Phytomedicine (IF=11.3)｜中藥復(fù)方抗癌機(jī)制再驗(yàn)證：CRISPR敲除鎖定復(fù)方苦參注射液多靶點(diǎn)通路，IL24、CYP1B1與CYP1A1成關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)！

2026年7月16日，澳大利亞阿德萊德大學(xué)Hanyuan Shen、David L. Adelson團(tuán)隊(duì)，聯(lián)合 Zhendong Pharmaceutical 等單位，在Phytomedicine（中科院1區(qū)，IF=11.3）在線發(fā)表題為 “Target pathway validation for Compound Kushen Injection active against cancer cells” 的研究論文。該文于2026年1月28日投稿，2026年7月7日修回，2026年7月14日接收，目前為 Journal Pre-proof 版本。

復(fù)方苦參注射液（Compound Kushen Injection，CKI），又稱巖舒注射液，是來(lái)源于苦參（Sophora flavescens Aiton）和白土苓（Smilax glabra Roxb）的中藥復(fù)方制劑，已在中國(guó)用于多種癌癥的臨床輔助治療。由于中藥復(fù)方通常包含復(fù)雜天然產(chǎn)物混合物，并具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同作用特點(diǎn)，其具體作用靶點(diǎn)和機(jī)制驗(yàn)證一直是研究難點(diǎn)。

該研究延續(xù)團(tuán)隊(duì)此前的轉(zhuǎn)錄組學(xué)工作，從4條候選通路中選擇8個(gè)關(guān)鍵基因，包括細(xì)胞周期通路的 CDKN1A、CDC14B，細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路的 IL1A、IL24，NF-κB 信號(hào)通路的 MYD88、NFKB，以及外源物代謝-細(xì)胞色素P450通路的 CYP1A1、CYP1B1。研究利用 CRISPR/CAS 技術(shù)，在4種腫瘤細(xì)胞系中分別敲除這些基因，并觀察細(xì)胞增殖、克隆形成、遷移、凋亡和細(xì)胞周期等表型變化，以及基因缺失后細(xì)胞對(duì)CKI處理的響應(yīng)變化。

結(jié)果顯示，盡管不同細(xì)胞系對(duì)基因敲除和CKI處理的敏感性存在差異，但多數(shù)候選基因敲除會(huì)影響CKI的藥理效應(yīng)。IL24 和 CYP1B1 在 CKI 抑制腫瘤細(xì)胞遷移中發(fā)揮關(guān)鍵作用，CYP1A1 對(duì) CKI 誘導(dǎo)的 G2/M 期細(xì)胞周期阻滯十分重要；MYD88 和 NF-κB 敲除則增強(qiáng)CKI效應(yīng)，提示部分炎癥相關(guān)信號(hào)可能具有細(xì)胞適應(yīng)性保護(hù)作用。整體而言，該研究為“中藥復(fù)方通過(guò)多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤作用”提供了功能遺傳學(xué)層面的驗(yàn)證依據(jù)。需要注意的是，本研究主要基于體外腫瘤細(xì)胞模型，不能直接等同于人體臨床療效。

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【摘 要】

背景：傳統(tǒng)中藥通常由復(fù)雜天然產(chǎn)物混合物構(gòu)成，并通過(guò)多靶點(diǎn)機(jī)制發(fā)揮作用。因此，其靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)和機(jī)制驗(yàn)證一直具有挑戰(zhàn)性。研究團(tuán)隊(duì)此前以復(fù)方苦參注射液（Compound Kushen Injection，CKI）為模型藥物，利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法識(shí)別出多條候選通路和多個(gè)候選靶基因，推測(cè)CKI可能通過(guò)這些通路和靶點(diǎn)發(fā)揮藥理作用。

目的：本研究旨在證明CKI中天然產(chǎn)物成分的不同藥理活性涉及多個(gè)遺傳靶點(diǎn)。

方法：研究從4條候選通路中選擇8個(gè)關(guān)鍵基因，并利用 CRISPR/CAS 技術(shù)在4種細(xì)胞系中敲除這些基因，從而驗(yàn)證它們?cè)贑KI藥理活性中的作用。

結(jié)果：不同細(xì)胞系對(duì)基因敲除的敏感性存在差異，但總體來(lái)看，基因敲除可導(dǎo)致多種細(xì)胞活動(dòng)下降。加入CKI后，除 CDKN1A 基因敲除對(duì)CKI作用影響較小外，敲除其他基因均在不同實(shí)驗(yàn)中顯著影響CKI藥理效應(yīng)。其中，MYD88 和 NFkB 基因敲除增強(qiáng)了CKI效應(yīng)。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn) IL24 和 CYP1B1 在CKI抑制腫瘤細(xì)胞遷移中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而 CYP1A1 對(duì)CKI誘導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯具有重要意義。

結(jié)論：這些發(fā)現(xiàn)驗(yàn)證了研究團(tuán)隊(duì)此前轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析結(jié)果，并進(jìn)一步說(shuō)明天然產(chǎn)物混合物可通過(guò)多靶點(diǎn)協(xié)同作用形成復(fù)雜藥理機(jī)制。

關(guān)鍵詞：CRISPR/CAS；天然藥物；多靶點(diǎn)；癌癥治療；復(fù)方苦參注射液。

01

研究背景及科學(xué)問(wèn)題

復(fù)方苦參注射液（CKI），又稱巖舒注射液，來(lái)源于苦參（Sophora flavescens Aiton）和白土苓（Smilax glabra Roxb），是一種依據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論制備的中藥制劑。CKI 于1995年獲中國(guó)食品藥品監(jiān)督管理部門批準(zhǔn)，并已用于多種癌癥的臨床治療。盡管已有相當(dāng)多臨床證據(jù)支持CKI的療效，但由于其傳統(tǒng)中藥復(fù)方組成復(fù)雜，其具體作用機(jī)制仍未完全明確。

在此前研究中，作者團(tuán)隊(duì)將CKI作為傳統(tǒng)中藥復(fù)方模型，采用系統(tǒng)生物學(xué)和功能基因組學(xué)方法探索其潛在抗癌機(jī)制。研究結(jié)果提示，CKI可影響大量與癌癥治療相關(guān)的基因和通路。這些發(fā)現(xiàn)支持CKI可能通過(guò)多靶點(diǎn)協(xié)同方式發(fā)揮作用，而這也正是傳統(tǒng)中藥的重要特點(diǎn)。然而，盡管團(tuán)隊(duì)已經(jīng)確認(rèn)CKI能夠擾動(dòng)特定基因及其蛋白產(chǎn)物，但大多數(shù)已識(shí)別基因和通路仍需要進(jìn)一步功能驗(yàn)證。

基于此前轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果，研究團(tuán)隊(duì)確定了4條受CKI顯著影響、并與癌癥生物學(xué)密切相關(guān)的通路。隨后，在每條通路中選擇2個(gè)靶基因進(jìn)行敲除，以驗(yàn)證其作用。這些基因之所以被選中，是因?yàn)樗鼈冊(cè)贑KI處理后出現(xiàn)明顯轉(zhuǎn)錄變化，并且在各自通路中處于功能上較重要的節(jié)點(diǎn)。研究關(guān)注的基因包括：細(xì)胞周期通路中的 CDKN1A 和 CDC14B；細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路中的 IL1A 和 IL24；NF-κB 信號(hào)通路中的 MYD88 和 NFKB；以及外源物代謝-細(xì)胞色素P450通路中的 CYP1A1 和 CYP1B1。

值得注意的是，除 MYD88 外，其余基因在CKI處理后的 MDA-MB-231 和 HepG2 細(xì)胞系中均顯著上調(diào)。這說(shuō)明CKI對(duì)這些基因表達(dá)具有明顯影響，尤其是在這些癌細(xì)胞背景下。為比較物種差異并為未來(lái)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備，研究在4種細(xì)胞系中開展基因敲除：人源 MDA-MB-231 和 A431 細(xì)胞，以及小鼠來(lái)源 B16F1 和 E0771 細(xì)胞。MDA-MB-231 和 A431 細(xì)胞曾用于作者此前的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，也代表CKI具有臨床應(yīng)用背景的腫瘤類型；B16F1 和 E0771 則作為相應(yīng)小鼠腫瘤細(xì)胞系，用于比較人源和小鼠腫瘤細(xì)胞對(duì)CKI的反應(yīng)，并支持未來(lái)體內(nèi)驗(yàn)證研究。

在癌癥生物學(xué)領(lǐng)域，CRISPR/CAS 技術(shù)已被廣泛用于探索腫瘤發(fā)生、進(jìn)展和治療反應(yīng)的遺傳基礎(chǔ)。此外，CRISPR/CAS 也常用于研究多種癌癥中的藥物耐受，包括化療、靶向治療和抑制劑治療相關(guān)耐藥。本研究將 CRISPR/CAS 技術(shù)用于驗(yàn)證候選基因和候選通路在CKI抗癌效應(yīng)中的功能作用，并進(jìn)一步探索其對(duì)CKI多靶點(diǎn)機(jī)制的貢獻(xiàn)。研究團(tuán)隊(duì)在4種不同細(xì)胞系中分別建立8個(gè)候選基因的單基因敲除細(xì)胞株，觀察由此產(chǎn)生的表型變化及其對(duì)CKI處理的響應(yīng)。結(jié)果顯示，不同細(xì)胞系之間存在明顯差異；但總體而言，這些基因敲除主要抑制細(xì)胞功能，并影響CKI作用。上述結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了此前轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)，并強(qiáng)調(diào)CKI的抗癌效應(yīng)可能是通過(guò)擾動(dòng)多條通路和多個(gè)靶點(diǎn)的協(xié)同作用實(shí)現(xiàn)的。

02

重要發(fā)現(xiàn)及亮點(diǎn)

CKI的化學(xué)特征確認(rèn)

在開展生物學(xué)實(shí)驗(yàn)前，研究首先利用 HPLC–UV 對(duì)本批次CKI進(jìn)行化學(xué)表征。研究共鑒定并定量8種代表CKI兩味組成藥材的標(biāo)志性化合物。這些化合物被選為質(zhì)控標(biāo)志物，是因?yàn)樗鼈儗儆贑KI已報(bào)道的主要生物活性成分，并常用于該制劑質(zhì)量控制。

其中，菝葜皂苷元苷（macrozamin）被鑒定為白土苓（Smilax glabra，Baituling）的特征成分；苦參堿（matrine）、槐果堿（sophocarpine）、槐定堿（sophoridine）、氧化槐果堿（oxysophocarpine）、氧化苦參堿（oxymatrine）、piscidic acid 和 trifolirhizin 則是苦參（Sophora flavescens，Kushen）的代表性成分。整體來(lái)看，這些標(biāo)志物確認(rèn)了本研究所用CKI批次具有典型化學(xué)指紋圖譜和批次一致性。

圖1：復(fù)方苦參注射液的 HPLC–UV 色譜圖。圖中標(biāo)記峰均使用經(jīng)認(rèn)證的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行鑒定和定量。

利用外顯子缺失法制備基因敲除細(xì)胞株

傳統(tǒng) CRISPR-Cas9 基因敲除方法通常在目標(biāo)基因外顯子中刪除約20 bp片段，從而引起移碼突變并使基因完全失活。然而，由于外顯子長(zhǎng)度不同、不同剪接異構(gòu)體存在差異，選擇合適的刪除片段有時(shí)并不容易。

本研究使用 pDG458 質(zhì)粒，該質(zhì)粒含有兩個(gè)獨(dú)立外源DNA整合位點(diǎn)，可同時(shí)導(dǎo)入兩條向?qū)蛄小ａ槍?duì)每個(gè)目標(biāo)基因，研究在目標(biāo)外顯子兩側(cè)設(shè)計(jì)向?qū)蛄校哉T導(dǎo)整個(gè)外顯子從基因組中完全脫落，并在下游外顯子中造成移碼突變，從而完全失活目標(biāo)基因。由于刪除片段較長(zhǎng)，研究也更容易通過(guò)PCR進(jìn)行初篩，再結(jié)合Sanger測(cè)序和Western blot確認(rèn)敲除結(jié)果。由于 A431 細(xì)胞對(duì)CKI表現(xiàn)出最穩(wěn)定、可重復(fù)的響應(yīng)，因此研究將A431細(xì)胞用于更詳細(xì)的機(jī)制分析，同時(shí)將其余細(xì)胞系用于評(píng)估不同腫瘤模型中的基因型依賴性反應(yīng)。

A431細(xì)胞中基因敲除后的表型變化

為確定基因敲除對(duì)不同細(xì)胞活動(dòng)的影響，研究在A431細(xì)胞系中依次檢測(cè)了細(xì)胞活力、克隆形成、細(xì)胞周期分布和細(xì)胞遷移表型。

在A431細(xì)胞的 CCK8 細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)中，24小時(shí)后的細(xì)胞增殖比例顯示，敲除 IL1A、IL24 和 NFkB 基因可顯著降低A431細(xì)胞增殖活性；相反，MYD88 基因敲除增強(qiáng)了細(xì)胞增殖。克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示，敲除 CDC14B、IL24、NFkB 和 CYP1B1 基因可顯著降低單個(gè)細(xì)胞形成克隆的能力，其中 IL24 和 NFkB 敲除細(xì)胞株下降尤其明顯，在固定染色后的六孔板圖像中可清楚觀察到。另一方面，CYP1A1 基因敲除顯著增強(qiáng)了克隆形成能力。

細(xì)胞周期分析顯示，除 CDKN1A 外，其余基因敲除均顯著增加凋亡細(xì)胞比例，其中 IL24、NFkB 和 CDC14B 敲除細(xì)胞株增加更為明顯，這與細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。不同細(xì)胞周期階段的比例也提示，像 IL24 敲除這類凋亡增加的基因型，其G1期細(xì)胞減少、G2/M期細(xì)胞增加，提示可能出現(xiàn)細(xì)胞周期阻滯。

在細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，A431細(xì)胞遷移效率較高，幾乎可在24小時(shí)內(nèi)完全覆蓋創(chuàng)面區(qū)域。與野生型細(xì)胞相比，多數(shù)基因敲除細(xì)胞遷移速度略有增加或影響很小；但 CYP1A1 敲除明顯降低細(xì)胞遷移速度。

圖2：A431細(xì)胞基因敲除流程及表型表征。（a）使用 pDG458 質(zhì)粒進(jìn)行基因敲除的流程。（b）WT 和基因敲除 A431 細(xì)胞的細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)。（c 和 d）比較 WT 與基因敲除 A431 細(xì)胞系的克隆形成實(shí)驗(yàn)。（e）比較 WT 與基因敲除 A431 細(xì)胞系的劃痕愈合遷移實(shí)驗(yàn)。（f 和 g）比較 WT 與基因敲除 A431 細(xì)胞系的流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞周期分析。

不同基因缺失影響A431細(xì)胞對(duì)CKI的響應(yīng)

為測(cè)試不同基因缺失對(duì)CKI作用的影響，研究首先使用 CCK8 實(shí)驗(yàn)評(píng)估不同CKI濃度下A431基因敲除細(xì)胞株的細(xì)胞活力。結(jié)果顯示，在A431細(xì)胞系中，幾乎所有敲除細(xì)胞株在CKI處理后均與野生型細(xì)胞存在顯著差異，并且隨著CKI暴露時(shí)間延長(zhǎng)、濃度升高，這種差異更加明顯。

多數(shù)敲除細(xì)胞株表現(xiàn)為CKI作用減弱，說(shuō)明這些基因的功能或其相關(guān)產(chǎn)物可能參與介導(dǎo)CKI效應(yīng)。然而，MYD88 和 NFkB 缺失后，細(xì)胞對(duì)CKI的響應(yīng)增強(qiáng)，提示這些基因可能在一定程度上抑制CKI作用。值得注意的是，沒(méi)有任何單個(gè)基因敲除能夠完全逆轉(zhuǎn)CKI效應(yīng)，這進(jìn)一步符合CKI作為復(fù)雜天然產(chǎn)物混合物的多靶點(diǎn)協(xié)同作用特征。

作者此前研究發(fā)現(xiàn)，CKI可顯著降低腫瘤細(xì)胞遷移率。因此，本研究進(jìn)一步比較了不同基因敲除細(xì)胞中CKI對(duì)細(xì)胞遷移的影響。在A431細(xì)胞系中，不同基因敲除細(xì)胞在CKI處理組和對(duì)照組之間的創(chuàng)面愈合率比較顯示，CKI可顯著降低細(xì)胞遷移速度。然而，在 IL24 和 CYP1B1 基因敲除細(xì)胞中，這種差異幾乎消失，提示這兩個(gè)基因?qū)τ贑KI抑制A431細(xì)胞遷移十分重要。該現(xiàn)象在A431和MDA-MB-231細(xì)胞中 CYP1B1 敲除后的遷移實(shí)驗(yàn)圖像比較中也可清楚觀察到。

進(jìn)一步比較不同基因型中對(duì)照組與CKI處理組遷移速度差異顯示，MYD88 和 NFkB 敲除增強(qiáng)了CKI對(duì)細(xì)胞遷移的抑制作用；而除 CDKN1A 外，其他基因敲除均顯著削弱CKI效應(yīng)。

圖3：基因敲除對(duì)CKI在A431細(xì)胞中藥效的影響。（a）CKI處理下的細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)，左圖為24小時(shí)，右圖為48小時(shí)。不同柱表示CKI處理組相對(duì)于對(duì)照組的比例。（b 和 c）CKI處理下的劃痕愈合遷移實(shí)驗(yàn)及遷移抑制定量。（d 和 e）A431 和 MDA-MB-231 細(xì)胞系中 CYP1B1 敲除遷移實(shí)驗(yàn)圖像。

MDA-MB-231、E0771和B16F1細(xì)胞中基因敲除后的表型變化

為比較不同腫瘤模型中的基因型依賴性表型響應(yīng)，研究在 MDA-MB-231、B16F1 和 E0771 細(xì)胞中開展了相同檢測(cè)。與A431細(xì)胞類似，基因敲除會(huì)改變多種細(xì)胞表型，但影響程度在不同細(xì)胞系之間存在差異。

在 MDA-MB-231 細(xì)胞中，敲除細(xì)胞周期通路相關(guān)基因 CDKN1A 和 CDC14B 可顯著減少細(xì)胞克隆形成數(shù)量。CYP1A1 和 CYP1B1 基因敲除則導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移率下降。在生長(zhǎng)速度快、遷移率低的 B16F1 細(xì)胞中，基因敲除對(duì)細(xì)胞表型影響相對(duì)較小。MYD88 基因敲除顯著增強(qiáng) B16F1 細(xì)胞的克隆形成能力，而 CYP1B1 基因敲除則加快細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移。由于 E0771 細(xì)胞貼壁不完全，不適合開展需要洗滌和染色步驟的克隆形成實(shí)驗(yàn)。不過(guò)，一個(gè)有趣發(fā)現(xiàn)是，8個(gè)基因全部敲除均顯著降低 E0771 細(xì)胞的遷移效率。

基于所有表型結(jié)果，研究繪制熱圖總結(jié)各細(xì)胞系敲除株的表型變化。總體來(lái)看，在多數(shù)情況下，這些基因敲除傾向于削弱細(xì)胞活性。B16F1 細(xì)胞對(duì)基因缺失的敏感性似乎較低，而 E0771 細(xì)胞的遷移能力受基因敲除影響顯著。值得注意的是，MYD88 缺失在多個(gè)表型層面上會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞活性。

圖4：MDA-MB-231、B16F1 和 E0771 細(xì)胞基因敲除后的表型變化。（a 和 b）比較 WT 與基因敲除 MDA-MB-231 和 B16F1 細(xì)胞系的克隆形成實(shí)驗(yàn)。（c、d 和 e）比較 WT 與基因敲除 MDA-MB-231、B16F1 和 E0771 細(xì)胞系的細(xì)胞活力。（f、g 和 h）比較 WT 與基因敲除 MDA-MB-231、B16F1 和 E0771 細(xì)胞系的細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。（i）不同細(xì)胞系相對(duì)于 WT 的表型變化熱圖。

不同基因缺失影響MDA-MB-231、E0771和B16F1細(xì)胞對(duì)CKI的響應(yīng)

研究進(jìn)一步在其余3種細(xì)胞系中開展細(xì)胞增殖和遷移實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，與A431相比，這些細(xì)胞系在基因敲除后對(duì)CKI響應(yīng)差異不那么明顯。多數(shù)基因敲除細(xì)胞株表現(xiàn)為CKI活性降低；例外情況是B16F1細(xì)胞中 CYP1B1 基因敲除，以及E0771細(xì)胞中 IL1A 基因敲除，這兩種情況下細(xì)胞對(duì)CKI響應(yīng)增強(qiáng)。細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)熱圖進(jìn)一步顯示，多數(shù)基因敲除株均表現(xiàn)為CKI效應(yīng)減弱。這種變化在A431細(xì)胞中更明顯，而 MDA-MB-231 和 B16F1 細(xì)胞在基因敲除后對(duì)CKI響應(yīng)變化較小。此外，CYP1A1 和 CYP1B1 基因缺失可改變各細(xì)胞系對(duì)CKI的響應(yīng)。

CKI降低 MDA-MB-231 和 B16F1 細(xì)胞遷移速度的作用不如A431細(xì)胞明顯，但仍可觀察到多數(shù)基因缺失會(huì)削弱CKI作用。在 MDA-MB-231 細(xì)胞中，與A431類似，IL24 和 CYP1B1 敲除顯著影響CKI效應(yīng)，而 CYP1A1 敲除則增強(qiáng)CKI作用。在 B16F1 細(xì)胞中，除 IL24 和 MYD88 敲除增強(qiáng)CKI對(duì)細(xì)胞遷移的抑制作用外，其他基因缺失通常削弱CKI作用。E0771 細(xì)胞的結(jié)果較為特殊，多個(gè)基因敲除細(xì)胞在CKI處理后表現(xiàn)為遷移效率增加。由于該細(xì)胞系貼壁較松，實(shí)驗(yàn)中可觀察到CKI處理樣本中漂浮細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)明顯增加。因此，這種表觀遷移增加可能源于漂浮細(xì)胞重新附著于創(chuàng)面區(qū)域，從而造成類似遷移的假象，實(shí)際上可能只是隨機(jī)分散。作者認(rèn)為，未來(lái)應(yīng)采用三維細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步排除這一影響。

圖5：基因敲除對(duì)CKI在 MDA-MB-231、B16F1 和 E0771 細(xì)胞中藥效的影響。（a、b 和 c）MDA-MB-231、B16F1 和 E0771 細(xì)胞系在CKI處理下的細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)，上方為24小時(shí)，下方為48小時(shí)。不同柱表示CKI處理組相對(duì)于對(duì)照組的比例。（d、e 和 f）MDA-MB-231、B16F1 和 E0771 細(xì)胞系在CKI處理下的劃痕愈合遷移實(shí)驗(yàn)，上方為實(shí)驗(yàn)結(jié)果，下方為遷移抑制定量。

CKI處理后的細(xì)胞周期響應(yīng)

基于細(xì)胞增殖和遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果，研究選擇A431細(xì)胞系全部基因敲除株，以及其他細(xì)胞系中對(duì)CKI處理較敏感的 CYP1A1 和 CYP1B1 敲除株，進(jìn)行碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色實(shí)驗(yàn)，以分析細(xì)胞周期變化。

A431細(xì)胞各基因敲除株在對(duì)照條件下細(xì)胞周期曲線形態(tài)差異較小；但在CKI作用下，不同敲除株之間出現(xiàn)明顯差異。除凋亡細(xì)胞比例存在顯著差異外，整體細(xì)胞周期譜也出現(xiàn)顯著變化，尤其體現(xiàn)在G2/M期細(xì)胞比例上。例如，CDKN1A 敲除株與 CYP1A1 敲除株比較顯示，細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯。

研究進(jìn)一步匯總CKI處理下不同基因敲除株中凋亡細(xì)胞比例和G2/M期細(xì)胞比例變化。結(jié)果顯示，在A431細(xì)胞中，MYD88 和 CYP1B1 基因敲除顯著增強(qiáng)CKI作用，而其他基因敲除通常削弱CKI作用。其他細(xì)胞系中 CYP1A1 和 CYP1B1 敲除株在CKI處理后的凋亡比例和G2/M期比例變化，也與細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

此外，研究將細(xì)胞周期結(jié)果與細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較。在A431細(xì)胞中，CDKN1A 敲除影響最小，而 MYD88 和 NFkB 缺失在多個(gè)方面增強(qiáng)CKI效應(yīng)。其余基因敲除則導(dǎo)致CKI效應(yīng)下降。在另外3種細(xì)胞系中，CYP1A1 敲除降低CKI有效性；CYP1B1 功能缺失在B16F1細(xì)胞中增強(qiáng)CKI作用，但在另外兩種細(xì)胞系中降低CKI作用。整體而言，細(xì)胞周期分析結(jié)果與細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，并提示敲除多數(shù)候選基因往往會(huì)降低CKI效應(yīng)。

圖6：WT 和基因敲除 A431 細(xì)胞系在未處理?xiàng)l件下左側(cè)或CKI處理48小時(shí)右側(cè)的代表性流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞周期直方圖。

圖7：細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞周期分析總結(jié)，顯示不同基因型對(duì)CKI響應(yīng)的影響。（a）不同基因型相對(duì)于WT細(xì)胞在細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)中CKI效應(yīng)變化的熱圖。（b）不同A431基因敲除細(xì)胞系在CKI處理下凋亡率的倍數(shù)變化。（c）不同A431基因敲除細(xì)胞系在CKI處理下G2/M期比例的倍數(shù)變化。（d）與WT相比，MDA-MB-231、B16F1 和 E0771 細(xì)胞中 CYP1A1 和 CYP1B1 敲除后，CKI處理下凋亡率和G2/M期比例的倍數(shù)變化。

候選基因和相關(guān)信號(hào)通路共同影響CKI響應(yīng)

綜合來(lái)看，研究使用外顯子缺失法在4種不同細(xì)胞系中成功建立8個(gè)基因的敲除細(xì)胞株，并通過(guò)多種實(shí)驗(yàn)闡明其表型變化。進(jìn)一步通過(guò)觀察不同基因敲除后CKI效應(yīng)如何改變，研究驗(yàn)證了這些候選基因及其相關(guān)信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞響應(yīng)CKI具有重要影響。

不過(guò)，需要注意的是，任何單個(gè)基因敲除都無(wú)法完全抵消CKI的藥理作用。這一結(jié)果再次強(qiáng)調(diào)，包括中藥復(fù)方在內(nèi)的復(fù)雜天然產(chǎn)物混合物，其作用機(jī)制往往并非依賴單一靶點(diǎn)，而更可能來(lái)自多靶點(diǎn)、多通路的協(xié)同擾動(dòng)。

【貢獻(xiàn)】★★★★★

本研究基于此前轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析結(jié)果，聚焦4條通路中的8個(gè)關(guān)鍵基因，并在4種不同細(xì)胞系中建立了相應(yīng)基因敲除模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，多數(shù)候選基因敲除均會(huì)顯著影響CKI的藥理效應(yīng)，從而驗(yàn)證了早期基因分析結(jié)果，也支持傳統(tǒng)中藥復(fù)雜成分多靶點(diǎn)協(xié)同作用的機(jī)制假說(shuō)。

此外，研究發(fā)現(xiàn) IL24 和 CYP1B1 基因在CKI抑制細(xì)胞遷移中似乎具有關(guān)鍵作用，而 CYP1A1 對(duì)CKI誘導(dǎo)G2/M期細(xì)胞周期阻滯十分重要。結(jié)果顯示，敲除這些基因幾乎可完全抵消CKI在相應(yīng)表型上的作用，因此為后續(xù)針對(duì)特定癌癥類型設(shè)計(jì)治療策略提供了有價(jià)值的研究起點(diǎn)。

總體而言，該研究展示了CKI藥理作用的多通路特征，并強(qiáng)調(diào)將轉(zhuǎn)錄組學(xué)與功能遺傳學(xué)方法結(jié)合，用于解析復(fù)雜天然產(chǎn)物制劑作用機(jī)制的價(jià)值。需要強(qiáng)調(diào)的是，當(dāng)前結(jié)果主要來(lái)自體外腫瘤細(xì)胞模型；CKI在不同癌種、不同組織環(huán)境以及體內(nèi)免疫系統(tǒng)參與下的作用，仍需要進(jìn)一步通過(guò)更復(fù)雜生物系統(tǒng)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

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