Autophagy｜瞄準MASH治療新策略：天然化合物Byakangelicin選擇性抑制非經(jīng)典MTORC1通路，激活TFEB改善脂肪性肝炎！（李新偉—...

2026年5月25日，吉林大學(xué)李新偉團隊，在Autophagy（中科院1區(qū)，2024 Impact Factor=14.3）在線發(fā)表題為“Byakangelicin alleviates metabolic dysfunction-associated steatohepatitis by selective inhibition of a non-canonical MTORC1 signaling pathway”的研究論文。該文于2025年4月21日投稿，2026年5月6日修回，2026年5月14日接收，并于2026年5月25日在線發(fā)表。

代謝功能障礙相關(guān)脂肪性肝炎（MASH）是代謝功能障礙相關(guān)脂肪性肝病（MASLD）的進展階段，主要表現(xiàn)為肝臟脂肪變性、炎癥、肝細胞損傷及不同程度纖維化。雖然目前已有藥物獲批用于部分MASH患者，但長期治療仍面臨安全性、耐受性和成本等問題，因此尋找新的干預(yù)靶點和候選藥物仍具有重要意義。

本研究聚焦自噬-溶酶體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子TFEB，以及其上游非經(jīng)典MTORC1信號通路。研究發(fā)現(xiàn)，來源于白芷根的天然化合物Byakangelicin（Bya）可選擇性抑制MTORC1介導(dǎo)的TFEB磷酸化，而不影響RPS6KB1/S6K1、EIF4EBP1/4E-BP1等經(jīng)典MTORC1底物，從而避免了全面抑制MTORC1可能帶來的不良影響。

在高脂高膽固醇飲食、蛋氨酸膽堿缺乏飲食及高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠模型中，Bya可改善肝臟脂肪變性、炎癥反應(yīng)、胰島素抵抗和纖維化。機制上，Bya直接結(jié)合FLCN的MET370和PHE552位點，抑制FLCN-FNIP1/FNIP2復(fù)合體功能，進而解除MTORC1對TFEB的胞質(zhì)滯留，使TFEB進入細胞核并增強其轉(zhuǎn)錄活性。

進一步的遺傳學(xué)實驗證實，肝臟Tfeb敲除會阻斷Bya對MASH的改善作用，而重新引入TFEB可恢復(fù)其保護效應(yīng)；同時，F(xiàn)LCN關(guān)鍵結(jié)合位點突變也會消除Bya對MASH的干預(yù)效果。上述結(jié)果表明，Bya通過靶向FLCN-TFEB軸，選擇性調(diào)控非經(jīng)典MTORC1信號通路，從而發(fā)揮抗MASH作用。

該研究不僅揭示了Byakangelicin作為MASH候選天然化合物的潛在價值，也提示“選擇性抑制非經(jīng)典MTORC1-TFEB通路”可能成為MASH治療的新方向。

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【摘 要】

代謝功能障礙相關(guān)脂肪性肝炎（MASH）正逐漸成為慢性肝病的重要原因。機制性雷帕霉素靶蛋白激酶（MTOR）復(fù)合體1（MTORC1）被認為是潛在治療靶點，但全面抑制MTORC1活性可能帶來不良影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，天然化合物Byakangelicin（Bya）能夠選擇性抑制MTORC1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子EB（TFEB）磷酸化，而不影響經(jīng)典MTORC1底物。肝臟Tfeb敲除會阻斷Bya對小鼠肝臟脂肪變性、炎癥、胰島素抵抗和纖維化的改善作用；而重新引入TFEB則可恢復(fù)這些保護效應(yīng)。

研究進一步發(fā)現(xiàn)，Bya可直接結(jié)合濾泡素（FLCN）的MET370和PHE552位點，抑制FLCN-FNIP1/FNIP2復(fù)合體功能，從而阻斷MTORC1介導(dǎo)的TFEB胞質(zhì)滯留。肝臟中FLCN突變（M370A和F552A）會消除Bya對MASH的保護作用。

因此，Bya是一種具有MASH干預(yù)潛力的天然化合物，選擇性抑制MTORC1可能成為治療MASH的一種潛在策略。

01

研究背景及科學(xué)問題

代謝功能障礙相關(guān)脂肪性肝病（MASLD），既往稱為非酒精性脂肪性肝病，影響全球近30%的成年人。代謝功能障礙相關(guān)脂肪性肝炎（MASH），既往稱為非酒精性脂肪性肝炎，被認為是MASLD的進展形式，其特征包括肝臟脂肪變性、炎癥、肝細胞損傷以及不同程度的纖維化。部分MASH患者可進一步發(fā)展為肝硬化、肝細胞癌和肝衰竭。因此，臨床治療的重點在于減緩MASLD進展，尤其是改善已經(jīng)形成的MASH表型。

目前，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）已通過加速批準途徑批準resmetirom（Res）聯(lián)合飲食和運動，用于治療伴有中重度纖維化的非肝硬化MASH成人患者。然而，考慮到MASH通常需要長期治療，Res在安全性、耐受性和治療成本方面仍有需要解決的問題。因此，尋找新的MASH治療途徑仍然十分迫切。

轉(zhuǎn)錄因子EB（TFEB）是調(diào)控溶酶體生物發(fā)生和大自噬/自噬的核心轉(zhuǎn)錄因子。肝臟自噬-溶酶體通路失調(diào)，是推動MASH進展的重要病理因素之一。TFEB過表達可促進脂滴和受損線粒體降解，并上調(diào)參與脂質(zhì)氧化和線粒體生物發(fā)生的基因。此外，TFEB激活還可抑制核因子κB（NFKB/NF-κB）信號及其下游炎癥因子釋放。Tfeb缺失可誘導(dǎo)肝臟脂肪變性，而藥物或間接遺傳方式激活TFEB，可通過增強自噬通量，或促進線粒體生物發(fā)生和脂質(zhì)消耗來改善MASH。這提示TFEB可能是MASH治療的潛在靶點。

在營養(yǎng)充足條件下，MTORC1可激活蛋白和脂質(zhì)合成等合成代謝通路，同時抑制自噬等分解代謝過程。MTORC1持續(xù)激活會促進MASLD和MASH，并導(dǎo)致肝損傷和肝細胞癌。抑制MTORC1可減少肝臟脂肪變性，尤其是通過恢復(fù)自噬發(fā)揮作用。然而，長期抑制MTORC1也可能誘發(fā)肝損傷、炎癥，并增強腫瘤發(fā)生風(fēng)險。

MTORC1通過磷酸化經(jīng)典底物RPS6KB1/S6K1和EIF4EBP1/4E-BP1來驅(qū)動合成代謝過程，這些底物含有保守的雷帕霉素靶蛋白信號基序。作為非經(jīng)典底物，TFEB缺乏其他MTORC1底物所具有的這一基序。相反，TFEB的磷酸化和胞質(zhì)定位完全依賴RRAGC/RRAGD激活蛋白FLCN的活性。FLCN可選擇性調(diào)控MTORC1對TFEB的作用，而不影響其他底物。已有研究顯示，肝細胞特異性flcn敲除可選擇性促進MTORC1介導(dǎo)的TFEB核轉(zhuǎn)位，同時不影響經(jīng)典MTORC1底物。值得注意的是，肝臟Flcn缺失可保護小鼠免于MASLD和MASH。這些既往研究提示，靶向FLCN、選擇性抑制MTORC1非經(jīng)典底物，可能是治療MASLD和MASH的一種有潛力的策略。

據(jù)報道，超過50%的FDA批準小分子藥物來源于天然化合物。Byakangelicin（Bya）是從白芷根中提取的一種呋喃香豆素類化合物，已有研究顯示其可緩解四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝損傷和肝纖維化。肝臟炎癥是MASH發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵驅(qū)動因素之一，既往多項體內(nèi)和體外研究也提示Bya具有抗炎作用。然而，Bya是否能夠改善MASH，以及其作用機制如何，目前仍不清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)，Bya可強效抑制FLCN介導(dǎo)的非經(jīng)典MTORC1信號通路，增強TFEB轉(zhuǎn)錄活性，并改善小鼠肝臟脂肪變性、炎癥、胰島素抵抗和纖維化。因此，Bya被認為是治療MASH的潛在候選天然化合物。這一發(fā)現(xiàn)也為通過靶向FLCN改善MASH提供了新的研究方向。

02

重要發(fā)現(xiàn)及亮點

Bya的藥代動力學(xué)特征及肝臟分布

研究者首先考察了Bya在小鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)和組織分布情況。單次腹腔注射Bya 24 mg/kg后，在正常飲食（ND）小鼠中，Bya血漿濃度在0.25小時達到最大濃度（Cmax）23,800 ng/mL，半衰期（T1/2）為1.57小時。在MASH小鼠中，Bya血漿濃度在0.5小時達到Cmax 27,334.7 ng/mL，T1/2為1.99小時。

組織分布方面，單次腹腔注射后，Bya可在心、肝、脾、肺、腎、肌肉和腦中被檢測到。正常飲食小鼠中，肝臟Bya濃度最高，其次為腎、肺、心、脾、肌肉和腦。值得注意的是，在MASH小鼠中，注射后2、4和8小時的肝臟Bya濃度高于正常飲食小鼠。與靜脈給藥相比，腹腔注射Bya的生物利用度為89.0%；但MASH小鼠中的生物利用度低于正常飲食小鼠。

安全性方面，正常飲食小鼠每2天給予Bya 24 mg/kg，連續(xù)6周后，血液學(xué)參數(shù)未發(fā)生改變。心、肝、脾、肺和腎的組織學(xué)分析未見病理異常，提示Bya未表現(xiàn)出明顯毒性。

Bya改善小鼠MASH和MASLD表型

為了驗證Bya是否能夠減輕MASH發(fā)生發(fā)展，研究者在高脂高膽固醇飲食（HFHC）誘導(dǎo)的MASH小鼠模型中檢測其抗MASH作用。在正常飲食小鼠中，高劑量Bya（48 mg/kg，每2天一次）對體重、肝重、肝重/體重比（LW/BW）、肝臟甘油三酯（TG）含量，以及血清GPT/ALT和GOT1/AST水平均無明顯影響。而在HFHC飲食小鼠中，Bya可劑量依賴性逆轉(zhuǎn)這些指標的升高。由于中劑量Bya（24 mg/kg，每2天一次）已能有效降低體重、肝重、LW/BW、肝臟脂肪變性和肝損傷，后續(xù)研究采用該劑量。

進一步分析顯示，HFHC誘導(dǎo)的空腹血糖、空腹胰島素和穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）升高，可被Bya顯著降低。與此一致，Bya還能改善HFHC飲食小鼠的葡萄糖耐受不良、胰島素耐受受損以及肝臟胰島素信號障礙。此外，Bya減少了HFHC飲食小鼠肝臟NFKB信號激活、炎癥細胞浸潤、膠原沉積以及促纖維化蛋白表達。

在蛋氨酸膽堿缺乏飲食（MCD）誘導(dǎo)的MASH小鼠模型中，Bya也表現(xiàn)出類似作用，包括減少肝臟脂肪變性、肝損傷、炎癥和纖維化。上述結(jié)果提示，Bya可有效改善小鼠MASH。

研究者還在高脂飲食（HFD）誘導(dǎo)的MASLD小鼠模型中檢測Bya作用，發(fā)現(xiàn)Bya可降低體重、肝重、LW/BW、肝臟脂肪變性和肝損傷。同時，Bya改善MASLD小鼠的葡萄糖代謝紊亂，表現(xiàn)為空腹血糖、空腹胰島素和HOMA-IR下降，葡萄糖耐受和胰島素敏感性改善。Bya還減輕HFD飲食小鼠肝臟NFKB信號激活和炎癥細胞浸潤。

在油酸和棕櫚酸（OP，1.2/0.6 mM）處理的小鼠原代肝細胞中，Bya在無明顯細胞毒性的情況下劑量依賴性降低TG含量，并改善OP誘導(dǎo)的胰島素信號受損和NFKB信號激活。總體而言，這些數(shù)據(jù)表明，Bya可在體內(nèi)和體外改善脂質(zhì)積累、炎癥反應(yīng)和胰島素抵抗。

圖1：Bya緩解小鼠MASH。小鼠給予正常飲食（ND）或高脂高膽固醇飲食（HFHC）12周。隨后，在繼續(xù)給予相應(yīng)ND或HFHC飲食的同時，通過腹腔注射給予Bya（24 mg/kg，每2天一次）額外處理4周。（A–D）不同組小鼠的體重、肝重、LW/BW和肝臟TG含量。（E）肝組織切片代表性H&E染色（比例尺：100 μm）、油紅O染色（比例尺：100 μm）、MPO（髓過氧化物酶）染色（比例尺：10 μm）和天狼星紅染色（比例尺：100 μm）。（F）血清GPT和GOT1水平。（G和H）空腹血糖和空腹胰島素水平。（I）HOMA-IR。（J和K）葡萄糖耐量試驗（GTT）和胰島素耐量試驗（ITT）。（L–N）肝臟中參與胰島素信號、炎癥和纖維化相關(guān)蛋白的代表性免疫印跡。n = 6只小鼠/組。數(shù)據(jù)采用單因素方差分析并進行Tukey檢驗，以均值 ± SEM表示。*p < 0.05，**p < 0.01。

Bya增強肝細胞中TFEB轉(zhuǎn)錄活性

為了研究Bya發(fā)揮有益作用背后的全局基因特征和潛在分子靶點，研究者對OP處理并有無Bya干預(yù)的肝細胞進行了RNA測序分析。主成分分析（PCA）顯示，兩組之間存在明顯差異。與單獨OP處理相比，Bya與OP共處理肝細胞中有2,664個基因下調(diào)、2,797個基因上調(diào)。

京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析顯示，自噬和線粒體自噬相關(guān)通路在Bya處理后顯著富集并上調(diào)。實時定量PCR（qRT-PCR）進一步證實，Bya可上調(diào)自噬和線粒體自噬相關(guān)基因。使用溶酶體蛋白酶抑制劑氯喹（CQ）后，研究者發(fā)現(xiàn)Bya增強了OP處理肝細胞中SQSTM1/p62降解和MAP1LC3/LC3-II形成。LC3斑點實驗也支持這一結(jié)果，提示Bya增加了自噬通量。

研究者隨后利用GTRD、CHIP-atlas和FIMO-JASPAR數(shù)據(jù)庫分析這些上調(diào)基因，發(fā)現(xiàn)TFEB是最顯著富集的轉(zhuǎn)錄因子。磷酸化TFEB通常滯留在胞質(zhì)中，而去磷酸化TFEB可轉(zhuǎn)位至細胞核并驅(qū)動靶基因轉(zhuǎn)錄。Bya增強了肝細胞中TFEB核定位，并降低TFEB Ser211位點磷酸化。在HFHC和MCD誘導(dǎo)的MASH小鼠模型以及HFD誘導(dǎo)的MASLD小鼠模型中，Bya也減少了TFEB胞質(zhì)滯留和磷酸化。

進一步的遺傳學(xué)實驗顯示，Tfeb敲除會消除Bya對OP處理肝細胞中脂質(zhì)積累、胰島素抵抗和炎癥反應(yīng)的改善作用。相反，在tfeb敲除肝細胞中強制表達TFEB后，Bya可再次緩解OP誘導(dǎo)的脂質(zhì)積累、胰島素不敏感和NFKB過度激活。這說明Bya是TFEB激活劑，并以TFEB依賴性方式緩解OP誘導(dǎo)的細胞毒性。

圖2：Bya增強肝細胞中TFEB轉(zhuǎn)錄活性。（A–E、H–J）小鼠原代肝細胞接受OP處理24小時，或先接受OP處理12小時，隨后再與Bya（60 μM）和OP共同處理額外12小時。（A）RNA測序數(shù)據(jù)的PCA分析。（B）火山圖顯示肝細胞基因變化。（C）KEGG功能分析。（D）自噬和線粒體自噬信號通路的基因集富集分析。（E）自噬和線粒體自噬相關(guān)基因的相對mRNA水平。（F）肝細胞中SQSTM1和LC3的代表性免疫印跡。小鼠原代肝細胞預(yù)先接受或不接受CQ（100 μM，4小時）處理；隨后，肝細胞接受OP處理24小時，或先接受OP處理12小時，再與Bya（60 μM）和OP共同處理額外12小時。（G）肝細胞中LC3的代表性熒光圖像；比例尺：10 μm。（H）利用GTRD、CHIP-atlas和FIMO-JASPAR數(shù)據(jù)庫預(yù)測上調(diào)基因潛在轉(zhuǎn)錄因子的韋恩圖。（I）肝細胞中TFEB亞細胞定位的代表性熒光圖像及TFEB核定位定量；比例尺：10 μm。（J）肝細胞中p-TFEB、TFEB、核內(nèi)TFEB和胞質(zhì)TFEB的代表性免疫印跡。（K–N）來自TfebF/F或tfeb[LKO]小鼠的原代肝細胞接受OP處理24小時，或先接受OP處理12小時，再與Bya（60 μM）和OP共同處理額外12小時。（K）肝細胞TG含量。（L）肝細胞代表性油紅O染色；比例尺：20 μm。（M和N）肝細胞中參與胰島素信號和炎癥相關(guān)蛋白的代表性免疫印跡。數(shù)據(jù)采用t檢驗（E和I）或單因素方差分析并進行Tukey檢驗（K），以均值 ± SEM表示。*p < 0.05，**p < 0.01。

Bya改善MASH依賴于TFEB激活

研究者進一步使用肝細胞特異性tfeb缺失小鼠，驗證TFEB是否介導(dǎo)Bya對HFHC誘導(dǎo)MASH的改善作用。與野生型（WT）小鼠中的結(jié)果不同，在HFHC飲食的tfeb敲除小鼠中，Bya不能降低體重、肝重、LW/BW、肝臟脂肪變性以及血清GPT和GOT1水平。Bya也不能影響HFHC飲食tfeb敲除小鼠的空腹血糖、空腹胰島素和HOMA-IR，其葡萄糖耐受、胰島素敏感性和肝臟胰島素信號也未因Bya處理而改善。同時，在HFHC飲食tfeb敲除小鼠中，Bya不能抑制NFKB信號激活、炎癥細胞浸潤、膠原沉積和促纖維化蛋白表達。

隨后，研究者通過靜脈注射腺相關(guān)病毒（AAV）-TFEB，在tfeb敲除小鼠中恢復(fù)TFEB表達。結(jié)果顯示，在這些小鼠中，Bya再次能夠降低體重、肝重、LW/BW、肝臟脂肪變性以及血清GPT和GOT1水平。對于注射AAV-TFEB的tfeb敲除小鼠，Bya還可降低空腹血糖、空腹胰島素和HOMA-IR，并改善葡萄糖耐受和胰島素敏感性。值得注意的是，Bya還抑制了這些小鼠肝臟炎癥細胞浸潤、NFKB信號通路和促纖維化蛋白表達。因此，這些結(jié)果表明，Bya的抗MASH作用依賴于TFEB。

圖3：Bya緩解MASH依賴于TFEB激活。（A）實驗策略示意圖。TfebF/F和tfeb[LKO]小鼠給予HFHC飲食12周；隨后，在繼續(xù)給予HFHC飲食的同時，通過腹腔注射給予或不給予Bya（24 mg/kg，每2天一次）額外處理4周。（B–E）不同組小鼠的體重、肝重、LW/BW和肝臟TG含量。（F）肝組織切片代表性H&E染色（比例尺：100 μm）、油紅O染色（比例尺：100 μm）、MPO染色（比例尺：10 μm）和天狼星紅染色（比例尺：100 μm）。（G）血清GPT和GOT1水平。（H和I）肝臟中參與炎癥和纖維化相關(guān)蛋白的代表性免疫印跡。（J）實驗策略示意圖。tfeb[LKO]小鼠注射AAV-Ctrl或AAV-TFEB，并給予HFHC飲食12周；隨后，在繼續(xù)給予HFHC飲食的同時，通過腹腔注射給予或不給予Bya（24 mg/kg，每2天一次）額外處理4周。（K–N）不同組小鼠的體重、肝重、LW/BW和肝臟TG含量。（O）肝組織切片代表性H&E染色（比例尺：100 μm）、油紅O染色（比例尺：100 μm）、MPO染色（比例尺：10 μm）和天狼星紅染色（比例尺：100 μm）。（P）血清GPT和GOT1水平。（Q和R）肝臟中TFEB以及參與炎癥和纖維化相關(guān)蛋白的代表性免疫印跡。n = 6只小鼠/組。數(shù)據(jù)采用單因素方差分析并進行Tukey檢驗，以均值 ± SEM表示。**p < 0.01。

Bya與FLCN相互作用并抑制非經(jīng)典MTORC1信號通路

接下來，研究者嘗試確定Bya的直接靶點。為此，他們將生物素偶聯(lián)到Bya上，構(gòu)建Bio-Bya用于后續(xù)研究。Bio-Bya未誘導(dǎo)細胞損傷，并可有效增強肝細胞中TFEB核轉(zhuǎn)位。在OP處理肝細胞中，Bio-Bya減少脂質(zhì)積累，并緩解胰島素抵抗和炎癥反應(yīng)，說明生物素偶聯(lián)未影響B(tài)ya功能。

隨后，研究者采用親和分離實驗結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS），共鑒定出33個可能與Bya結(jié)合的蛋白。盡管Bio-Bya可在肝細胞中捕獲FLCN、組蛋白H4、VIM、SNRPD2和RPS3這5種豐度最高的蛋白，但只有純化的FLCN能夠被Bio-Bya拉下，提示Bya可直接與FLCN相互作用。細胞熱轉(zhuǎn)移實驗（CETSA）和藥物親和響應(yīng)靶標穩(wěn)定性實驗（DARTS）進一步顯示，Bya增強FLCN熱穩(wěn)定性，并保護FLCN免受蛋白酶消化。微量熱泳動實驗（MST）顯示，Bya與FLCN具有較強結(jié)合親和力，解離常數(shù)（KD）為15.0 ± 4.01 μM。這些數(shù)據(jù)支持FLCN是Bya的直接靶點。

FLCN可通過其對GTP酶RRAGC/RRAGD的GTPase激活蛋白（GAP）活性，在溶酶體上促進MTORC1激活。FLCN與FNIP1或FNIP2結(jié)合，是其與RRAGs相互作用所必需的。RRAGs由RRAGA或RRAGB與RRAGC或RRAGD組成必需異二聚體，可將MTORC1招募至溶酶體表面。研究結(jié)果顯示，在氨基酸（aa）存在條件下，Bya降低FLCN的GAP活性，表現(xiàn)為RRAGC的GTP負載增強。此外，在反應(yīng)體系中加入Bya會增加FNIP2-FLCN相互作用的KD值，提示Bya存在時FNIP2與FLCN之間相互作用減弱。因此，Bya可能與FNIP2競爭性結(jié)合FLCN。

氨基酸可激活MTORC1，使其磷酸化經(jīng)典底物RPS6KB1和EIF4EBP1，以及非經(jīng)典底物TFEB。FLCN激活可通過RRAGC/D選擇性促進MTORC1介導(dǎo)的TFEB磷酸化。雖然Bya不改變氨基酸依賴性的MTORC1經(jīng)典底物RPS6KB1和EIF4EBP1磷酸化，但可抑制氨基酸誘導(dǎo)的TFEB磷酸化和胞質(zhì)滯留。在氨基酸饑餓狀態(tài)下，Bya降低FLCN與FNIP1、FNIP2、RRAGC和RRAGA之間的相互作用；在氨基酸重新刺激后，Bya減少FLCN與MTOR和TFEB的相互作用。氨基酸刺激可使MTOR被招募至溶酶體，而Bya處理不影響這一轉(zhuǎn)位。在氨基酸饑餓條件下，Bya減少FLCN、FNIP1和FNIP2的溶酶體定位；無論有無氨基酸，Bya均不影響RRAGC和RRAGA的溶酶體定位。

此外，外源表達組成型活化RRAGCS75L可增強RPS6KB1、EIF4EBP1和TFEB磷酸化，即使存在Bya也會促進TFEB胞質(zhì)滯留，提示Bya誘導(dǎo)的FLCN失活發(fā)生在RRAGC/D上游。TFEB去磷酸化由PPP3/calcineurin介導(dǎo)，該酶位于MTORC1調(diào)控TFEB的下游。使用Ca2+螯合劑BAPTA-AM或FK506抑制PPP3/calcineurin，并不能阻止Bya處理肝細胞中的TFEB核轉(zhuǎn)位。綜上，Bya通過結(jié)合FLCN，抑制FLCN-FNIP1/FNIP2復(fù)合體功能，從而降低MTORC1對非經(jīng)典底物TFEB的磷酸化。

圖4：Bya與FLCN相互作用并抑制非經(jīng)典MTORC1信號通路。（A）Bya靶蛋白鑒定流程示意圖。（B）Bio-Bya捕獲的5種豐度最高蛋白。（C）小鼠原代肝細胞接受60 μM Bio或Bio-Bya處理12小時后的免疫沉淀（IP）實驗。（D）Bio-Bya與候選靶點的pull-down實驗。（E和F）采用CETSA和DARTS檢測Bya與FLCN的結(jié)合能力。（G）Bya與FLCN結(jié)合的MST分析。（H）RRAGC的GTP負載。小鼠原代肝細胞接受或不接受60 μM Bya處理12小時；隨后，肝細胞進行氨基酸饑餓60分鐘，再補充氨基酸45分鐘。（I）Bya和FNIP2競爭性結(jié)合FLCN的MST分析。（J和K）小鼠原代肝細胞接受或不接受60 μM Bya處理12小時；隨后，肝細胞進行氨基酸饑餓60分鐘，再補充氨基酸45分鐘，并給予或不給予Torin 1共同處理。（J）肝細胞中p-MTOR、MTOR和MTORC1底物的代表性免疫印跡。（K）肝細胞中TFEB亞細胞定位的代表性熒光圖像及TFEB核定位定量；比例尺：10 μm。（L）IP分析檢測FLCN與MTOR、FNIP1、FNIP2、TFEB、RRAGC和RRAGA之間的相互作用。轉(zhuǎn)染載體或HA-FLCN的小鼠原代肝細胞接受或不接受60 μM Bya處理12小時；隨后，肝細胞進行氨基酸饑餓60分鐘，再補充氨基酸45分鐘。（M和N）小鼠原代肝細胞接受或不接受60 μM Bya處理12小時；隨后，肝細胞進行氨基酸饑餓60分鐘，再補充氨基酸45分鐘。（M）肝細胞中MTOR和LAMP1免疫熒光染色代表性圖像及其共定位定量；比例尺：10 μm。（N）肝細胞中FLCN和LAMP1免疫熒光染色代表性圖像及其共定位定量；比例尺：10 μm。（O）來自肝細胞溶酶體的FLCN、MTOR、FNIP1、FNIP2、TFEB、RRAGC和RRAGA代表性免疫印跡。轉(zhuǎn)染載體或HA-TMEM192的小鼠原代肝細胞接受或不接受60 μM Bya處理12小時；隨后，肝細胞進行氨基酸饑餓60分鐘，再補充氨基酸45分鐘。（P和Q）轉(zhuǎn)染HA-RRAGC或HA-RRAGCS75L的小鼠原代肝細胞接受或不接受60 μM Bya處理12小時；隨后，肝細胞接受或不接受Torin 1處理。（P）肝細胞中p-MTOR、MTOR和MTORC1底物的代表性免疫印跡。（Q）肝細胞中TFEB亞細胞定位的代表性熒光圖像及TFEB核定位定量；比例尺：10 μm。（R）肝細胞中TFEB亞細胞定位的代表性熒光圖像及TFEB核定位定量；比例尺：10 μm。小鼠原代肝細胞在存在或不存在Bya（60 μM，12小時）的條件下，接受FK506（5 μM，3小時）或BAPTA-AM（10 μM，6小時）處理。數(shù)據(jù)采用單因素方差分析并進行Tukey檢驗，以均值 ± SEM表示。**p < 0.01。

FLCN介導(dǎo)Bya對MASH的改善作用

為了明確Bya的抗MASH作用是否依賴FLCN，研究者使用肝細胞特異性flcn缺失小鼠進行實驗。肝臟Flcn敲除可降低HFHC飲食小鼠的體重、肝重、LW/BW、肝臟脂肪變性，以及血清GPT和GOT1水平。肝臟Flcn敲除還可緩解HFHC飲食小鼠的胰島素抵抗、肝臟炎癥和纖維化。值得注意的是，在flcn敲除小鼠中，Bya處理并未進一步改善這些MASH特征。

隨后，研究者向HFHC飲食的flcn敲除小鼠注射AAV-FLCN，以恢復(fù)FLCN表達。結(jié)果顯示，強制表達FLCN會增加體重、肝重、LW/BW、肝臟脂肪變性以及血清GPT和GOT1水平，而這些升高可被Bya處理降低。FLCN表達恢復(fù)還誘導(dǎo)葡萄糖代謝紊亂，表現(xiàn)為空腹血糖和胰島素水平升高、HOMA-IR增加，以及葡萄糖耐受和胰島素敏感性受損；而Bya可改善這些異常。此外，F(xiàn)LCN過表達誘導(dǎo)的NFKB信號過度激活、炎癥細胞浸潤和纖維化，也可被Bya改善。這些數(shù)據(jù)表明，Bya通過抑制FLCN功能來緩解MASH。

圖5：FLCN介導(dǎo)Bya對MASH的改善作用。（A）實驗策略示意圖。FlcnF/F和flcn[LKO]小鼠給予HFHC飲食12周；隨后，在繼續(xù)給予HFHC飲食的同時，通過腹腔注射給予或不給予Bya（24 mg/kg，每2天一次）額外處理4周。（B–E）不同組小鼠的體重、肝重、LW/BW和肝臟TG含量。（F）肝組織切片代表性H&E染色（比例尺：100 μm）、油紅O染色（比例尺：100 μm）、MPO染色（比例尺：10 μm）和天狼星紅染色（比例尺：100 μm）。（G）血清GPT和GOT1水平。（H和I）肝臟中參與炎癥和纖維化相關(guān)蛋白的代表性免疫印跡。（J）實驗策略示意圖。flcn[LKO]小鼠注射AAV-Ctrl或AAV-FLCN，并給予HFHC飲食12周；隨后，在繼續(xù)給予HFHC飲食的同時，通過腹腔注射給予或不給予Bya（24 mg/kg，每2天一次）額外處理4周。（K–N）不同組小鼠的體重、肝重、LW/BW和肝臟TG含量。（O）肝組織切片代表性H&E染色（比例尺：100 μm）、油紅O染色（比例尺：100 μm）、MPO染色（比例尺：10 μm）和天狼星紅染色（比例尺：100 μm）。（P）血清GPT和GOT1水平。（Q和R）肝臟中FLCN以及參與炎癥和纖維化相關(guān)蛋白的代表性免疫印跡。n = 6只小鼠/組。數(shù)據(jù)采用單因素方差分析并進行Tukey檢驗，以均值 ± SEM表示。**p < 0.01。

FLCN的MET370和PHE552是Bya-FLCN結(jié)合的關(guān)鍵殘基

研究者利用基于蛋白結(jié)構(gòu)的分子對接算法發(fā)現(xiàn)，Bya可結(jié)合FLCN表面的一個活性口袋。該口袋位于FLCN-FNIP1/2相互作用界面附近，由MET370、GLY371、ASN372、ALA412、PHE435和PHE552等殘基構(gòu)成。Bya與FLCN之間的結(jié)合主要由其與MET370、ALA412、PHE435和PHE552之間的疏水相互作用，以及其與GLY371和ASN372之間的氫鍵維持。計算得到Bya與FLCN之間結(jié)合自由能為?6.2 kcal/mol，提示其具有較強結(jié)合親和力。

分子動力學(xué)模擬進一步顯示，Bya結(jié)合會使FLCN-FNIP2復(fù)合體形成更加擴展且動態(tài)的構(gòu)象。回轉(zhuǎn)半徑（Rg）從2.95–3.05 nm增加至3.10–3.18 nm，同時整體均方根偏差（RMSD）升高，提示結(jié)構(gòu)變得松散。與這種擴展一致，Bya結(jié)合體系中的溶劑可及表面積（SASA）持續(xù)升高，反映其溶劑暴露程度增加。在界面區(qū)域，Bya增強局部柔性，使均方根波動（RMSF）峰值升至約0.7 nm，并減少氫鍵數(shù)量及穩(wěn)定性。總體而言，這些數(shù)據(jù)說明Bya結(jié)合可通過促進FLCN-FNIP2復(fù)合體進入更開放、更靈活、結(jié)合較弱的狀態(tài)，從而破壞FLCN-FNIP2相互作用。

為了確定Bya與FLCN的結(jié)合位點，研究者構(gòu)建了一系列FLCN截短體。含有339–579位點或493–579位點的FLCN截短體可與Bya結(jié)合，表現(xiàn)為熱穩(wěn)定性增加和抗蛋白酶消化能力增強。此外，單獨或同時突變MET370和PHE552，均會破壞Bya與FLCN之間的相互作用，這一點由CETSA和DARTS實驗得到支持，提示Bya通過結(jié)合MET370和PHE552靶向FLCN。

值得注意的是，突變型FLCN（Mu FLCN，M370A和F552A）仍保留介導(dǎo)氨基酸誘導(dǎo)MTORC1經(jīng)典底物磷酸化的能力，但Bya降低TFEB磷酸化的作用被這些突變消除。在轉(zhuǎn)染W(wǎng)T FLCN的Flcn敲除肝細胞中，Bya處理可增加TFEB核轉(zhuǎn)位；而在轉(zhuǎn)染Mu FLCN的Flcn敲除肝細胞中，這一現(xiàn)象并未出現(xiàn)。因此，Bya直接結(jié)合FLCN的MET370和PHE552殘基。

圖6：FLCN的MET370和PHE552是Bya-FLCN結(jié)合的關(guān)鍵殘基。（A）基于分子動力學(xué)模擬得到的FLCN與Bya結(jié)合的穩(wěn)定三維結(jié)構(gòu)，以及結(jié)合位點的詳細展示。（B–F）有無Bya條件下FLCN-FNIP2復(fù)合體的分子動力學(xué)模擬分析。（B）Rg。（C）RMSD。（D）SASA。（E）RMSF。（F）氫鍵（Hbonds）。（G）用于（H和I）的FLCN截短突變體示意圖。（H和I）采用CETSA和DARTS檢測Bya與FLCN截短體的結(jié)合能力。（J和K）采用CETSA和DARTS檢測Bya與FLCN突變體的結(jié)合能力。（L）肝細胞中p-MTOR、MTOR和MTORC1底物的代表性免疫印跡。來自flcn[LKO]小鼠并轉(zhuǎn)染Mu FLCN的原代肝細胞接受或不接受60 μM Bya處理12小時；隨后，肝細胞進行氨基酸饑餓60分鐘，再補充氨基酸45分鐘。（M）肝細胞中TFEB亞細胞定位的代表性熒光圖像及TFEB核定位定量；比例尺：10 μm。來自flcn[LKO]小鼠并轉(zhuǎn)染Mu FLCN的原代肝細胞接受或不接受60 μM Bya處理12小時。數(shù)據(jù)采用單因素方差分析并進行Tukey檢驗，以均值 ± SEM表示。**p < 0.01。

FLCN的MET370和PHE552是Bya發(fā)揮抗MASH作用所必需的關(guān)鍵位點

在確認Bya通過MET370和PHE552殘基結(jié)合FLCN后，研究者進一步探討這兩個殘基是否決定Bya對MASH的改善作用。研究者利用AAV遞送方式，將WT FLCN或Mu FLCN引入肝細胞特異性flcn缺失小鼠，并分別給予HFHC、MCD或HFD飲食。

結(jié)果顯示，在注射AAV-WT FLCN的flcn缺失HFHC或HFD飲食小鼠中，Bya可降低體重、肝重、LW/BW、肝臟脂肪變性以及血清GPT和GOT1水平；但在注射AAV-Mu FLCN的小鼠中，這些降低效應(yīng)不再出現(xiàn)。在注射AAV-Mu FLCN的flcn缺失MCD飲食小鼠中，Bya也不能影響肝臟脂肪變性以及血清GPT和GOT1水平。

此外，在注射AAV-Mu FLCN的flcn缺失HFHC或HFD飲食小鼠中，Bya降低空腹血糖、空腹胰島素和HOMA-IR的作用同樣消失。重新引入突變型FLCN后，HFHC或HFD飲食小鼠的葡萄糖耐受和胰島素敏感性也不受Bya影響。在注射AAV-Mu FLCN的flcn缺失小鼠中，Bya不能抑制HFHC、HFD或MCD誘導(dǎo)的肝臟炎癥細胞浸潤和NFKB信號過度激活，也不能緩解HFHC或MCD誘導(dǎo)的肝纖維化。綜上，這些結(jié)果表明，F(xiàn)LCN的MET370和PHE552是Bya改善MASH和MASLD所必需的關(guān)鍵殘基。

圖7：FLCN的Met370和Phe552是Bya發(fā)揮抗MASH作用所必需的位點。（A）實驗策略示意圖。flcn[LKO]小鼠注射AAV-WT FLCN或AAV-Mu FLCN，并給予HFHC飲食12周；隨后，在繼續(xù)給予HFHC飲食的同時，通過腹腔注射給予或不給予Bya（24 mg/kg，每2天一次）額外處理4周。（B–E）不同組小鼠的體重、肝重、LW/BW和肝臟TG含量。（F）肝組織切片代表性H&E染色（比例尺：100 μm）、油紅O染色（比例尺：100 μm）、MPO染色（比例尺：10 μm）和天狼星紅染色（比例尺：100 μm）。（G）血清GPT和GOT1水平。（H和I）空腹血糖和空腹胰島素水平。（J）HOMA-IR。（K和L）GTT和ITT。（M）肝臟中參與胰島素信號相關(guān)蛋白的代表性免疫印跡。（N和O）肝臟中FLCN以及參與炎癥和纖維化相關(guān)蛋白的代表性免疫印跡。n = 6只小鼠/組。數(shù)據(jù)采用單因素方差分析并進行Tukey檢驗，以均值 ± SEM表示。*p < 0.05，**p < 0.01。

機制示意圖總結(jié)

綜合上述結(jié)果，研究者提出了Bya緩解MASH的機制模型：Bya直接結(jié)合FLCN的MET370和PHE552位點，阻斷FLCN與FNIP1/FNIP2之間的相互作用，從而選擇性抑制非經(jīng)典MTORC1信號，減少TFEB磷酸化。未被磷酸化的TFEB進入細胞核，激活促進自噬-溶酶體通路的相關(guān)基因，最終有助于緩解小鼠MASH表型。

圖8：Bya通過選擇性抑制非經(jīng)典MTORC1信號通路緩解MASH。Bya直接結(jié)合FLCN，抑制FLCN與FNIP1/FNIP2之間的相互作用，進而阻斷MTORC1介導(dǎo)的TFEB磷酸化。未磷酸化的TFEB轉(zhuǎn)位進入細胞核，并激活促進自噬-溶酶體通路的基因，從而有助于緩解MASH。該圖由Figdraw繪制。

【貢獻】★★★★★

總體而言，研究者提出了一個作用模型：Bya可直接結(jié)合FLCN的MET370和PHE552位點，并阻斷FLCN-FNIP1/FNIP2相互作用，從而選擇性抑制MTORC1，隨后降低TFEB磷酸化。因此，Bya在小鼠中顯示出改善MASH的作用。

本研究不僅證明了Bya對MASH的干預(yù)效果，也為通過靶向FLCN-MTORC1-TFEB信號通路治療MASH提供了新的研究方向。

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