人腦類器官養不活的細胞，這篇 Cell 怎么搞定的

首次在具備血管化和免疫活性的人腦類器官中，實現了功能性人類小膠質細胞的長期存活與成熟，這篇 Cell 怎么把類器官研究的實驗設計做到完美[1]。（原文獻在文末）

根據研究現狀找「課題方向」

1. 2D 培養失真：脫離大腦環境的小膠質細胞會進入非生理性的激活狀態，其基因表達與表觀遺傳特征發生顯著改變。

2. 類器官缺乏特定細胞類型： 傳統腦類器官由神經外胚層分化而來，可形成神經元和星形膠質細胞，但小膠質細胞起源于中胚層，因此在標準類器官中天然缺失。

3. 異種移植不匹配：將人源小膠質細胞移植至小鼠大腦后，其所處微環境為鼠源性，難以真實反映其與人類神經元環境的相互作用。

總結：缺一個既能提供人源微環境，又能支持小膠質細胞長期存活的模型。

實驗設計思路

1、體外「播種」—— 讓 EMP 細胞引入類器官

研究團隊首先利用人 iPSC 分化為 CD43? 紅系-髓系祖細胞（EMPs）（小膠質細胞的前體），然后將 EMPs 與前腦特異性類器官共培養。

關鍵發現：EMPs 在 12 小時內就能高效侵入類器官，且偏好定居在皮質板（CP）樣區域，避開了腦室區（VZ）樣區域 —— 這與人類胚胎發育中微膠質細胞的徑向遷移模式高度一致。

需要注意的是：體外培養條件下，EMPs 來源的細胞在約 6 周后開始大量死亡，至 13 周時存活率降至 5% 以下。存活細胞形態趨于圓形，呈現激活狀態，且不表達成熟小膠質細胞標志物。這提示單純體外培養無法支持小膠質細胞的長期存活（培養基中必須添加 M-CSF、IL-34 和 TGFβ1，否則 EMPs 無法維持）。

2、體內「成熟」—— 把類器官移植到小鼠大腦

這是整個研究的核心創新點！ 研究團隊沒有讓 EMPs-類器官共培養體系在體外硬撐，而是在 EMP 整合后 10 天，將整個類器官移植到免疫缺陷小鼠（NOD/SCID）的壓后皮質。

移植后 8 周，觀察到顯著變化：紅色熒光標記的細胞大量存活，且形態呈現高度分枝的「靜息態」，這是健康小膠質細胞的典型特征。更重要的是，這些細胞開始表達 TMEM119 和 P2RY12，這兩種公認的成熟小膠質細胞標志物在體外培養細胞中幾乎不表達。

單細胞轉錄組分析進一步顯示，這些小膠質細胞的基因表達譜與人類胎兒大腦中的真實小膠質細胞高度一致。隨著移植后時間延長（6 周、11 周、24 周），其轉錄組特征逐漸趨近于成體小膠質細胞。得出結論：只有血管化的體內環境，才能支持小膠質細胞發揮功能。

3、功能驗證 —— 活體成像揭示表型功能

光看形態和基因還不夠，還得看功能。研究人員用雙光子顯微鏡在活體小鼠中實時觀察這些小膠質細胞的行為。結果發現：

• 突觸動態：hMGs 的突觸以約 1.76 μm/min 的速度持續伸縮，主動熟悉周圍環境。

• 損傷響應：在激光誘導的局部損傷后，hMGs 能在 10 分鐘內將突觸定向伸向損傷部位。

• 炎癥響應：腹腔注射 LPS 后，hMGs 從分枝狀轉變為圓形、大量絲狀偽足的激活狀態。

這些行為特征跟經典的小鼠小膠質細胞研究報道完全一致，說明這些「人造」 的小膠質細胞功能上也是合格的。

4、疾病模型驗證 —— 患者來源細胞的應用

研究者進一步利用該模型開展疾病機制研究。從 3 名伴大頭畸形的自閉癥譜系障礙患者及 3 名正常對照個體中分別誘導獲得 iPSC，構建個性化類器官模型。結果顯示，ASD 患者類器官中的小膠質細胞出現顯著異常：胞體增大、突觸增粗、胞體表面出現大量絲狀偽足，提示細胞處于激活或應激狀態。

為進一步明確異常來源，研究者開展了交叉移植實驗：將正常個體來源的小膠質細胞移植至 ASD 類器官中，結果這些正常細胞同樣表現出異常形態。反之，將 ASD 患者來源的小膠質細胞移植至正常類器官中，其形態恢復正常。該結果直接證明：ASD 中小膠質細胞的異常并非細胞內在缺陷所致，而是由異常的大腦微環境誘導產生。這是首次在活體模型中為「環境誘導的免疫反應」提供直接證據。

主要研究結果

1、模型構建 —— 從體外「播種」到體內「成熟」

EMP 與前腦類器官共培養后，EMP 在 12 小時內高效整合并定位于皮質板樣區域，與人類胚胎發育過程一致。體外培養條件下，EMP 來源細胞存活率逐漸下降，至 13 周低于 5%，且不表達成熟標志物 P2RY12 和 TMEM119。將整合后的類器官移植至免疫缺陷小鼠大腦后，8 周后超過 99% 的細胞呈現高度分枝的靜息態形態，高表達 TMEM119 和 P2RY12，且類器官實現良好血管化，表明體內環境是小膠質細胞成熟的關鍵因素。

2、轉錄組軌跡 —— 小膠質細胞的發育路徑

研究者對移植后 6 周、11 周、24 周三個時間點的小膠質細胞進行單細胞測序（共 4,322 個細胞）。結果顯示，這些小膠質細胞沿著一條與人類胎兒小膠質細胞發育高度一致的軌跡成熟。從 6 周到 24 周，P2RY12、TMEM119、SALL1、CX3CR1 等穩態標志物表達持續上調，并鑒定出一個增殖性亞群（高表達 MKI67/RRM2），與人類胎兒大腦中的增殖性小膠質細胞亞群高度一致。

3、環境決定論 —— 人源環境塑造人源特征

這是整篇文章最核心的機制發現。研究者對比了兩種環境下的人源小膠質細胞轉錄組：一種是人腦類器官（iHBO 模型），另一種是直接移植到小鼠大腦（xMGs 模型）。

結果發現：人源環境中，小膠質細胞高表達人類/大動物特有基因（SLC8A1、VSIG4、IRAK3）；小鼠環境中，小膠質細胞反而開始表達小鼠特有基因（LY6E、TPI1）。這直接證明：小膠質細胞的物種特異性特征不是細胞自身固有的，而是由大腦微環境所塑造。

4、功能驗證與疾病應用

功能驗證：用雙光子顯微鏡在活體小鼠中實時觀察，發現 hMGs 的突觸以約 1.76 μm/min 的速度持續「巡邏」，激光損傷后 10 分鐘內定向伸向損傷部位，LPS 刺激后從分枝狀轉變為圓形激活態。這些行為與經典小膠質細胞研究完全一致。

疾病應用：在 ASD 患者來源模型中，hMGs 出現胞體增大、突觸增厚、大量絲狀偽足等異常。交叉移植實驗證明：正常人源 hMGs 移植到 ASD 類器官中也會變「壞」，而 ASD 患者 hMGs 移植到正常環境中則恢復正常。這直接證明：ASD 中小膠質細胞異常是由異常的大腦環境誘導的，而非細胞內在缺陷。

小編點評

這篇 Cell 的研究思路有幾個特別值得借鑒的地方。

1、體外構建與體內成熟相結合的策略

在類器官培養過程中，長期維持三維結構的活性與功能是常見挑戰。本研究表明，當類器官在體外出現中心壞死、細胞存活率下降等問題時，可考慮將類器官移植至動物體內，借助宿主血管系統與微環境完成后續的功能成熟。這種「體外構建結構、體內完成功能成熟」的兩步策略，可推廣至多種類器官模型，如肝臟類器官中免疫細胞的整合，或腸道類器官中神經-免疫互作的研究。

2、交叉移植實驗設計以區分內在與外在因素

在疾病機制研究中，某一細胞類型的異常表型可能源于細胞內在缺陷，也可能由外部微環境誘導。本研究采用交叉移植實驗（即將 A 來源的細胞移植至 B 來源的類器官中），通過觀察細胞表型的變化，有效區分了細胞自身與微環境的作用。該邏輯具有廣泛的遷移價值。例如，在研究環境污染物對神經發育的影響時，可在類器官移植前后分別進行暴露處理，以判斷其作用是直接損傷細胞，還是通過改變微環境間接發揮效應。

3、功能驗證應超越表型標志物的檢測

許多類器官研究以免疫熒光或單細胞轉錄組分析作為終點，重點在于確認目標細胞表達特定標志物。本研究在此基礎上進一步開展了體內功能驗證，包括突觸動態監測、損傷響應實驗和炎癥刺激下的形態變化分析。這些功能數據顯著提升了模型的生物學相關性與應用價值。即便缺乏雙光子顯微鏡等高端設備，功能驗證仍可通過其他方式實現，如電生理記錄神經元放電、鈣成像檢測細胞響應、吞噬實驗評估小膠質細胞活性等。關鍵在于證明細胞不僅「形態相似」，更具「功能一致性」。

4、研究思路的選擇：干濕結合策略

該研究發表于 2023 年，是類器官領域的重要成果。Gage 團隊在類器官移植方面具有長期積累，其 2018 年發表于《Nature Biotechnology》的研究已建立腦類器官移植的基本框架，而本研究進一步補充了小膠質細胞這一關鍵組分。

需要指出的是，該模型仍存在一定局限性。例如，移植所用免疫缺陷小鼠無法用于研究適應性免疫的參與；類器官中的血管來源于宿主小鼠而非人源，可能影響涉及人源血管信號通路的研究。盡管如此，這些限制并未削弱該模型在解析人源小膠質細胞發育與功能方面的核心價值。

對于經費有限或平臺條件不足的研究團隊，并非必須復現該研究的全部實驗環節。以環境暴露對小膠質細胞影響的研究為例，可優先采用網絡毒理學方法，利用公共數據庫進行靶點篩選與通路富集分析，作為前期預測手段。若預測結果指向具有明確生物學意義的信號通路（如 cGAS-STING 通路或鐵死亡相關通路），再進一步設計實驗進行驗證。這種 「 干濕結合 」 的研究路徑，有助于在資源有限的情況下提高研究效率與成果產出。

參考文獻：

Schafer ST, Mansour AA, Schlachetzki JCM, Pena M, Ghassemzadeh S, Mitchell L, Mar A, Quang D, Stumpf S, Ortiz IS, Lana AJ, Baek C, Zaghal R, Glass CK, Nimmerjahn A, Gage FH. An in vivo neuroimmune organoid model to study human microglia phenotypes. Cell. 2023 May 11;186(10):2111-2126.e20.

編輯：冷漠小 z

題圖來源：自制

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