Advanced Science (1區)｜精準打擊三陰性乳腺癌代謝弱點：藤黃酸共價抑制SHMT2，誘導線粒體崩潰與鐵死亡！(王繼剛/唐歡/張俊華)

2026年6月30日，天津中醫藥大學、中國中醫科學院中藥研究所/青蒿素研究中心、深圳市人民醫院、贛南醫科大學第一附屬醫院等團隊，在Advanced Science（中科院1區 Top，JCR Q1，最新影響因子 IF=14.1）在線發表題為 “Covalent Inhibition of SHMT2 by Gambogic Acid Induces Ferroptosis Through Mitochondrial Collapse in Triple-Negative Breast Cancer” 的研究論文。該文通訊作者為張俊華、唐歡和王繼剛；PDF顯示，該文于2025年10月14日投稿，2026年3月20日修回并接收。

該研究聚焦三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）缺乏有效靶向治療這一難點，從線粒體代謝和鐵死亡切入，發現天然產物藤黃酸（gambogic acid，GA）可選擇性殺傷 TNBC 細胞。機制上，GA 通過共價結合絲氨酸羥甲基轉移酶2（serine hydroxymethyltransferase 2，SHMT2）的關鍵半胱氨酸位點 Cys241，抑制 SHMT2 酶活性及其寡聚化，進而導致線粒體能量代謝崩潰、Nrf2/HO-1 軸激活、鐵離子過載和脂質過氧化，最終誘導鐵死亡。研究還顯示，SHMT2 在 TNBC 中高表達，并與腫瘤侵襲性和不良預后相關，提示 SHMT2 可能是 TNBC 可開發的代謝脆弱點。

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【摘 要】

三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是一類侵襲性較強的乳腺癌亞型，由于缺乏激素受體和 HER2 表達，靶向治療選擇有限，臨床結局較差。因此，發現新的治療脆弱點對于推進 TNBC 治療具有重要意義。

線粒體代謝已被認為是調控癌細胞存活和增殖的關鍵環節。其中，絲氨酸羥甲基轉移酶2（serine hydroxymethyltransferase 2，SHMT2）在線粒體一碳代謝中發揮核心作用，可為核苷酸生物合成提供一碳單位，并維持氧化還原穩態。盡管 SHMT2 在腫瘤代謝中的重要性已得到認識，但其在 TNBC 中的功能作用和治療潛力仍缺乏充分研究。

本研究表明，藤黃酸（gambogic acid，GA）是一種具有抗癌活性的天然產物，可通過共價靶向 SHMT2，對 TNBC 細胞產生強效且具有選擇性的細胞毒作用。GA 特異性結合 SHMT2 的關鍵半胱氨酸殘基 Cys241，抑制 SHMT2 酶活性并破壞線粒體功能。這一過程導致細胞生物能量崩潰、Nrf2/HO-1 軸激活、鐵過載以及鐵死亡發生。鐵死亡是一種非凋亡性細胞死亡方式，近年來被認為具有重要治療潛力。

通過整合化學蛋白質組學和機制研究，作者揭示了一條新的 SHMT2-線粒體-Nrf2/HO-1-鐵死亡軸，解釋了 GA 的抗 TNBC 活性。此外，SHMT2 在 TNBC 中過表達，并與腫瘤侵襲性和不良預后相關，提示其可作為代謝性癌基因和潛在藥物靶點。上述發現確立了 GA 作為新型共價 SHMT2 抑制劑的地位，并為利用代謝脆弱性克服 TNBC 治療抵抗提供了新的研究框架。

關鍵詞：化學蛋白質組學；鐵死亡；藤黃酸；線粒體代謝；靶點鑒定；三陰性乳腺癌

01

研究背景及科學問題

三陰性乳腺癌（TNBC）被定義為缺乏雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和 HER2 表達的一類乳腺癌，是一種侵襲性強且臨床處理具有挑戰性的乳腺癌亞型。TNBC 約占所有乳腺癌病例的15%–20%，常與不良預后相關，表現為早期復發、較高轉移傾向以及乳腺癌亞型中較短的總體生存期。其不良臨床進程主要源于缺乏可靶向的分子驅動因素，因此無法使用在其他乳腺癌亞型中有效的內分泌治療和 HER2 靶向治療。由此，全身化療仍是 TNBC 治療的主要方式。然而，化療療效常受到原發性或獲得性耐藥、顯著毒性以及遠處復發高發的限制。對于晚期或轉移性 TNBC 患者而言，預后尤其嚴峻，中位總體生存期通常不足24個月，過去十余年改善有限。這一持續存在的治療缺口提示，亟需開發新的、有效的、具有靶向性的治療策略，以利用 TNBC 特有的分子脆弱性。

鐵死亡是一種鐵依賴性調控性細胞死亡方式，其特征是有害脂質過氧化物累積。近年來，鐵死亡被認為可能成為包括 TNBC 在內多種癌癥的潛在治療策略。鐵死亡在機制上不同于凋亡，主要受細胞抗氧化系統和鐵代謝系統調控，例如谷胱甘肽（glutathione，GSH）/谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）通路和鐵穩態調控。越來越多證據表明，鐵死亡是一種內源性腫瘤抑制機制，可與多種腫瘤抑制因子協同作用。值得注意的是，TNBC 具有與鐵死亡敏感性升高相關的特定分子特征，這提示主動誘導鐵死亡或許可作為克服該亞型治療抵抗的一種可行策略。

線粒體是細胞代謝和氧化還原穩態的核心調節器，在 TNBC 發生發展和鐵死亡執行過程中均發揮多層面作用。在 TNBC 中，線粒體代謝酶和線粒體動力學失調可促進代謝重編程，支持腫瘤生長和侵襲性表型。尤其是線粒體功能障礙，可通過擾亂鐵穩態、增加活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成并削弱抗氧化防御，成為觸發鐵死亡的重要因素。因此，靶向關鍵線粒體代謝酶，使其發生功能障礙并誘發鐵死亡，是 TNBC 治療中具有潛力的方向。

SHMT2 是線粒體一碳代謝中的關鍵酶，能夠支持核苷酸生物合成和氧化還原平衡，從而維持癌細胞存活和增殖所需的重要通路。SHMT2 在乳腺癌中常發生擴增，并與不良預后相關，尤其在 ER 陰性亞型中更為突出。SHMT2 抑制與線粒體功能障礙和 ROS 累積有關，而這些正是鐵死亡誘導的重要特征。然而，SHMT2 抑制與 TNBC 鐵死亡之間是否存在直接因果關系尚未得到明確證明；能夠利用這一脆弱性的強效、選擇性 SHMT2 抑制劑也仍然缺乏。因此，解決這一問題對于開發線粒體靶向、鐵死亡誘導型 TNBC 治療策略具有重要意義。

藤黃酸（gambogic acid，GA）是一種天然多異戊烯基氧雜蒽酮類化合物，來源于藤黃（Garcinia hanburyi）樹脂。既往研究顯示，GA 對肺癌、前列腺癌、肝癌和血液系統腫瘤等多種癌癥具有廣泛抗腫瘤作用。這一強效生物活性推動了人們對其分子作用機制的研究。已有多個 GA 蛋白靶點被鑒定，包括熱休克蛋白90（Hsp90）、泛素特異性蛋白酶2（USP2）和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶（6PGD），提示 GA 可影響蛋白折疊、泛素信號和磷酸戊糖途徑代謝。值得注意的是，GA 含有 α,β-不飽和羰基結構，使其可作為親電性 Michael 受體，與靶蛋白中的親核性半胱氨酸殘基發生共價修飾。這類機制正日益被認為是設計強效、選擇性抑制劑的重要策略。

盡管已有上述進展，GA 在 TNBC 中的治療潛力、特異性分子靶點以及在這一侵襲性亞型中的作用機制仍未被充分探索。雖然 GA 在多種癌癥模型中表現出細胞毒性，但其對 TNBC 的活性尚未經過系統表征，其在 TNBC 背景下的共價靶點圖譜也并不清楚。尤其是 GA 的反應性藥效團是否能夠結合 TNBC 中具有特定背景依賴性的全新靶點，特別是與線粒體脆弱性或鐵死亡有關的靶點，仍有待深入研究。

本研究表明，GA 可通過共價靶向關鍵線粒體代謝酶 SHMT2，有效抑制 TNBC 進展，從而誘導線粒體功能障礙并觸發鐵死亡。作者采用針對反應性半胱氨酸的化學蛋白質組學方法，將 SHMT2 鑒定為 GA 在 TNBC 細胞中的主要共價靶點。機制驗證進一步證實，GA 可在 Cys241 位點共價修飾 SHMT2，從而抑制其酶學功能和形成寡聚體的能力。SHMT2 被抑制后，線粒體一碳代謝受到干擾，引發生物能量崩潰、抗氧化防御受損以及線粒體結構破壞。線粒體衰竭繼而激活 Nrf2/HO-1 應激反應通路，促進血紅素降解和鐵釋放。由此產生的鐵過載與抗氧化能力下降共同推動脂質過氧化過度累積，最終導致鐵死亡。

重要的是，作者在體內也驗證了這一機制，證明 GA 可顯著抑制原位 TNBC 腫瘤生長和肺轉移。此外，研究還發現 SHMT2 過表達是 TNBC 的一個特征，并與不良臨床預后相關；SHMT2 在維持線粒體完整性、防止鐵死亡和支持腫瘤進展中具有關鍵促癌作用。總體而言，這些發現揭示了 GA 的一種新的線粒體靶向、鐵死亡誘導機制，為其作為 TNBC 治療候選物的進一步開發提供了依據，也將 SHMT2-鐵死亡軸確立為治療抵抗性 TNBC 中基礎且可干預的脆弱點。

02

重要發現及亮點

藤黃酸在體外有效抑制 TNBC 細胞增殖

GA 是來源于藤黃干燥樹脂的天然化合物，已有研究提示其具有抗炎和抗癌潛力，但其針對 TNBC 的療效和具體機制此前尚未得到充分闡明。為評估 GA 的抗 TNBC 潛力，研究者首先在一組乳腺癌細胞系中檢測其細胞毒性，并通過 CCK-8 實驗測定半數抑制濃度（IC50）。結果顯示，與非 TNBC 細胞系相比，GA 對 TNBC 細胞系 4T1、MDA-MB-231 和 Hs578T 表現出更強細胞毒性，IC50 均低于1 μM；而對正常乳腺上皮細胞 MCF-10A 以及 ER 陽性乳腺癌細胞 MCF-7、T47D 的作用相對較弱。這種對 TNBC 細胞更明顯的選擇性提示，GA 值得進一步開展體外抗癌活性研究。

隨后，研究者評估了 GA 對 TNBC 關鍵惡性表型的影響。GA 處理顯著抑制 MDA-MB-231 和 Hs578T 細胞增殖；同時，GA 劑量依賴性抑制細胞克隆形成，提示其削弱了 TNBC 細胞的長期增殖潛力和克隆形成能力。劃痕實驗和 Transwell Matrigel 侵襲實驗進一步顯示，GA 明顯抑制 TNBC 細胞遷移和侵襲能力。為更好模擬腫瘤微環境，作者還采用三維多細胞腫瘤球模型。GA 處理后，腫瘤球體積明顯減小，同時 PI 紅色熒光增強，提示非活細胞或死亡細胞增多；對照組則主要呈現 Calcein-AM 標記的綠色活細胞信號。總體來看，GA 在體外對 TNBC 細胞及腫瘤樣結構具有強效抗增殖和細胞毒作用。

圖1：藤黃酸（GA）在體外有效抑制 TNBC 細胞增殖。（A）GA 的化學結構，GA 是來源于藤黃（Garcinia hanburyi）干燥樹脂的化合物。（B）非 TNBC 細胞系（MCF-10A、MCF-7、T47D）和 TNBC 細胞系（MDA-MB-231、Hs578T、4T1）經 GA 處理后的細胞活力劑量-反應曲線。（C，D）采用 CCK-8 實驗檢測 GA（0.6 μM）或 DMSO 對照處理后 TNBC 細胞的增殖情況。（E，F）不同濃度 GA 處理后 TNBC 細胞克隆形成的代表性圖像及定量分析。（G，H）不同濃度 GA 處理后 TNBC 細胞侵襲實驗的代表性圖像及定量分析。（I，J）不同濃度 GA 處理后 TNBC 細胞遷移實驗的代表性圖像及定量分析。（K，L）采用流式細胞術定量檢測不同濃度 GA 處理后 TNBC 細胞凋亡。凋亡率計算為早期凋亡細胞（Annexin V+/PI?）和晚期凋亡細胞（Annexin V+/PI+）之和。（M）不同濃度梯度 GA 或 DMSO 處理后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察 TNBC 三維多細胞腫瘤球的代表性熒光圖像。活細胞以 Calcein-AM 標記，呈綠色熒光；死亡細胞以 PI 標記，呈紅色熒光。數據以 mean ± SEM 表示（n = 3）。相對于 DMSO 對照組的統計學顯著性通過單因素 ANOVA 判定。顯著性水平表示為 *p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。

GA 在體內顯著抑制 TNBC 腫瘤生長和肺轉移

為驗證體外結果的治療潛力，研究者構建了同系原位乳腺腫瘤模型，即將小鼠 TNBC 4T1 細胞植入 BALB/c 小鼠乳腺脂肪墊。腫瘤形成后，小鼠被分為4組：生理鹽水對照組、紫杉醇（paclitaxel，PTX，10 mg/kg）組、低劑量 GA（2 mg/kg）組和高劑量 GA（6 mg/kg）組，均通過腹腔注射給藥。GA 處理以劑量依賴方式強效抑制原發腫瘤生長。治療過程中腫瘤體積測量和終點腫瘤重量均顯示，GA 相較于生理鹽水對照組可劑量依賴性抑制腫瘤生長。值得注意的是，高劑量 GA 的抗腫瘤效果優于 PTX，提示其具有進一步開發潛力。

組織病理和免疫組化結果進一步支持上述發現。H&E 染色顯示，生理鹽水組腫瘤細胞核密集、組織結構相對完整；而 PTX 和 GA 處理組腫瘤組織細胞密度下降，出現核固縮和廣泛壞死，其中高劑量 GA 組細胞毒作用最明顯。增殖標志物 Ki-67 免疫組化顯示，PTX 和 GA 處理均明顯降低 Ki-67 陽性細胞比例，與腫瘤生長受抑一致。

考慮到 TNBC 具有高度轉移性，尤其易發生肺轉移，研究者進一步采用實驗性肺轉移模型評估 GA 的抗轉移作用。原位 4T1 腫瘤小鼠經靜脈注射表達熒光素酶的 4T1 細胞，并采用相同給藥方案處理。結果顯示，GA 以劑量依賴方式顯著降低肺轉移負荷。生物發光成像、肺表面可見結節計數、H&E 肺組織學分析以及 Ki-67 免疫組化均顯示，與對照組相比，GA 處理小鼠肺部轉移灶明顯減少。高劑量 GA 的抗轉移活性也強于 PTX。總體而言，體內實驗表明 GA 可有效抑制 TNBC 原發腫瘤生長和肺轉移，為其作為 TNBC 治療候選物提供了較強的臨床前證據。

圖2：GA 在體內強效抑制 TNBC 腫瘤生長和肺轉移。（A）4T1 荷瘤 BALB/c 小鼠治療方案示意圖。（B）治療期間記錄的腫瘤生長曲線。（C）剝離腫瘤的代表性圖像。（D，E）終點腫瘤重量及相應腫瘤抑制率。（F）第15天收集的腫瘤切片經 H&E 染色和 Ki-67 免疫組化進行組織病理學評價。（G）同時攜帶原發腫瘤和轉移腫瘤的 BALB/c 小鼠治療方案示意圖。（H，I）肺轉移灶代表性圖像及相應定量分析，紅色圓圈標示肺轉移灶。（J）肺組織切片的 H&E 染色和 Ki-67 染色。數據以 mean ± SEM 表示（n = 6）。相對于生理鹽水對照組或 PTX 組的統計學顯著性通過單因素 ANOVA 判定。顯著性水平表示為 ****p < 0.0001，與對照組相比；### < 0.0001，與 PTX 組相比。

化學蛋白質組學鑒定 SHMT2 是 GA 在 TNBC 細胞中的主要共價結合靶點

GA 分子中含有 α,β-不飽和羰基結構，因此可作為親電性 Michael 受體，與靶蛋白中的親核性半胱氨酸殘基發生共價修飾。鑒于反應性半胱氨酸殘基在酶催化結構域和細胞信號機制中的重要性，研究者推測，GA 的強效抗 TNBC 活性可能源于其與關鍵功能性半胱氨酸硫醇的共價結合。為全面描繪 GA 敏感半胱氨酸譜并鑒定其分子靶點，作者采用基于半胱氨酸反應性的競爭性化學蛋白質組學策略。

在 TNBC 細胞內原位預處理 GA 后，再用半胱氨酸特異性探針 IAA-P 標記，結果顯示熒光信號隨 GA 劑量增加而下降，說明 GA 可有效競爭 IAA-P 對半胱氨酸位點的標記。隨后，作者采用 DBIA 探針開展定量化學蛋白質組學分析。GA 處理組或對照組 TNBC 細胞蛋白經過原位 DBIA 標記、富集、胰蛋白酶消化、TMT 標記和 LC-MS/MS 分析后，獲得了 GA 敏感半胱氨酸殘基的全局圖譜。對 GA 處理后 DBIA 標記減少、即對照/GA 信號比值升高的蛋白進行優先篩選后，SHMT2 因其高可信度、劑量依賴性和生物學相關性被選為后續研究對象。SHMT2 在競爭性降低幅度和劑量反應行為方面均位居前列，提示其可能是 GA 在 TNBC 細胞中的主要共價靶點。

生物信息學分析進一步支持這一發現。GA 敏感蛋白主要富集于細胞核、細胞質和線粒體；GO 和 KEGG 分析顯示，這些蛋白顯著富集于細胞代謝相關通路，尤其是氨基酸代謝和一碳代謝。作為線粒體一碳代謝關鍵酶，SHMT2 與上述亞細胞定位和通路富集結果高度一致。進一步的免疫熒光共定位顯示，IAA-P 標記信號與內源性 SHMT2 在 TNBC 細胞中高度重疊，而 GA 預處理顯著降低共定位信號。細胞 pull-down 實驗也顯示，在競爭條件下，GA 處理明顯減少 DBIA 對 SHMT2 的富集。體外重組人 SHMT2 標記實驗證實，GA 可競爭 IAA-P 對 rhSHMT2 的標記；經典半胱氨酸烷基化劑 IAA 也可劑量依賴性抑制 IAA-P 對 rhSHMT2 的標記，進一步證明 GA 修飾 SHMT2 的半胱氨酸殘基。作者還通過序列比對和 pull-down Western blot 驗證了 SHMT1 與 SHMT2 的結構差異，結果顯示 GA 不結合 SHMT1，而是與 SHMT2 形成共價鍵，提示 GA-SHMT2 相互作用具有特異性。

圖3：化學蛋白質組學分析鑒定 SHMT2 是 GA 在 TNBC 細胞中的主要共價靶點。（A）利用基于活性的半胱氨酸反應性化學蛋白質組學分析鑒定 GA 靶點的總體流程。（B）GA 在 TNBC 細胞中原位競爭 IAA-P 對蛋白的標記。Flu：熒光圖像；CBB：考馬斯亮藍染色。（C）通過化學蛋白質組學分析鑒定 TNBC 細胞中的潛在 GA 靶點。（D）不同濃度 GA 對 SHMT2 與 IAA 結合的競爭效應。（E）GA 敏感蛋白的亞細胞分布。（F）GA 敏感蛋白的生物信息學分析。（G，H）免疫熒光顯示，GA 可降低 TNBC 細胞中 SHMT2 與 IAA-P 的結合。TAMRA：四甲基羅丹明疊氮化物。（I）通過 pull-down 和 Western blot 實驗驗證 GA-SHMT2 相互作用。（J）凝膠內熒光實驗顯示，GA 可與 IAA-P 競爭結合重組人 SHMT2（rhSHMT2）蛋白。數據以 mean ± SEM 表示（n = 3）；**p < 0.01，與 Ctrl 相比。

GA 共價修飾 Cys241，抑制 SHMT2 催化活性和寡聚化

在明確 SHMT2 是 GA 的直接共價靶點后，研究者進一步定位具體修飾位點，并闡明 GA 結合后的結構和功能后果。細胞熱遷移實驗（CETSA）顯示，GA 處理顯著提高 SHMT2 熱穩定性，使其在溫度梯度下相比 DMSO 對照更能抵抗熱誘導變性，說明 GA 在細胞內可與 SHMT2 形成穩定復合物。隨后，作者對與 GA 孵育后的重組人 SHMT2 進行 LC-MS/MS 分析，明確鑒定 Cys241 是主要共價加合位點。分子對接模擬進一步顯示，GA 的 α,β-不飽和羰基結構中的親電碳處于有利位置，可與 Cys241 的巰基形成共價連接。

為功能性驗證 Cys241 在 GA 結合中的作用，研究者構建了 Cys241 突變為丙氨酸的 SHMT2-C241A 突變體。體外 IAA-P 標記顯示，SHMT2-C241A 的信號明顯低于野生型 SHMT2，說明 Cys241 是高度反應性位點。更重要的是，GA 可強效競爭野生型 SHMT2 的 IAA-P 標記，卻不能競爭 SHMT2-C241A 突變體的標記。微量熱泳動（MST）檢測顯示，GA 與野生型 SHMT2 具有較強結合，KD 為0.15 μM；而與 C241A 突變體的結合顯著減弱，KD 為36.04 μM。這些結果共同證明，Cys241 是介導 GA 結合的主要殘基。

進一步酶活檢測顯示，GA 可劑量依賴性抑制 rhSHMT2 酶活，EC50 為0.15 μM。與此同時，GA 處理并未改變 SHMT2 表達量。C241A 突變體催化活性嚴重受損，幾乎喪失催化絲氨酸轉化為甘氨酸的能力，說明 Cys241 對 SHMT2 功能至關重要。圓二色譜（CD）結果顯示，GA 結合和 C241A 突變均引起 SHMT2 二級結構顯著改變，表現為螺旋結構比例增加，而 β-折疊和無規卷曲成分減少。由于 SHMT2 需要依賴磷酸吡哆醛（PLP）從無活性的單體轉變為活性四聚體，作者進一步推測 Cys241 擾動會破壞這一轉換。DSS 化學交聯實驗驗證了這一假設：野生型 SHMT2 可有效形成四聚體，而 GA 結合后的野生型 SHMT2 和 SHMT2-C241A 主要保持單體狀態。上述結果說明，GA 通過共價修飾 SHMT2 功能關鍵殘基 Cys241，誘導構象改變，阻礙 PLP 依賴的單體向四聚體轉換，最終抑制 SHMT2 酶活性。

圖4：GA 共價修飾 Cys241，從而抑制 SHMT2 催化活性和寡聚化。（A，B）CETSA-Western blot（WB）實驗（A）及定量分析（B）證明 GA 與 SHMT2 結合。（C）通過 LC-MS/MS 鑒定 SHMT2 上的 GA 結合位點；分子對接顯示 GA 與 SHMT2 的 Cys241 形成共價鍵。（D）凝膠內熒光實驗檢測重組人 SHMT2（rhSHMT2）及其突變體 SHMT2-C241A 的 IAA-P 標記。（E）通過微量熱泳動（MST）測定 GA 與 rhSHMT2 及其突變體的結合親和力。（F）GA 顯著抑制 SHMT2 酶活性。（G）GA 抑制 SHMT2 酶活性的半數最大抑制濃度（EC50）。（H）C241 突變顯著降低 SHMT2 酶活性。（I，J）在有或無 GA 條件下，SHMT2 及其突變體的圓二色譜（I）和二級結構定量（J）。（K）GA 處理和 C241 突變顯著損害 SHMT2 四聚體形成。（L）示意模型顯示，GA 在 Cys241 位點共價結合 SHMT2，從而阻止四聚體裝配并顯著抑制酶活性。數據以 mean ± SEM 表示（n = 3）；***p < 0.001，與 DMSO 相比。

全局蛋白質組學提示線粒體功能障礙和鐵死亡是 GA 抑制 SHMT2 后的關鍵下游事件

在證實 GA 可共價抑制 SHMT2 后，研究者進一步解析 GA 處理引起的整體細胞反應，并尋找其抗 TNBC 作用的關鍵下游通路。作者對 GA 或 DMSO 對照處理的 MDA-MB-231 細胞進行了定量全局蛋白質組學分析，共鑒定到6151種蛋白。差異表達分析顯示，GA 處理后蛋白質組發生廣泛重塑，其中690種蛋白顯著下調，325種蛋白顯著上調。值得注意的是，血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）是上調最顯著的蛋白，豐度增加約60倍，強烈提示 HO-1 相關調控軸參與 GA 作用機制。

基因集富集分析（GSEA）顯示，GA 處理顯著抑制能量產生所必需的線粒體代謝通路，包括核苷二磷酸代謝、氧化磷酸化和線粒體呼吸；與此同時，GA 明顯激活細胞應激反應通路，尤其是 Keap1-Nrf2 信號軸、鐵死亡和凋亡。富集曲線進一步證實，GA 處理細胞中氧化磷酸化顯著下調，Keap1-Nrf2 信號級聯強烈激活，鐵死亡顯著誘導。聚類熱圖顯示，Nrf2 及其下游效應因子 HO-1、NQO1 明顯升高，而 Nrf2 主要負調控因子 Keap1 表達下降。與此同時，線粒體電子傳遞鏈關鍵組分 NDUFA2 等顯著降低，支持 GA 損害氧化磷酸化的結論。對1015種顯著變化蛋白的 GO 和 KEGG 分析進一步顯示，相關通路包括氧化磷酸化、線粒體呼吸、核糖核苷酸生物合成、氧化應激反應、鐵死亡和 Keap1-Nrf2 通路。總體而言，蛋白質組學結果支持這樣一個模型：GA 介導的 SHMT2 抑制可誘導線粒體功能障礙，激活 Nrf2/HO-1 應激軸，并最終觸發鐵死亡。

圖5：全局蛋白質組學分析提示，線粒體功能障礙和鐵死亡是 GA 介導 SHMT2 抑制后的關鍵下游效應。（A）GA 處理 TNBC 細胞后進行蛋白質組學分析的總體流程。（B）火山圖顯示 GA 處理組與 DMSO 對照組之間的差異表達蛋白（DEPs）：粉色表示上調，灰色表示無變化，藍色表示下調。（C）GSEA 鑒定 GA 在 TNBC 細胞中調控的多條信號通路。（D，F）GA 在 TNBC 細胞中顯著抑制氧化磷酸化（D），激活 Keap1-Nrf2 信號通路（E），并誘導鐵死亡（F）。（G）GO 和 KEGG 分析顯示，GA 通過調控多條信號通路抑制 TNBC 進展。

GA 抑制 SHMT2 后誘導 TNBC 細胞發生廣泛線粒體功能障礙

SHMT2 是線粒體一碳代謝的核心調節因子，可引導絲氨酸分解代謝，支持核苷酸生物合成，通過 GSH 生成維持氧化還原穩態，并為線粒體呼吸和能量產生提供關鍵一碳單位。基于蛋白質組學提示的線粒體功能障礙，研究者推測，GA 介導的 SHMT2 共價抑制會干擾這些關鍵代謝過程，導致嚴重且不可逆的線粒體損傷。

首先，作者通過檢測 NAD+/NADH 比值評估線粒體氧化還原狀態。GA 處理顯著降低該比值，提示線粒體環境更偏還原狀態，氧化代謝受損。與此一致，細胞內 ATP 水平在 GA 暴露后出現嚴重、劑量依賴性下降，反映氧化磷酸化功能受損，并與蛋白質組學中電子傳遞鏈亞基表達下降相吻合。考慮到 SHMT2 在為 GSH 生物合成提供甘氨酸方面具有重要作用，研究者進一步檢測細胞內 GSH，結果發現 GA 處理顯著耗竭 TNBC 細胞中的 GSH，將 SHMT2 抑制與主要線粒體抗氧化防御崩潰直接聯系起來。

線粒體膜電位（ΔΨm）檢測采用 JC-1 探針完成。健康線粒體中，JC-1 聚集體發出紅色熒光；當 ΔΨm 喪失時，JC-1 以單體形式發出綠色熒光。GA 處理導致 ΔΨm 明顯且濃度依賴性消散，表現為綠色/紅色熒光比值升高，說明維持 ATP 生成所需的質子梯度遭到破壞。為觀察線粒體結構改變，研究者使用線粒體特異性染料 PK Mito Red 進行共聚焦顯微成像。對照組細胞中線粒體網絡廣泛互連；GA 處理細胞中線粒體明顯碎片化，呈點狀、縮短的細胞器結構，并喪失正常管狀形態。GA 還顯著抑制 TNBC 細胞的氧耗率（OCR），包括基礎呼吸和最大呼吸。綜上，這些多參數分析表明，GA 通過共價抑制 SHMT2，在 TNBC 細胞中引發災難性的線粒體形態和功能崩潰。

圖6：GA 通過抑制 SHMT2 誘導 TNBC 細胞發生全面線粒體功能障礙。（A）示意圖顯示 SHMT2 在線粒體關鍵代謝過程中的作用。（B，C）GA 顯著降低 TNBC 細胞中的 NAD+/NADH 比值。（D，E）GA 顯著降低 TNBC 細胞中的 ATP 水平。（F，G）GA 顯著降低 TNBC 細胞中的 GSH 水平。（H–K）GA 處理后 TNBC 細胞線粒體膜電位評估。（L，M）GA 處理后 TNBC 細胞線粒體形態分析。（N）示意圖描述 GA 介導 SHMT2 共價抑制，導致 TNBC 細胞不可逆的線粒體形態功能崩潰。數據以 mean ± SEM 表示（n = 3）。相對于 DMSO 對照組的統計學顯著性通過單因素 ANOVA 判定。顯著性水平表示為 *p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。

線粒體功能障礙激活 Nrf2/HO-1 軸，并導致鐵過載依賴性鐵死亡

綜合蛋白質組學和線粒體功能分析表明，線粒體崩潰是 Nrf2 通路激活和鐵死亡啟動之前的關鍵事件。作者推測，GA 介導的 SHMT2 抑制所誘導的線粒體應激，是 Nrf2 激活的主要觸發因素，進一步導致 HO-1 上調、鐵過載和鐵死亡。Western blot 結果顯示，GA 處理后 TNBC 細胞中 Nrf2 及其主要下游效應因子 HO-1、NQO1 呈劑量依賴性上調，與蛋白質組學篩選中 HO-1 強烈上調相一致。盡管 Nrf2 激活通常具有細胞保護作用，但 HO-1 在鐵死亡中具有雙重角色。GA 可在短時間內快速并強烈誘導 TNBC 細胞中 HO-1 水平升高。HO-1 通過降解血紅素釋放游離 Fe2+，在氧化還原穩態失衡條件下可催化脂質過氧化并促進鐵死亡。

為直接評估細胞內 Fe2+ 累積，研究者使用 Fe2+ 特異性熒光探針 FerroOrange 并結合流式細胞術檢測。結果顯示，GA 處理誘導 TNBC 細胞中不穩定 Fe2+ 水平明顯且濃度依賴性升高，建立了 GA 誘導 HO-1 表達與細胞內鐵過載之間的機制聯系。鐵過載，尤其是 Fe2+ 升高，可通過 Fenton 反應催化細胞膜中多不飽和脂肪酸（PUFAs）過氧化，從而驅動鐵死亡。作者采用 BODIPY C11 等多種方法評估脂質過氧化。流式細胞術顯示，GA 處理后氧化探針熒光顯著增加，并呈劑量依賴性；共聚焦顯微鏡進一步觀察到 GA 處理 TNBC 細胞中廣泛而強烈的綠色熒光，提示脂質過氧化升高。生化檢測也顯示，脂質過氧化產物 MDA 和 4-HNE 在 GA 處理后明顯升高。

為明確鐵死亡是否是 GA 誘導細胞毒性的主要方式，作者使用經典鐵死亡抑制劑開展藥理學救援實驗，包括鐵螯合劑去鐵胺（deferoxamine，DFO）、自由基捕獲抗氧化劑 liproxstatin-1（Lip-1）、GSH 前體 N-乙酰半胱氨酸（NAC）以及外源性 GSH。所有處理均顯著減輕 GA 誘導的 TNBC 細胞死亡，證明鐵依賴性脂質過氧化在 GA 致死機制中具有關鍵作用。透射電子顯微鏡（TEM）進一步顯示，GA 處理細胞出現典型鐵死亡相關線粒體異常，包括線粒體體積減小、膜密度升高、嵴丟失以及外膜破裂，且未見經典凋亡形態。體內腫瘤組織檢測也顯示，GA 處理劑量依賴性抑制腫瘤裂解液總 SHMT 酶活性，顯著提高脂質過氧化水平，并通過免疫組化證實體內 Nrf2/HO-1 通路激活，表現為 Nrf2 和 HO-1 上調、Keap1 表達降低。上述結果說明，由線粒體功能障礙驅動的 Nrf2/HO-1 通路激活會引發細胞內鐵過載，進而促進致死性脂質過氧化和鐵死亡，構成 GA 強效抗 TNBC 活性的終末效應機制。

圖7：GA 驅動的線粒體功能障礙激活 Nrf2/HO-1 軸，并最終導致鐵過載依賴性鐵死亡。（A，B）Western blot 分析 GA 處理前后 TNBC 細胞中 Keap1、Nrf2、HO-1 和 NQO1 的表達。（C，D）GA 以劑量依賴方式增加 TNBC 細胞中的 Fe2+ 水平。（E，F）GA 以劑量依賴方式升高 TNBC 細胞中的脂質過氧化水平。（G，H）共聚焦顯微鏡顯示 GA 處理后 TNBC 細胞脂質過氧化水平變化。比例尺 = 100 μm。（I，J）GA 處理前后 TNBC 細胞中 4-HNE 的表達水平。（K，L）經典鐵死亡抑制劑可拯救 GA 誘導的 TNBC 細胞死亡。（M，N）有或無 GA 處理條件下 TNBC 細胞的透射電子顯微鏡圖像。比例尺 = 1 μm 或 5 μm。數據以 mean ± SEM 表示（n = 3）。相對于 DMSO 對照組的統計學顯著性通過單因素 ANOVA 判定。顯著性水平表示為 *p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。

SHMT2 是 GA 誘導鐵死亡所必需的關鍵脆弱點

盡管前述結果已建立 GA 介導 SHMT2 抑制與鐵死亡誘導之間的機制聯系，但作者進一步驗證 SHMT2 是否是該細胞死亡途徑所必需的功能節點。研究者通過慢病毒轉導特異性 shRNA，在 MDA-MB-231 和 Hs578T 細胞中建立穩定 SHMT2 敲低細胞系。首先評估 SHMT2 缺失對 GA 敏感性的影響。結果顯示，SHMT2 敲低顯著削弱 GA 對兩種 TNBC 細胞系的抗增殖活性。相反，在內源性 SHMT2 較低的 MCF-7 和 T47D 乳腺癌細胞中，SHMT2 過表達增加了細胞對 GA 的敏感性。這說明 SHMT2 不僅是 GA 的靶點，而且是介導 GA 誘導細胞毒性的必要因素。

體內成瘤實驗進一步顯示，在接種 shNC 對照腫瘤的小鼠中，GA 給藥可顯著降低腫瘤體積和重量；而在接種 SHMT2 敲低腫瘤的小鼠中，GA 的抑瘤作用明顯減弱，GA 組與生理鹽水組之間腫瘤參數無顯著差異。由于 Nrf2/HO-1 軸在 GA 觸發鐵死亡中具有關鍵作用，作者進一步檢測 SHMT2 敲低細胞中該通路狀態。結果顯示，單獨敲低 SHMT2 即可顯著激活 Nrf2 通路，表現為 HO-1 和 NQO1 蛋白升高。這提示 SHMT2 缺失本身足以造成細胞應激，并啟動這一保護性和執行性信號級聯。重要的是，在 SHMT2 敲低細胞中，GA 處理不能進一步增強 Nrf2 通路激活，說明 SHMT2 是 GA 調動該調控軸的主要通道。

隨后，研究者檢測 SHMT2 敲低細胞中經典鐵死亡標志物。SHMT2 缺失本身即可顯著誘導不穩定 Fe2+ 累積，其水平接近 GA 處理對照細胞所見水平，而 GA 處理不能進一步提高 SHMT2 敲低細胞中的 Fe2+。BODIPY C11 流式檢測顯示，SHMT2 敲低細胞中脂質過氧化明顯升高，程度類似于 GA 處理對照細胞；再次加入 GA 無疊加效應。類似地，SHMT2 敲低升高脂質過氧化副產物 MDA 和 4-HNE，同時降低細胞內 GSH，這些變化與 GA 處理對照細胞的生化效應相似；GA 對 SHMT2 敲低細胞中的這些鐵死亡指標不再產生進一步影響。上述結果表明，遺傳性去除 SHMT2 能夠模擬 GA 處理誘導的鐵死亡效應。GA 無法在 SHMT2 敲低細胞中進一步增強鐵死亡或 Nrf2 信號，進一步確立 SHMT2 是介導 GA 誘導 TNBC 鐵死亡的關鍵且不可替代靶點。Cys241 位點的敲低救援實驗還證明，該位點對 SHMT2 活性和 TNBC 細胞存活均不可或缺，再次支持 GA 通過 Cys241 共價結合 SHMT2 發揮抗 TNBC 作用。

圖8：SHMT2 是 GA 誘導鐵死亡所必需的關鍵分子，并代表 TNBC 的重要治療脆弱點。（A，B）SHMT2 敲低顯著降低 TNBC 細胞對 GA 的敏感性。（C）有或無 GA 處理條件下，由 SHMT2 敲低 TNBC 細胞形成的小鼠腫瘤代表性圖像。（D，E）無論是否接受 GA 處理，SHMT2 敲低均顯著激活 TNBC 細胞中的 Nrf2 信號通路。（F，G）SHMT2 敲低顯著增加 TNBC 細胞中的亞鐵離子水平，且不依賴 GA 處理。（H，I）SHMT2 敲低和 GA 處理對 TNBC 細胞脂質過氧化水平的影響。（J，K）SHMT2 敲低和 GA 處理對 TNBC 細胞 GSH 水平的影響。（L，M）SHMT2 敲低和 GA 處理對 TNBC 細胞 MDA 水平的影響。數據以 mean ± SEM 表示（n = 3）。顯著性水平表示為 *p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。

SHMT2 過表達是 TNBC 的特征，并通過抑制鐵死亡促進腫瘤進展

由于 GA 選擇性靶向 TNBC 細胞并主要通過 SHMT2 抑制發揮抗腫瘤作用，作者進一步探討 SHMT2 表達差異是否解釋了 TNBC 對 GA 的選擇性脆弱性。同時，SHMT2 敲低產生的明顯腫瘤抑制作用也提示 SHMT2 可能在 TNBC 中發揮促癌作用。Western blot 分析顯示，與非 TNBC 細胞，包括正常乳腺上皮細胞 MCF-10A 和 ER 陽性乳腺癌細胞 MCF-7、T47D 相比，多個 TNBC 細胞系 MDA-MB-231、Hs578T 和 4T1 中 SHMT2 蛋白水平顯著升高。TCGA、GSE5460 和 METABRIC 等大型臨床數據庫分析也顯示，TNBC 和 ER 陰性乳腺癌中 SHMT2 mRNA 表達顯著高于其他亞型。

臨床預后分析進一步顯示，SHMT2 高表達與患者不良預后相關。高 SHMT2 表達乳腺癌患者的總體生存明顯低于低表達患者，說明 SHMT2 是與侵襲性疾病表型相關的臨床標志物。為功能性驗證 SHMT2 在 TNBC 中的促癌作用，研究者使用穩定 SHMT2 敲低細胞模型進行實驗。SHMT2 缺失顯著抑制 TNBC 細胞增殖，降低克隆形成能力，并在 Matrigel 侵襲實驗中明顯削弱細胞侵襲潛力。盡管 SHMT2 敲低不影響三維多細胞腫瘤球的初始形成，但會顯著削弱其后續生長和擴張，提示其在更接近生理狀態的三維環境中也會降低腫瘤形成能力。

在鐵穩態方面，SHMT2 敲低顯著增加 TNBC 細胞內 Fe2+ 累積，提示 SHMT2 對維持鐵穩態具有重要作用。進一步分析顯示，SHMT2 敲低誘導致死性線粒體損傷，表現為線粒體膜電位崩潰和線粒體氧化狀態增強。外源性 GSH 可部分挽救線粒體膜電位喪失，但不能完全恢復到基線水平，提示 SHMT2 敲低同時損害了線粒體 GSH 生物合成。與此一致，SHMT2 敲低顯著增強 TNBC 細胞脂質過氧化，并降低細胞內 OCR。TEM 和共聚焦成像顯示，與 shNC 對照細胞中的連續線粒體形態相比，SHMT2 敲低細胞出現廣泛線粒體碎片化、管狀網絡破壞以及點狀或球形腫脹樣細胞器。上述鐵穩態紊亂、線粒體損傷和脂質過氧化共同說明，SHMT2 功能缺失可在 TNBC 細胞中誘導鐵死亡。總體而言，SHMT2 過表達在 TNBC 中作為一種代謝保護機制，通過維持線粒體完整性和代謝穩態主動抑制鐵死亡，從而促進侵襲性腫瘤進展。TNBC 對 SHMT2 的這種促癌依賴性，凸顯了其作為治療脆弱點的重要意義，并驗證其是 GA 強效抗 TNBC 活性的主要靶點。

圖9：SHMT2 過表達是 TNBC 的特征，并通過抑制鐵死亡促進腫瘤進展。（A）不同亞型乳腺癌細胞中 SHMT2 蛋白表達水平。（B，C）利用 TCGA（B）和 GSE5460（C）數據集分析三陰性亞型（B）和 ER 陰性亞型（C）乳腺癌中的 SHMT2 表達。（D）按 SHMT2 高表達和低表達分層的乳腺癌患者總體生存分析。（E，F）通過 CCK-8 實驗測定 SHMT2 敲低 TNBC 細胞的增殖。（G，H）通過克隆形成實驗評估穩定 SHMT2 敲低后 TNBC 細胞的增殖能力。（I，J）穩定 SHMT2 敲低后 TNBC 細胞侵襲的代表性圖像（I）和定量分析（J）。（K，L）野生型和穩定 SHMT2 敲低 TNBC 細胞來源的多細胞腫瘤球生長曲線。（M）穩定 SHMT2 敲低顯著增加 TNBC 細胞中的亞鐵水平。（N，O）穩定 SHMT2 敲低明顯升高 TNBC 細胞中的脂質過氧化水平。（P，Q）透射電子顯微鏡（TEM）表征穩定 SHMT2 敲低后 TNBC 細胞線粒體形態和數量。（R，S）共聚焦顯微鏡分析穩定 SHMT2 敲低后 TNBC 細胞線粒體形態變化。數據以 mean ± SEM 表示（n = 3）。顯著性水平表示為 *p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。

機制示意圖總結：GA 靶向 SHMT2 誘導 TNBC 鐵死亡

綜合上述結果，研究提出了一條 GA 抑制 TNBC 的作用軸：GA 共價結合并抑制 SHMT2，擾亂線粒體一碳代謝和線粒體穩態；隨后線粒體功能障礙激活 Nrf2/HO-1 信號軸，引發鐵過載和脂質過氧化，最終觸發鐵死亡并抑制 TNBC 進展。這一機制把天然產物 GA 的抗 TNBC 活性與 SHMT2 代謝脆弱點、線粒體崩潰和鐵死亡聯系起來。

圖10：GA 通過靶向 SHMT2 抑制 TNBC 的機制示意圖。GA 共價結合并抑制 SHMT2，從而破壞一碳代謝和線粒體穩態。該抑制作用導致線粒體功能障礙、Nrf2/HO-1 信號軸激活，并誘導鐵過載和脂質過氧化，最終觸發鐵死亡并抑制 TNBC 進展。

【貢獻】★★★★★

總之，本研究將 SHMT2 鑒定為 TNBC 中一個關鍵代謝脆弱點，并確立 GA 是一種靶向該酶的共價抑制劑。研究顯示，GA 可選擇性結合 SHMT2 上具有功能重要性的半胱氨酸殘基 Cys241，破壞其酶活性和寡聚化，進而導致嚴重線粒體功能障礙。這種功能障礙激活 Nrf2/HO-1 抗氧化信號級聯，引發細胞內鐵過量、脂質過氧化增強，并誘導鐵死亡。

重要的是，研究證明 SHMT2 在 TNBC 中高度過表達，并且對維持線粒體完整性、抑制鐵死亡和促進腫瘤進展不可或缺。通過整合化學蛋白質組學、生物化學和功能學分析，作者揭示了一條新的 SHMT2-線粒體-Nrf2/HO-1-鐵死亡調控軸，該軸構成 GA 強效抗 TNBC 活性的基礎。

這項研究加深了對 TNBC 代謝機制和鐵死亡調控的理解，同時強調 SHMT2 作為治療靶點的潛力。GA 共價抑制 SHMT2 的發現，為開發利用鐵死亡誘導來應對侵襲性 TNBC 臨床挑戰的新型治療策略提供了重要基礎。

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