【PNAS】貌合神離！MIT馮國平團隊通過多模態分析方法揭示未定帶的細胞多樣性及分化回路

撰文：大仲馬

在大腦深處，丘腦腹側藏著一個不起眼卻“管得特寬”的神秘地帶——未定帶。在腦科學版圖里，它像個身份撲朔迷離的幕后工作者。抬手邁步、屏蔽雜音、感知疼痛，甚至面臨危險時心跳加速的本能防衛，背后都有它的影子。它還是個“性情中人”，緊密參與著我們的進食欲望和那份按捺不住的新鮮感與探索欲。

圖片來源： Nature(2016)

近年來，科學家發現它手握如此多的權力后，臨床醫學也投來熱切目光。醫生們設想，若能更懂這個區域，或許能找到更精妙的按鈕，通過深部腦刺激或其他療法，緩解帕金森病等運動障礙，甚至撫平精神疾病患者的痛苦。早在這股熱潮之前，大家就隱約察覺，未定帶內部住著形態功能各異的細胞，且人脈極廣，神經聯絡遍布大腦各層級。然而麻煩也正源于此：知識碎片散落一地，我們始終缺少一份詳盡的“居民戶口本”——一套權威的細胞分類學。

圖片來源： Science (2022)

于是，許多看似基礎卻懸而未決的空白留了下來。邊界從哪兒起到哪兒止，模糊不清；里面到底住了哪些細胞，也沒能說清。已有研究按粗略的解剖分區去測繪內部神經元的連接網絡，但一個根本疑問始終揮之不去：這張網，在不同“性格”的神經元小群體之間，會不會長得完全不一樣？翻閱文獻更像聽一場激烈辯論——關于它到底使用哪幾種神經遞質這種最根本的“語言問題”，連各類細胞的數量占比都眾說紛紜。就連想為它的運作搭建最簡單的模型，都面臨地基不穩的難題。

圖片來源： Neuroscience (2005)

近日，《PNAS》雜志在線刊登了MIT馮國平課題組的最新重要工作，改研究聯合運用單核RNA測序與熒光原位雜交技術，建立了能夠區分未定帶及其周圍結構的遺傳標志物，并據此界定了未定帶內部的亞區。

在此基礎上，作者依據神經元獨特的分子表型、內在電生理特性及軸突投射模式，將其劃分為四個不同的群體。他們描繪了這四類未定帶神經元在未定帶內部的空間分布特征，并構建了一種Cre驅動工具鼠系，從而為未定帶吻側富集的一個神經元亞型提供了遺傳學通路。

通過單突觸示蹤實驗，他們揭示了這四類未定帶神經元各自的輸入來源，進而將其分別定位于各自的全腦網絡之中。最后，作者采用一種整合了先前報道依賴未定帶的多個腦功能域的行為范式，探究了特定投射定義下的未定帶神經元亞群的功能特性。

綜上，該研究成果為理解未定帶的細胞多樣性、闡明特定未定帶神經元亞型在全腦環路中的嵌入方式、揭示其參與多種生理與行為過程的機制，以及探索其是否可作為病理狀態治療的選擇性靶點，奠定了基礎。

未定帶神經元的轉錄組學與解剖學特征

為探究未定帶神經元的多樣性，作者從成年野生型小鼠腦切片中顯微分離未定帶，經熒光激活細胞核分選純化后進行單細胞核RNA測序。其中，GABA能神經元占75.5%，谷氨酸能神經元占20.0%，另有少量膠質細胞。經與公開全腦單細胞測序數據整合比對，大部分細胞被標注為ZI Pax6 GABA能亞類，而谷氨酸能神經元則被歸為鄰近腦區（如背側丘腦、底丘腦核）的亞類，可能存在共分離污染。

然后，作者采用熒光原位雜交繪制了Gad2、Slc17a6和Pax6的表達圖譜（圖1A及補充附錄，圖S3 A和B）。這些基因的表達模式清晰界定了未定帶的邊界：尾側、外側和腹側邊界以Gad2與Pax6共表達為特征（補充附錄，圖S3A），背側則以Slc17a6陽性的丘腦與Gad2陽性未定帶分界。前外側與丘腦網狀核交界處，未定帶以Gad2/Pax6共表達區別于后者的Pvalb/Gad2共表達（補充附錄，圖S4）。邊界內Gad2陽性細胞占絕對主導（87.9%，圖1 B和C），Vglut2陽性細胞僅占12.1%且多集中于尾極（補充附錄，圖S3），與Gad2/Pax6共表達細胞交錯分布。空間轉錄組分析進一步表明，這些谷氨酸能神經元并非未定帶特有，而是來自鄰近腦區的溢入（補充附錄，圖S3 C）。

剔除污染細胞簇后重新聚類（圖1D），保留的神經元全部為GABA能（圖1E）。他們引入Vgat-Cre小鼠系向未定帶注射Cre依賴病毒以示蹤傳出投射（補充附錄，圖S5），此實驗可標記出廣泛的下行抑制性投射，其主要下游為同側上丘、導水管周圍灰質、腦橋網狀核等腦干結構，亦投射至部分丘腦和下丘腦區域。

筆者注：在單細胞測序實驗中，共分離污染指的是，當研究者試圖從腦組織中精確切取某個目標核團時，由于該核團邊界不規則、與周圍組織交錯鑲嵌，或顯微分離精度有限，不可避免地連帶切下了少量緊鄰的非目標區域組織。這些"誤入"的細胞隨后與目標細胞一同經歷細胞核分離、分選和測序，最終在數據集中表現為本不屬于該核團的細胞類型，從而對細胞分類和比例估算造成干擾。

圖1 未定帶神經元的轉錄組學與解剖學特征

未定帶背側與腹側GABA能神經元的轉錄組學及解剖學差異

然后，作者將未定帶神經元RNA在四個分辨率水平上重新聚類（補充附錄，圖S6），并確認聚類合理性，發現最高分辨率下22個聚類中僅有兩個彼此無顯著差異。經與艾倫研究所ABC圖譜層級比對，作者的四個聚類水平大致對應于超型和聚類分辨率水平，最精細水平上二者調整互信息為0.51，且ABC超型標簽與他們的第三、四級聚類具有一致對應關系（補充附錄，圖S7）。

差異表達基因分析揭示了顯著的轉錄組多樣性（圖2A）。Pax6、Meis2、Kcng2和Ptprk在所有聚類分辨率上均呈互補表達（圖2 A–C）。熒光原位雜交證實這些轉錄組標記了空間分離的Gad2陽性神經元群體（圖2D及補充附錄，圖S8）：Pax6定位于腹側和尾側亞區，Kcng2和Ptprk定位于背側亞區，Meis2則與Pax6共表達于腹側（補充附錄，圖S9）。Kcng2陽性背側亞型在后部更為豐富（補充附錄，圖S8A）。定量統計顯示Pax6陽性細胞約為Kcng2陽性細胞的兩倍（圖2 E和F）。

作者結合逆行示蹤與熒光原位雜交手段，發現未定帶傳出投射因靶區而異：紅核、腦橋網狀核等被蓋腦干區域主要接受背側Kcng2陽性神經元輸入，而丘腦后內側核、上丘和背內側導水管周圍灰質等高級腦區則更多接受腹側Pax6陽性神經元輸入（補充附錄，圖S10及S11）。CTB雙標逆行示蹤進一步表明，未定帶-上丘投射神經元與未定帶-腦橋網狀核投射神經元分別分布于腹側和背側，雙標比例不足5%（補充附錄，圖S12）。狂犬病病毒介導的順行示蹤亦證實二者幾乎不共標。因此，未定帶-上丘通路與未定帶-腦橋網狀核通路由相互分離的神經元群體構成。

筆者注：上丘與腦橋網狀核分別代表了未定帶下行投射所調控的兩大功能域：上丘作為中腦頂蓋的多層感覺運動整合中樞，主要負責多感官信息整合與定向行為（包括眼動、頭轉、防御性躲避），在研究中被視為接受腹側未定帶Pax6陽性神經元輸入的“高級腦區”通路；而腦橋網狀核作為腦橋被蓋網狀結構的一部分，主要參與軀干四肢的運動執行、姿勢維持和驚跳反應，接受背側未定帶Kcng2陽性神經元輸入，構成偏向運動控制的通路。

二者分別對應“感知-定向”與“運動-執行”兩大功能模塊，而文中通過逆行示蹤和側枝分析證實這兩條通路幾乎完全由相互分離的未定帶神經元群體構成，從環路層面為未定帶背側與腹側神經元的功能分工提供了清晰的結構基礎。

圖2 未定帶背側與腹側GABA能神經元的轉錄組學及解剖學差異

腹側未定帶內存在兩種不同GABA能神經元亞型

鑒于Pax6陽性未定帶神經元包含多個測序聚類（圖2A）且腹側未定帶向多個腦區投射，作者計劃尋找Pax6陽性神經元亞群的特異性標志物。在較高聚類分辨率下，Slc30a3和Spp1呈反相關分布（圖3 A–C）。熒光原位雜交共標結果顯示，Pax6/Slc30a3陽性與Pax6/Spp1陽性神經元是重疊極少且解剖上相互分離的腹側未定帶亞群（圖3C及補充附錄，圖S13）：前者占據未定帶前內側，后者富集于后外側，前者的數量約為后者的三倍（圖3D）。另有一小群三陽性神經元位于兩群交界面（補充附錄，圖S13 D–F）。

作者構建了Slc30a3-Cre小鼠并引入已有的Spp1-Cre小鼠，通過全細胞膜片鉗記錄表征了兩群神經元的電生理特性（補充附錄，圖S14 A和B）。Slc30a3神經元胞體較小、膜電容較低，但膜電阻較高（圖3 E和F）。二者動作電位波形存在多方面差異：Slc30a3神經元動作電位幅值更大、動力學更慢（補充附錄，圖S14 C–H）。Spp1神經元在遞增電流注入下表現出更大的動作電位輸出動態范圍，且鋒電位頻率適應極小，而Slc30a3神經元在中大電流下常出現去極化阻滯（圖3G及補充附錄，圖S14I），這與Spp1神經元共表達Pvalb的特征一致（圖3A）。

順行示蹤結果顯示，兩群神經元投射模式亦有不同（補充附錄，圖S15 A和B）：Slc30a3神經元特異性支配導水管周圍灰質的背內側和腹外側亞區，而兩類神經元均投射至上丘，并在高級丘腦區域匯聚。逆行示蹤結合熒光原位雜交驗證了上述結果，其中，投射至背內側導水管周圍灰質的神經元以Slc30a3表達為主，主要分布于未定帶前半部（補充附錄，圖S15 C和D及圖S10B）。

筆者注：Slc30a3和Spp1是區分腹側未定帶Pax6陽性GABA能神經元兩個亞群的核心標志基因。Slc30a3編碼負責囊泡鋅離子轉運的鋅轉運蛋白3，其陽性神經元分布于未定帶前內側，胞體較小、膜電阻較高、動作電位幅值大但動力學較慢，在中大電流下易出現去極化阻滯，并特異性投射至導水管周圍灰質；而Spp1編碼參與細胞黏附與免疫調節的分泌性磷蛋白骨橋蛋白，其陽性神經元分布于未定帶后外側，胞體較大、共表達Pvalb，表現為快速放電且幾乎無鋒電位頻率適應，與Slc30a3神經元共同投射至上丘和高級丘腦區域。

兩者在空間分布、電生理特性和投射模式上的系統差異，為腹側未定帶內部的功能異質性提供了清晰的分子與環路基礎。

那么，背側未定帶有不同神經亞群嗎？

圖3 腹側未定帶內存在兩種不同GABA能神經元亞型

背側未定帶內存在兩種不同GABA能神經元亞型

背側未定帶是否同質尚不明確。既往研究認為，背側未定帶主要由谷氨酸能神經元構成，但上文測序與熒光原位雜交數據表明未定帶內谷氨酸能神經元極少（圖1及補充附錄，圖S2）。Kcng2與Ptprk在GABA能亞聚類中的共表達及在背側未定帶中的定位（圖2 A、C和D及補充附錄，圖S8C），證實這些亞聚類可代表背側未定帶。

在第四級聚類下，作者觀察到多個假定的背側ZI亞聚類（圖4A），并發現傳統背側標志物Nos1僅標記其中一部分Kcng2/Ptprk共表達聚類，而另一亞聚類則以Cyp39a1和Spp1為特征（圖4A）。熒光原位雜交共染色證實Nos1與Spp1標記背側未定帶中幾乎不重疊的Kcng2陽性群體（圖4 B和C及補充附錄，圖S16D），且前者數量約為后者的四倍（圖4D）。

全細胞膜片鉗記錄顯示（補充附錄，圖S17 A和B），Spp1背側神經元較Nos1神經元具有更高的膜電容和更低的膜電阻（圖4 E和F），動作電位幅值略大且動力學更快（補充附錄，圖S17 E–G），而Nos1神經元在中大電流注入下常出現去極化誘發動作電位阻滯（圖4G及補充附錄，圖S17I）。順行示蹤表明兩群神經元均向中腦和腦橋腦干區域發出投射（補充附錄，圖S18 A和B），熒光原位雜交進一步證實Spp1陽性和Nos1陽性背側未定帶神經元均投射至腦橋（補充附錄，圖S18 C和D）。

圖4 背側未定帶內存在兩種不同GABA能神經元亞型

未定帶-腦橋與未定帶-上丘亞網絡的功能差異

為探究未定帶亞網絡的功能，作者建立了一種行為范式：食物剝奪小鼠在設有庇護所的狹長曠場中覓食牛奶，同時在攝取獎賞期間面臨先天性威脅性視覺刺激（逼近刺激）（圖5A及6A）。經過3天訓練，小鼠學會了從隨機指定的活躍端口獲取牛奶，成功率逐日提高、反應時間逐漸縮短（圖5 B和C），且獎賞體積與舔舐回合持續時間呈正相關（圖5 D和E）。

作者通過向上丘或腦橋網狀核注射RV?L-5Cre、向同側未定帶注射AAV-synFLEX-jGCaMP8m并植入光纖，記錄了投射至上丘和腦橋網狀核的未定帶神經元鈣活動（圖5F）。兩條通路均受舔舐行為影響，但模式不同：未定帶-上丘群體在舔舐開始前出現短暫活動增加（圖5 G和M左圖，圖5J），而未定帶-腦橋網狀核群體在舔舐前幾乎無調制，舔舐開始后則受到更強抑制（圖5 G和M右圖），且抑制幅度與舔舐回合持續時間相關，舔舐終止時活動急劇恢復至基線（圖5 H和N右圖，圖5 K和L）。長舔舐回合中未定帶-上丘通路也受到抑制，可能反映運動靜止相關的調制。

第四天，小鼠在基線覓食試驗后，于遠端端口攝取牛奶時遭遇舔舐觸發的逼近刺激（圖6 A和D），制造了繼續舔舐與逃離威脅的沖突（圖6B）。逼近刺激通常終止舔舐并引發朝向庇護所的逃跑（圖6 B–D及補充附錄，圖S22A）。當逃跑被抑制、小鼠繼續舔舐時，兩條通路的活動模式與無干擾舔舐時一致：未定帶-上丘在舔舐開始前活動增加、舔舐期間調制極小（圖6F），而未定帶-腦橋網狀核全程受抑制（圖6G）。在觸發逃跑的試驗中，兩條通路的活動在逃跑起始后均大幅增加且幅度相似（圖6 H–K）。逃跑后常伴隨庇護所內的僵直行為，此時兩群體活動均受抑制（圖6 L和M），且未定帶-上丘的抑制幅度顯著大于未定帶-腦橋網狀核（圖6 N和O）。

圖5 未定帶-腦橋與未定帶-上丘神經元群體在獎賞攝取過程中的差異性活動動態

圖6 未定帶-腦橋與未定帶-上丘神經元群體在威脅-獎賞沖突中的活動動態

本文的局限性

本篇文章十分精彩，但并非完美無瑕：

1、環路連接方面，作者通過單突觸示蹤繪制了不同未定帶神經元亞型的全腦輸入圖譜，并揭示了如ZI-SC Slc30a3+亞型在輸入來源上的獨特性，但特定腦區對特定未定帶亞型的突觸輸入是否具有因果性調控作用，尚未通過光遺傳學或化學遺傳學等功能性實驗加以驗證。因此，這些解剖上的輸入連接究竟在多大程度上轉化為具有行為意義的功能性調控，仍有待進一步探究。

2、有關未定帶下游的功能系統，本文未做全面解讀。其一，未定帶此前被報道參與運動控制、感覺門控、新奇探索等多種行為域，但本研究的行為范式僅聚焦于獎賞攝取與威脅應對，未定帶各亞型在其他行為功能中的角色有待進一步探究；其二，不同未定帶亞型向各自下游靶區傳遞的信號性質及其在突觸后水平的功能效應，仍缺乏電生理或功能成像層面的直接證據，這限制了從環路結構到行為功能的完整因果鏈構建。

3、文章用到的行為范式均為急性趨避沖突及其伴隨的防御行為，所檢測的功能維度相對有限。那么，未定帶亞網絡是否參與慢性應激、焦慮或成癮等涉及類似環路但病程更為持久的行為過程呢？這些具有更高臨床轉化價值的慢性行為范式，可能是未來研究的重要方向。

總結

未定帶在多種行為功能中發揮重要作用，且正逐漸成為深部腦刺激治療神經系統疾病的新興臨床靶點。盡管其重要性不言而喻，但未定帶的細胞類型組成以及連接特定未定帶細胞類型與全腦環路的解剖環路組織仍不清楚。

本研究采用單細胞核RNA測序、空間RNA分析、離體電生理學及解剖環路示蹤，構建了未定帶的多模態細胞圖譜，并解析了特定未定帶細胞類型的全腦單突觸輸入。作者界定了四個遺傳學上不同的未定帶GABA能神經元群體，這些群體表現出獨特的空間分布、特化的內在電生理特性、分化的傳出投射以及細胞類型依賴的突觸輸入模式。最后，利用光纖光度記錄技術，作者在一個圍繞由獎賞性刺激與先天性厭惡刺激所產生的趨避沖突的行為范式中，揭示了不同未定帶細胞類型之間的反應差異。

因此，本研究為未來旨在理解未定帶組織與功能的實驗設計與解讀提供了理論基礎，意義重大。

參考文獻

Kast R, Simmons SK, Rome N, Adiconis X, Melamed L, McCabe KA, Wang D, Krol A, Krubner M, Prevosto V, Levandowski K, Sabbagh U, Sullivan HA, Wickersham IR, Wang F, Levin JZ, Fu Z, Feng G. Multimodal analysis reveals cellular diversity and divergent circuits of the zona incerta. Proc Natl Acad Sci U S A. 2026 May 5;123(18):e2509781123. doi: 10.1073/pnas.2509781123. Epub 2026 Apr 29. PMID: 42054363; PMCID: PMC13143026.

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