ⅱ類變異且不包含Ⅰ類變異的基因）、臨床意義未明的Ⅲ類基因（即不包含Ⅰ、Ⅱ類變異的基因）。

在構建腫瘤CGP檢測產品目標基因的篩選框架時，除了具有臨床意義的Ⅰ類和Ⅱ類基因之外，還需要系統整合臨床意義未明的Ⅲ類基因中具有探索價值的基因，以滿足腫瘤精準診療對基因組全景分析的技術要求。這類基因的策略性納入具備雙重臨床價值：其一，可有效規避因基因臨床證據級別動態調整導致的探針組合頻繁更新；當特定基因的臨床證據等級升級時，僅需補充驗證相應變異位點的技術性能，即可實現檢測報告范圍的追蹤式更新與快速迭代。其二，可使每位腫瘤患者獲得更深層次的變異譜解析，為開展“腫瘤知情”的分子殘留病灶（molecular residual disease， MRD）檢測提供更多可以追蹤的體細胞突變，從而顯著提升后續MRD動態監測的靈敏度和特異度。由此可見，科學納入Ⅲ類基因實為維持CGP檢測產品全生命周期競爭力的戰略性決策。

共識意見 1

建立了本地化的基因變異分級標準，并首次提出了基因證據等級分類體系，根據基因突變的臨床意義將基因分成3類，包括具有明確臨床意義的Ⅰ類基因、具有潛在臨床意義的Ⅱ類基因，以及臨床意義未明的Ⅲ類基因。在構建腫瘤CGP檢測產品目標基因的篩選框架時，除了具有臨床意義的Ⅰ類和Ⅱ類基因之外，還需根據檢測產品的預期用途整合部分具有臨床探索價值的臨床意義未明的Ⅲ類基因，以滿足腫瘤精準診療對基因組全景分析的技術要求。檢測Ⅲ類基因是維持CGP檢測產品全生命周期競爭力的戰略性決策（推薦級別：2A類）。

2.目標區域的選擇：目標基因的變異類型、基因組指標以及生信質控指標的性能要求是目標區域選擇的主要依據。

在檢測基因突變時，目標區域的選擇需根據基因變異類型及變異特征進行差異化設計。原癌基因通常存在明確的熱點突變區域，且變異多富集于關鍵功能結構域；相比之下，抑癌基因的突變呈散發性分布。基于這類基因的突變特征，針對SNV、InDel的檢測方案，推薦采取不同的設計策略：對原癌基因鎖定功能結構域及臨床證實的熱點突變區域，而對抑癌基因則建議覆蓋完整編碼區序列。當檢測CNV變異時，推薦目標區域為基因的全編碼區，或者至少滿足生物信息學算法所要求的最小的外顯子覆蓋要求。值得注意的是，特定單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism， SNP）位點的策略性納入可顯著增強CNV分析的準確度，建議在探針設計時結合生物信息算法需求添加參考SNP位點，以此提升CNV檢測的性能。在融合基因檢測中，探針設計的核心靶區應聚焦于已知的斷點富集區域，包括內含子、非翻譯區域及少數外顯子區域。鑒于斷點區域多位于復雜的非編碼區［通常伴隨高重復序列和異常的鳥嘌呤（guanine， G）和胞嘧啶（cytosine， C）含量，簡稱GC含量］，建議采取適應性設計策略：優先鎖定高頻融合伴侶基因的保守斷點區域，通過規避高重復性/高同源性的基因組區間，有效平衡覆蓋廣度和檢測性能的辯證關系。

在基因組標志物檢測的探針設計策略中，目標區域需依據不同標志物的生物信息學算法進行精準化設計，即在滿足檢測性能的前提下進行探針覆蓋區域的精細化調控，既可優化檢測系統的效能，又能有效控制探針組合的規模，實現成本效益的最大化。檢測TMB指標時，要求探針覆蓋的編碼區在1 Mb以上，通常在具有臨床價值的基因的基礎上增加相應惡性腫瘤亞型的高頻變異區域來實現。MSI檢測目前尚未形成標準化的技術規范，建議采取動態優化策略，基于算法特性篩選最佳的微衛星位點組合。研究顯示，MSI檢測的靈敏度與微衛星位點的數量存在非線性關聯，增加微衛星位點可能導致信號噪聲比下降，檢測數據顯示，單核苷酸位點在效能評估中表現出更優的靈敏度。《Bethesda分子診斷指南》明確指出，傳統的美國國家癌癥研究所雙核苷酸位點檢測系統需額外補充單核苷酸位點以提升靈敏度精準區分低度MSI亞型。此外，多核苷酸序列本身的多態性會導致檢測方法高度依賴正常配對樣本，而單核苷酸位點可不依賴正常配對樣本，加之穩定性高、靈敏度高的特點，常被NGS檢測產品選為計算MSI的核心檢測靶區。HRD檢測時，可參考《同源重組修復缺陷臨床檢測與應用專家共識（2021版）》的技術框架進行探針設計，SNP位點的篩選需嚴格遵循兩大準則：一是空間分布均勻，確保基因組全域覆蓋，消除檢測盲區；二是雜合位點密度優先，即優先選擇中國人群雜合頻率在0.4～0.6之間的SNP位點。同時建立三級排除機制，即排除顯著偏離哈迪-溫伯格平衡的位點、探針捕獲穩定性欠佳的位點以及存在技術干擾風險的高同源/高重復區域的位點。

探針池的目標區域設計需系統性整合“檢測功能模塊”和“質量控制模塊”。質量控制區域的戰略布局雖不直接參與變異分析，卻是保障檢測系統可靠性的基石。探針設計中需包含4個關鍵質量控制維度的專屬功能區域：腫瘤純度推算、樣本配對分析、污染率評估以及性別判斷系統。在技術實現層面，前3項質量控制指標的計算可通過SNP基因分型實現，SNP位點及數目的確定需要滿足生物信息學算法對雜合率和群體頻率閾值的要求。性別鑒定模塊應采用染色體特異性覆蓋策略，通過在X/Y染色體異源區域設計性別特異性探針，建立高效的雙盲檢測體系（準確度應達99%以上）。當臨床樣本出現性別信息異常時，該模塊可實現污染樣本中供體性別判定及樣本混淆風險預警。

完整的NGS探針池應系統構建“功能檢測層”和“質量保障層”雙層架構。“功能檢測層”包括基因變異（包括SNV、InDel、CNV及SV）檢測和/或基因組指標（如TMB、MSI、HRD等）檢測的關鍵靶區，“質量保障層”是集成上述四位一體的質控模塊。每個模塊涉及的目標區域需要根據CGP檢測產品的預期用途進行個性化設計。該設計范式通過檢測功能與質控效能的動態耦合，既滿足臨床決策的核心需求，又實現了NGS檢測全流程可追溯、結果可驗證的精準醫學技術標準，為NGS檢測的技術審評提供了標準化框架。

共識意見 2

腫瘤CGP檢測產品探針池的目標區域設計需系統性整合“檢測功能模塊”和“質量控制模塊”。“檢測功能模塊”應包含基因變異（包括SNV、InDel、CNV及SV）檢測和/或基因組指標（如TMB、MSI、HRD等）檢測的關鍵靶區，“質量控制模塊”應包含腫瘤純度推算、樣本配對分析、污染率評估以及性別判斷計算所必需的基因組區域。每個模塊涉及的目標區域需要根據CGP檢測產品的預期用途進行個性化設計（推薦級別：2A類）。

3.基因組合的方式：經過多學科專家組的系統性論證與多維度驗證，形成了《常見實體瘤基因檢測推薦列表》，見附表1、2（掃描本文首頁二維碼查看）。對于Ⅰ類和Ⅱ類基因的推薦，不僅詳細列出了基因在不同惡性腫瘤患者中的臨床證據等級，還明確了推薦檢測的目標區間（附表1）。其中Ⅲ類基因推薦依據主要包括腫瘤信號通路相關基因及腫瘤人群高頻突變基因（附表2）。基于腫瘤臨床及變異公共數據庫（COSMIC、TCGA等）融合中國人群自建數據庫（采用全基因組測序/全外顯子測序技術進行腫瘤組織與正常對照樣本配對分析的數據）的基因變異人群發生頻率進行基因篩選。通過系統分析基因變異在人群中的發生頻率，并采用復發指數（recurrence index， RI）等量化指標進行精準篩選。RI綜合考慮目標區域的突變患者數量（Np）、區域長度（L）及隊列患者總數（N），計算公式為RI=（Np/N）×（1 000/L），以此實現不同長度外顯子間的均一化評估。具體篩選標準需要綜合考慮檢測產品的性能要求、探針池的大小、檢測產品可容忍的數據量規格等因素。本次推薦基因選擇RI≥20且覆蓋至少≥5例突變患者的高復發區域，可以確保基因不僅具備較高人群突變頻率，同時對TMB具有顯著貢獻。該篩選策略可以保障優先選擇對腫瘤突變貢獻度高的基因，有效控制探針池大小，在MRD監測場景中顯著提升個體患者可追蹤突變的數量，增強檢測的臨床靈敏度和可靠性。該推薦列表的制定充分考慮了腫瘤患者的臨床獲益，整合了臨床腫瘤學家對腫瘤精準診療的前瞻性的認知，同時充分考慮了相應檢測產品在我國推廣應用的可行性。

該實體瘤基因檢測推薦列表可以成為指導腫瘤CGP檢測產品探針池設計的有效工具。CGP檢測產品可以根據檢測產品的適用人群分為單癌、多癌以及泛癌基因檢測產品，其探針池的設計過程也就是不同目標基因組合的過程。如何進行基因組合是本次專家共識討論的焦點，針對該問題，專家建議可根據不同場景進行基因組合設計：（1）按照臨床預期用途進行基因組合，如遺傳篩查、輔助診斷、藥物療效預測、預后評估、復發監測等單一場景，或者輔助診斷+藥物療效預測、藥物療效預測+復發監測等復合場景，該情景既適用于單癌基因檢測產品，也適用于多癌或者泛癌基因檢測產品的設計。（2）按照腫瘤來源的不同系統進行基因組合設計，如針對婦科腫瘤、消化系統腫瘤、中樞神經系統腫瘤等設計腫瘤多癌基因檢測產品。（3）通過某個/某些基因組指標關聯不同的治療方式或者不同的惡性腫瘤類型。如：免疫治療相關標志物檢測、PAPR抑制劑相關基因標志物檢測，該類型的檢測產品可以精準地篩選出某種特定治療方式的適用人群。通常情況下，基于后2種場景設計的多癌或泛癌CGP檢測產品更匹配臨床真實使用場景，可以有效減少開發多個單癌檢測產品造成的研發資源浪費，實現探針池設計研發和臨床應用的雙重經濟學效益。

共識意見 3

本次共識形成了常見實體瘤患者基因檢測推薦列表（掃描本文首頁二維碼查看），在CGP檢測產品設計時推薦根據臨床預期用途、腫瘤來源的不同系統或特定的治療方式關聯不同的惡性腫瘤人群進行目標基因組合，可進行多癌或泛癌基因檢測，從而實現探針池設計研發和臨床應用的雙重經濟學效益（推薦級別：1類）。

二

探針/探針池的設計及性能評估

目標基因和目標區間確定后進行探針設計、篩選及合成，并使用細胞系標準品及臨床樣本對單條探針以及探針池的靶向捕獲能力及變異檢測性能進行評估，以確保探針池捕獲區間的實際檢測性能滿足臨床檢測要求。

（一）探針的設計和篩選

探針的設計和篩選是根據目標捕獲區間的參考基因組序列，尋找出能富集目標區域的DNA參考序列的過程。目標區域DNA參考序列除了明確的參考基因組DNA序列外，還應該考慮因人群遺傳多樣性、特定的基因突變等因素導致的與參考序列存在差異的特定DNA序列。探針設計的基本原則是在確保每條探針都能對目標區域實現高覆蓋度的同時，最大程度地提高探針池的靈敏度、特異度和均一性。

探針的GC含量、熔解溫度Tm、交叉雜交及探針長度是影響探針池性能的主要因素。GC含量是影響探針池雜交效果的關鍵因素，過高或過低的GC含量都可能導致雜交效果不佳，通常情況下，GC含量在50%～60%時，探針池的捕獲效率和均一性最優。探針設計時可以根據探針池的GC含量來調整不同探針的濃度或覆蓋密度，從而提升目標區間的捕獲能力，確保探針池檢測的靈敏度。探針的熔解溫度Tm與GC含量、探針長度及雜交反應條件等因素有關，可結合濕實驗反應條件的調整來控制探針的Tm值在一個合適的范圍內，以保證探針捕獲性能。交叉雜交是影響探針池特異性的關鍵因素之一，特別是在低復雜度基因組區域，同源序列探針的存在可能會引發非特異性捕獲反應，從而導致檢測失敗。因此，建議對基因組中與探針序列具有高度相似性（如50 mer探針建議相似性閾值設定為＞75%～80%）的目標區間進行全面評估，并剔除相似區域過多的探針，以有效降低探針組合整體的交叉雜交比例。探針長度也是影響探針特異性的重要因素，在確定探針長度時，需綜合考慮樣本類型、插入片段平均長度、測序讀取模式等因素。通常而言，探針長度越長，其與靶序列的雜交穩定性越高，但過長的探針可能導致合成困難、成本增加、受DNA降解影響更大。在實際應用中，常規探針長度在60～120 nt之間，旨在確保雜交穩定性的前提下，兼顧合成的可行性和成本的經濟性。

由于目標區域的復雜程度不同，在探針設計階段，可通過調整單條探針的起始位置以及運用多重疊瓦等設計策略，來實現探針池檢測性能的最優化。建議遵循目標區間中心對稱的原則進行滑窗操作，在可移動范圍內尋找最佳的探針組合。由于雜交捕獲法中的模板是隨機打斷的片段化基因組DNA或是血漿中的游離DNA，DNA模板片段與固定序列探針的雜交結合效率會隨二者重疊長度的不同而變化。為了提高在核心腫瘤熱點區域的覆蓋度與均一性，推薦采用疊瓦式探針設計策略，確保檢測的靈敏度。比如，針對復雜的InDel變異，可通過野生型+突變型的探針設計策略，即在變異位點的兩側分別設計1條野生型探針，在變異位點內部設計1條突變型探針，這種探針布局可提升模板的轉化率，進而提升探針對變異檢測的準確度。

共識意見 4

探針設計時除了參考基因組外，還需要充分考慮人群遺傳多樣性、特定的基因突變等原因造成的目標區域序列多樣性（推薦級別：2B類）。探針設計和篩選過程，需要充分考慮探針的GC含量、熔解溫度Tm、探針位置、探針長度等因素，在保證探針靈敏度和特異度的前提下，篩選出能富集目標區域的最優探針組合（推薦級別：2A類）。

（二）探針池的質量控制及性能評估

探針出廠前，探針合成供應商會對其進行嚴格的質檢、定量和分裝。探針質檢方式包括單條探針質檢和/或混合探針池NGS質檢。由于干粉狀態的探針相比母液或工作液更穩定，可結合探針的使用量和使用時間設計分裝方案并進行抽干保存，確保探針池以干粉狀態進行運輸和長期保存。探針池干粉、濃儲液、配置后的工作液，可儲存至-80 ℃±5 ℃條件下；實驗開展過程中使用的工作液，可儲存于-20 ℃±5 ℃條件下，并在使用過程中保持低溫、減少凍融次數，以避免降解和斷裂。

盡管探針/探針池在設計、篩選及合成時均進行了嚴格的質量控制，但是否滿足NGS檢測產品的臨床檢測要求還需要使用標準品及臨床樣本進行性能評估，評估的內容至少包括測序數據質控、單條探針/單個位點的檢測性能以及產品維度的基因變異和/或基因組指標的檢測能力。其中臨床樣本需要包含檢測產品要求的全部樣本類型，組織樣本和體液樣本由于檢測產品流程、檢測產品參數和性能要求的差異，需要分別進行評估。

1.測序數據質控評估：為了評估探針池的測序數據質控表現，推薦使用細胞系標準品或高質量的臨床樣本（如白細胞gDNA樣本）進行NGS全流程檢測，評估的參數包括捕獲效率、均一性、GC含量/偏好、基因組比對率等（表3），其中捕獲效率和均一性是影響探針池檢測性能的關鍵參數，直接影響檢測產品達到預期性能所需要的數據量。

捕獲效率又稱中靶率，是指比對到目標區域的堿基數占總測序堿基數的百分比，反映了探針池能夠有效地捕獲到目標區域的能力，捕獲效率越高代表測序數據的利用率越高。通常情況下，探針池的捕獲效率與目標區域和探針設計方式有關，如果目標區間包含較多的高GC、重復序列或者高拷貝序列，理論上會更容易發生非特異性捕獲，通過調整單條探針的設計方法可以減少非特異序列的結合，提高探針池的捕獲效率。除了探針本身的影響因素之外，測序樣本的質量、DNA的片段大小以及濕實驗檢測流程等也是影響探針捕獲效率的重要因素。《GB/T 37872—2019目標基因區域捕獲質量評價通則》中要求，對于目標基因區域＞10 Mb的探針池捕獲特異性應不低于45%，≤10 Mb的目標基因區域探針池捕獲特異性應不低于12%。

探針池的覆蓋均一性是指測序過程中目標區域之間序列覆蓋的均勻性，是測序讀段（reads）在目標區域的測序深度均勻程度的度量。覆蓋均一性高的探針池可減少使所有目標區域達到預期測序深度所需的數據量，從而降低檢測產品成本，減少分析時間，縮短檢測周期。目前常用的評估覆蓋均一性的指標包括Fold-80堿基罰分（Fold-80 base penalty，簡稱Fold-80）和0.2倍平均深度堿基覆蓋度。Fold-80是指確保80%的目標堿基達到平均覆蓋深度所需的額外測序倍數，分值越高，均一性越差。Fold-80的理想值為1，即80%的目標堿基已經達到了平均覆蓋深度，無需額外測序。然而，在實際應用中，Fold-80值通常會＞1，一般情況下認為Fold-80值＜2的探針池的覆蓋均一性較好。0.2倍平均深度堿基覆蓋度是指≥20%目標區域的平均有效深度的占比，數值越高表示探針池的均一性越好。2025年國家藥品監督管理局發布行業標準《腫瘤組織基因突變檢測試劑盒（高通量測序法）》YY/T 1946-2024建議≥20%目標區域的平均有效深度占比不低于95%。

GC含量是指在測序序列中鳥嘌呤（G）和胞嘧啶（C）堿基所占的比例，探針池的目標區間、合成質量，以及實驗環節中的溫度校準等因素都會影響GC含量的結果。如果GC含量異常，可能會影響探針池的捕獲效率和測序數據的均一性。GC含量的最佳比例尚無明確規定，2023年國家市場監督管理總局發布的《高通量基因測序儀校準規范》（征集意見稿）中關于標準物質的選擇原則指出GC占比應該在40%～60%之間，這為NGS探針設計和評估提供了一個參考范圍。

GC偏好是由文庫制備、探針捕獲、上機測序等多個環節的多種因素累積產生的靶標區域GC含量影響覆蓋深度的現象。通常表現為低GC或高GC含量的靶標區域的平均覆蓋深度小于整體平均覆蓋深度。其中低GC高于均值而高GC低于均值，或低GC低于均值而高GC高于均值，或低GC和高GC均低于均值的情況都有可能出現。將靶標區域根據不同的GC含量細分為多個GC bin（例如0～100%，每1% 1個bin），每個bin分別計算平均覆蓋深度，如果25%～75% GC區間均有超過0.5倍平均覆蓋深度即可評價為沒有嚴重的GC偏好。

基因組比對率是指比對到參考基因組上的reads數占所有測序reads數的比例，一般要求達到95%以上，這一標準可以確保檢測具有較高的數據利用率，從而提高后續數據分析的準確性和可靠性。

除上述指標外，Q30、測序深度、去除PCR重復后的比對率等常見生信分析指標雖不能直接反應探針的質量，但卻能反應檢測產品的檢測性能及樣本的測序質量，需要根據檢測產品的預期用途和檢測指標的性能要求，設置明確的質控標準。

綜上所述，探針池的測序數據質控尚無嚴格的質控標準，具體的數據表現不僅與探針池目標區域及探針設計方式相關，還與CGP檢測產品全流程的多個環節密切相關，包括待測樣本的質量、濕實驗體系以及干實驗質控指標的計算方法相關。因此，CGP探針池測序數據質控標準的設定的需要根據CGP檢測產品的性能要求，以及真實檢測所能達到的要求進行確認，通常要求不低于表3中提供的參考質控標準。

2.單條探針/單個位點的檢測性能評估：探針池測序數據質控評估合格后，還需要對單條探針或單個位點的檢測性能進行評估，通常使用探針池測序數據質控評估的分析數據，評估單條探針或單個位點在所有測試樣本中的中位表現。由于CGP檢測產品探針池包含的探針數目很多，很難通過對真實變異的檢測準確度進行評估，深度系數是評估探針檢測能力的常用指標。

探針/位點的深度系數定義為單條探針/單個位點的測序深度與樣本平均測序深度的比值，該值的質控線設定與CGP檢測產品的檢測限（limit of detection， LoD）及陽性判斷值相關，需不低于檢測要求的理論最低值。具體的計算方法為：在保證突變檢出概率≥95%前提下，利用二項分布函數根據不同突變或基因組指標的陽性判斷值以及LoD計算出位點要求的測序深度，即理論的最低測序深度，該理論深度與檢測產品要求的樣本平均測序深度的比值即探針深度系數的最小值。例如，某檢測產品要求測序深度為500×，突變的陽性判斷值為4條reads，LoD為2%，根據二項分布計算出的突變檢出概率達到95%以上時的理論位點測序深度需達到386×，檢測產品的樣本平均深度標準為500×，則位點的理論深度系數應達到0.77（386×/500×）以上。

CGP檢測產品探針池中包含的探針數目較多，由于目標區域本身的復雜性，實際檢測時可能會出現個別探針/位點的深度系數低于合格線。該部分探針通常是由于目標區域的GC含量過高或過低、含有較多重復序列等原因造成的，可通過進一步優化探針設計方法來實現相應目標區域的檢測性能達標。即以該探針的目標區域為中心，在原設計方案的基礎上通過左右滑窗的方式增加新的探針，以探針多重疊瓦的方式實現目標區域的檢測性能達標。將補充合成的新探針加入到原探針池中，再重新進行測序質控及單條探針/單個位點的檢測性能評估，確保新的探針池可以達到檢測產品性能的檢測要求。針對質控不合格無設計優化空間的目標區域，可以明確出該目標區域可達到的理論檢測限，并在檢測產品報告中針對該區域進行檢測性能的局限性聲明，或者直接從檢測產品的報告范圍中進行剔除。

3.基因變異及基因組指標的檢測能力評估：探針池基因變異及基因組指標的檢測能力是通過CGP檢測產品的檢測能力實現的，即驗證探針池對產品維度檢測指標的LoD和準確度的檢測性能，評估方法和評估標準可參考《實驗室自建腫瘤全景變異檢測性能確認中國專家共識（2024版）》中的要求進行。

CGP檢測產品的基因變異的LoD是指95%的樣本能夠正確檢出變異位點的最低等位基因百分比，基因組指標的LoD指95%的樣本能夠正確檢出陽性所需的最低的腫瘤純度。探針池LoD的評估需要對所有的變異類型的目標頻率以及基因組指標的目標腫瘤純度進行驗證。CGP檢測產品的準確度評估通常采用方法學比較的方式，使用其他經過驗證的對標方法檢測的臨床樣本進行檢測，計算檢測方法的陽性符合率（positive percent agreement， PPA）、陰性符合率（negative percent agreement， NPA）和陽性預測值（positive predictive value， PPV），需滿足LoD以上的變異的PPA、NPA和PPV達到95%以上。樣本數量的選擇，針對每種變異類型及每個基因組指標，應在 95％置信度（α=0.05）和 95％可靠性（r=0.95）的基礎上，使用容忍區間來評估性能確認的最少樣本數。由于不同類型的分子標志物的分析方法及性能要求不同，建議針對不同的變異類型進行分別評估。其中對標方法建議優先選擇待測標志物的臨床“金標準”方法，并使用獲得NMPA批準的IVD試劑盒，如EGFR突變、MET擴增、MSI指標等。對于尚未有獲批檢測方法的基因組指標，可以采用經過性能確認的LDT方法，如MTAP基因純合缺失、HRD指標等。

共識意見 5

探針池在進行臨床使用前需要使用標準品及臨床樣本對探針池的檢測性能進行評估，推薦評估的內容至少包括測試質控評估（包括捕獲效率、均一性、GC含量等）、單條探針/單個位點的深度系數表現，還推薦對產品維度的檢測限LoD和準確度進行評估，確保探針性能符合CGP檢測產品的檢測要求（推薦級別：1類）。

三

探針變更

在腫瘤診療技術不斷迭代和臨床需求動態更新的背景下，CGP檢測產品的探針體系可能需要適應性調整。探針變更主要涉及以下3種情形：（1）變更探針合成供應商。CGP檢測產品在使用過程中可能會因檢測產品成本結構優化、應對供應鏈風險等原因進行探針合成供應商變更。供應商切換應優先選擇探針類型相同（如DNA探針、RNA探針等）、合成原理及探針質控標準與原供應商具有可比性的合作方，且維持探針序列一致。供應商篩選時建議參考ISO 13485認證廠商的工藝參數進行匹配度評估。（2）部分探針濃度調整或部分區域探針加密。當CGP檢測產品對部分腫瘤標志物的檢測性能要求發生改變時，如檢測產品需要下調部分基因標志物的LoD，可通過提高對相應目標區域的探針濃度或對目標區間的探針進行加密來實現。盡管探針池的目標區域沒有發生變化，由于部分探針濃度調整或部分目標區間的探針加密，造成不同目標區域呈現出梯度分布的測序深度表現和不同規格的檢測限。該情況下，通常認為是檢測產品設計升級，即探針變更后形成了新的檢測產品。（3）探針序列修改、刪減和增加。當基因變異的臨床價值發生改變時，通常會涉及探針序列的修改、刪減和增加，即檢測產品的檢測范圍發生改變，形成了新的檢測產品。

探針池變更后需要經過充分的性能評估，確保新探針池性能滿足臨床檢測要求，并詳細記錄探針版本號及檢測產品更新迭代特征。探針合成供應商發生變更時，一般需要使用20例以上使用原探針池測試的臨床樣本進行探針性能評估，評估內容包括測序質控表現、單條探針/單個位點的深度系數以及產品維度基因組標志物檢測的準確度。評估標準為下機數據質控表現與原探針相當或無顯著差異，單條探針/單個位點的深度系數均滿足檢測產品性能的檢測要求，且基因組標志物檢測的一致率為100%。若因探針池變更導致形成新的檢測產品時，如部分區域探針濃度變化、探針序列修改、刪減和增加，除了對測序質控、單條探針/單個位點的深度系數以及檢測準確度進行評估外，還需要同時參考《實驗室自建腫瘤全景變異檢測性能確認中國專家共識（2024版）》對新檢測產品的關鍵參數（如預排數據量、TMB指標的陽性判斷值等）及檢測產品關鍵性能（包括檢測限及準確度）進行重新確認。當變更后的探針進行交付使用前，還需要對新探針匹配新的生信分析流程，如更新bed區間、更新CNV基線、更新MSI基線等。

所有變更執行后均需生成標準化的技術文檔，具體包括：探針合成供應商工藝可比性分析報告、探針性能評估報告、升級檢測產品的性能確認報告等。對于涉及伴隨診斷用途的檢測產品變更，還需提交NMPA補充申請并履行注冊變更程序，以確保臨床使用的合規性。

共識意見 6

探針池發生變更時，首先要確保新探針池的測序數據質控表現及單條探針/單個位點的深度系數滿足產品檢測要求，同時匹配更新生信分析流程。當僅探針合成供應商發生變更時，需要與變更前的探針進行基因標志物的準確度評估，評估時需要納入全部的基因變異類型及基因組標志物。當探針池的目標區域發生變更（包括新增及刪減）、部分探針濃度發生調整時，產品的檢測范圍或檢測性能會發生變化，還需要從產品維度對新檢測產品的關鍵參數（如數據量）、LoD以及準確度進行重新確認（推薦級別：2B類）。

四

總結

作為全面覆蓋多種基因變異和復雜基因組標志物檢測需求的腫瘤CGP檢測產品，其探針設計面臨多重技術挑戰：一方面由于需檢測的基因變異和伴隨診斷標志物日益增多，探針池需要覆蓋的靶基因與靶區域顯著增多；另一方面NGS技術全流程的復雜性進一步提高了探針池性能評估的技術門檻。需特別關注的是，探針池作為NGS全流程檢測的初始反應體系，其雜交捕獲效率和特異性直接決定了最終檢測結果的準確度與可靠性。然而目前該領域尚未形成系統的質量標準或技術共識，亟待建立針對性的技術規范。

基于上述背景，本共識旨在建立基于NGS技術的腫瘤CGP檢測產品探針設計全流程質量管理體系。其技術規范聚焦三大核心維度：（1）臨床價值相關性驅動的靶區篩選機制（涵蓋目標基因/區域篩選標準和臨床證據權重要求）；（2）探針設計及性能評估標準（包括探針覆蓋率、均一性、重復序列規避等技術指標）；（3）探針變更的科學驗證流程（涉及生物信息學預測與干濕實驗驗證的聯合評估框架）。本共識形成的技術導則不僅可為CGP檢測產品的生產廠商提供檢測產品開發的標準，也為臨床醫師和患者評估檢測產品的技術性能提供參考依據。

本次專家共識的適用范圍說明：在技術路徑上限定為基于DNA靶向捕獲測序的CGP檢測產品，目標基因推薦的惡性腫瘤類型僅限于實體腫瘤，臨床證據來源于FDA/NMPA批準伴隨診斷、權威臨床指南（如NCCN/CSCO）、高質量循證研究（截止時間2025年5月）。此外，各企業應建立動態證據評估機制，當靶基因的臨床證據等級因新型療法研發或實踐指南更新發生變更時，應及時修正檢測方案。需特別指出的是，本共識提出的技術指標將隨行業發展持續優化，新的行業標準發布后應以最新標準為執行依據。

參考文獻略。

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責任編輯 | 殷寶俠

審核發布 | 蘇在明

終審 | 代小秋

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專家共識編寫組成員（按姓氏漢語拼音字母排序）

柏乾明（復旦大學附屬腫瘤醫院病理科）

常志力（南京世和基因生物技術股份有限公司）

陳維之（無錫臻和生物科技有限公司）

陳文浩（伯科生物科技有限公司）

成瓊（河南省人民醫院病理科）

董磊（上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院病理科）

董林（國家癌癥中心 國家腫瘤臨床醫學研究中心 中國醫學科學院北京協和醫學院腫瘤醫院病理科）

杜新華（北京吉因加科技有限公司）

樊祥山（安徽醫科大學第一附屬醫院病理科）

谷俊剛（上海何因生物科技有限公司）

管彥芳（北京吉因加科技有限公司）

韓昱晨（上海交通大學醫學院附屬胸科醫院病理科）

胡沛臻（第四軍醫大學西京醫院病理科）

胡曉彤（浙江大學醫學院附屬邵逸夫醫院病理科）

黃博（華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院病理科）

黃杰（中國食品藥品檢定研究院體外診斷試劑檢定所）

紀元（復旦大學附屬中山醫院分子病理中心）

姜青明（重慶市腫瘤醫院病理科）

李衛華（國家癌癥中心 國家腫瘤臨床醫學研究中心 中國醫學科學院北京協和醫學院腫瘤醫院病理科）

李文斌（國家癌癥中心 國家腫瘤臨床醫學研究中心 中國醫學科學院北京協和醫學院腫瘤醫院病理科）

梅姍姍［埃德特（上海）生物科技有限公司］

孟宏學（哈爾濱醫科大學附屬腫瘤醫院病理科）

屈武斌［艾吉泰康生物科技（北京）有限公司］

史玉潔（河南省人民醫院病理科）

孫意（中南大學湘雅二醫院病理科）

魏冰（河南省腫瘤醫院分子病理科）

吳強［納昂達（南京）生物科技有限公司］

肖華亮（陸軍特色醫學中心病理科）

楊映紅（福建醫科大學附屬協和醫院病理科）

姚梅宏（福建醫科大學附屬協和醫院病理科）

葉豐（四川大學華西醫院臨床病理研究所分子室）

易鑫（北京吉因加科技有限公司）

易玉婷（北京吉因加科技有限公司）

殷慧慧（中國食品藥品檢定研究院體外診斷試劑檢定所）

應建明（國家癌癥中心 國家腫瘤臨床醫學研究中心 中國醫學科學院北京協和醫學院腫瘤醫院病理科）

張妍（北京吉因加科技有限公司）

趙苗青（山東省腫瘤醫院病理科）

周曉燕（復旦大學附屬腫瘤醫院病理科）

執筆人

殷慧慧（中國食品藥品檢定研究院體外診斷試劑檢定所）

李文斌（國家癌癥中心 國家腫瘤臨床醫學研究中心 中國醫學科學院北京協和醫學院腫瘤醫院病理科）

來源：中華腫瘤雜志

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