Life Metab｜瞄準(zhǔn)ASCVD長期降脂難題：結(jié)構(gòu)指導(dǎo)設(shè)計(jì)PCSK9表位疫苗，兼具持久抗體應(yīng)答與抗動(dòng)脈粥樣硬化潛力！(肖瑞平—北京大學(xué)）

2026年5月26日，北京大學(xué)未來技術(shù)學(xué)院肖瑞平團(tuán)隊(duì)，聯(lián)合長春生物制品研究所有限責(zé)任公司、北京生物制品研究所有限責(zé)任公司等單位，在Life Metabolism在線發(fā)表題為 “Structure-guided design of a PCSK9 epitope vaccine with efficacy against hyperlipidemia and atherosclerosis” 的研究論文。該文于 2025年12月1日投稿，2026年5月15日修回，2026年5月19日接收，2026年5月26日在線發(fā)表。

低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）升高是動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病（ASCVD）的重要危險(xiǎn)因素。前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素/kexin 9型（PCSK9）通過促進(jìn)肝細(xì)胞表面LDL受體（LDLR）降解，減少LDL-C清除，因此已成為降脂治療的重要靶點(diǎn)。現(xiàn)有PCSK9單克隆抗體和siRNA藥物雖已顯示明確降脂作用，但仍存在價(jià)格較高、需反復(fù)給藥、長期依從性受限等問題。

本研究采用結(jié)構(gòu)指導(dǎo)的疫苗設(shè)計(jì)策略，整合Protein Data Bank（PDB）中PCSK9–抗體復(fù)合物結(jié)構(gòu)與AlphaFold3預(yù)測結(jié)果，從PCSK9–抗體結(jié)合界面中篩選B細(xì)胞表位，并與異源T輔助細(xì)胞（Th）表位融合，構(gòu)建PCSK9肽類表位疫苗。研究顯示，候選疫苗PVC3在CpG聯(lián)合鋁佐劑（CpG + Alum）配方下，可在小鼠、豚鼠和恒河猴中誘導(dǎo)強(qiáng)而持久的抗PCSK9抗體反應(yīng)。

在機(jī)制設(shè)計(jì)上，研究團(tuán)隊(duì)首先基于結(jié)構(gòu)分析獲得6個(gè)PCSK9–抗體復(fù)合物結(jié)構(gòu)，并根據(jù)抗體結(jié)合界面中PCSK9殘基的埋藏表面積（BSA）篩選候選表位。進(jìn)一步的多序列比對(duì)顯示，3個(gè)候選肽段在19個(gè)物種中均具有較高保守性，提示這些區(qū)域可能位于PCSK9功能關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，也支持其在動(dòng)物模型中的免疫反應(yīng)具有一定轉(zhuǎn)化參考價(jià)值。

在免疫原性評(píng)價(jià)中，3個(gè)候選疫苗中僅PVC3能夠誘導(dǎo)明顯的PCSK9特異性IgG反應(yīng)。研究進(jìn)一步優(yōu)化佐劑后發(fā)現(xiàn)，Alum + CpG組合顯著優(yōu)于單獨(dú)Alum、單獨(dú)CpG或MF59，可誘導(dǎo)最高水平的PCSK9特異性抗體。劑量篩選顯示，25 μg PVC3誘導(dǎo)的抗體滴度顯著高于10 μg組；抗體亞型分析提示PVC3可誘導(dǎo)IgG1、IgG2a和IgG2b等多種PCSK9特異性IgG亞型，并且抗體反應(yīng)可持續(xù)至第24周。

安全性方面，PVC3疫苗接種小鼠與對(duì)照組相比未見明顯體重差異，BUN、ALT、CRE、AST等肝腎功能相關(guān)血清生化指標(biāo)均處于生理范圍；心、肝、脾、肺、腎等主要臟器組織病理學(xué)檢查未見結(jié)構(gòu)異常或炎癥細(xì)胞浸潤。ELISPOT結(jié)果顯示，完整PVC3疫苗可誘導(dǎo)IFN-γ和IL-4反應(yīng)，而單獨(dú)PCSK9 B細(xì)胞表位PEC3未誘導(dǎo)可檢測的細(xì)胞因子分泌，提示該表位本身未觸發(fā)T細(xì)胞介導(dǎo)免疫，降低了針對(duì)內(nèi)源性PCSK9產(chǎn)生自身免疫反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。

在藥效評(píng)價(jià)中，研究分別采用AAV-hPCSK9D374Y誘導(dǎo)的預(yù)防性高膽固醇血癥小鼠模型和ApoE?/?治療性模型。預(yù)防模型中，PVC3疫苗可顯著抑制AAV誘導(dǎo)的LDL-C和總膽固醇升高，并減少肝臟脂質(zhì)積累。治療模型中，PVC3疫苗同樣可減緩ApoE?/?小鼠LDL-C升高，第4周和第14周LDL-C水平較對(duì)照組分別降低29%和20%，同時(shí)減輕肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積。

更進(jìn)一步，PVC3疫苗還在ApoE?/?小鼠中減輕動(dòng)脈粥樣硬化病變。全主動(dòng)脈Oil Red O染色顯示，疫苗組主動(dòng)脈病變面積占總主動(dòng)脈表面積的18.9%，低于對(duì)照組的29.8%；主動(dòng)脈根部橫截面分析也顯示，疫苗組斑塊面積和壞死核心比例下降，提示該疫苗不僅影響循環(huán)LDL-C水平，也可能減緩動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成和進(jìn)展。

值得注意的是，在恒河猴研究中，PVC3疫苗同樣能夠誘導(dǎo)較強(qiáng)PCSK9特異性抗體反應(yīng)，并維持16周；血清BUN、ALT、CRE、AST均處于正常范圍，ELISPOT也未提示異常自身免疫激活。然而，與小鼠模型不同，恒河猴血漿LDL-C、TC、HDL-C和TG等脂質(zhì)指標(biāo)較對(duì)照組未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。這說明PVC3在非人靈長類動(dòng)物中具有良好免疫原性，但其降脂效果可能受動(dòng)物模型、基礎(chǔ)血脂狀態(tài)或代謝補(bǔ)償機(jī)制影響，仍需進(jìn)一步優(yōu)化。

總體來看，該研究提出了一種結(jié)構(gòu)指導(dǎo)設(shè)計(jì)的PCSK9肽類表位疫苗策略。PVC3可在多種動(dòng)物中誘導(dǎo)持久抗PCSK9抗體，并在高膽固醇血癥小鼠模型中降低LDL-C、減輕肝臟脂質(zhì)沉積和動(dòng)脈粥樣硬化病變。雖然其在健康恒河猴中尚未顯示明確降脂效果，但該研究為PCSK9靶向疫苗的進(jìn)一步優(yōu)化和臨床轉(zhuǎn)化提供了重要的前臨床依據(jù)。OUP頁面也標(biāo)注該文目前為 accepted manuscript，后續(xù)正式排版版本可能會(huì)有細(xì)節(jié)調(diào)整，但DOI保持不變。

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【摘要】

前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素/kexin 9型（PCSK9）在調(diào)控低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平中發(fā)揮核心作用，已成為動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病（ASCVD）治療中備受關(guān)注的靶點(diǎn)。盡管靶向PCSK9的單克隆抗體已顯示出明確臨床療效，但其成本較高，且需要反復(fù)給藥，這限制了其廣泛應(yīng)用。

本研究基于Protein Data Bank（PDB）結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)和AlphaFold3預(yù)測結(jié)果，從PCSK9–抗體復(fù)合物中識(shí)別B細(xì)胞表位，并將其與異源T輔助細(xì)胞表位融合，開發(fā)了一種肽類疫苗。在CpG聯(lián)合鋁佐劑（CpG + Alum）配方下，該疫苗可在小鼠、豚鼠和恒河猴中誘導(dǎo)強(qiáng)而持久的抗PCSK9抗體反應(yīng)。

在預(yù)防性和治療性小鼠模型中，該疫苗顯著降低LDL-C水平，并減輕肝臟脂質(zhì)積累。此外，該疫苗還減緩了動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的進(jìn)展。在動(dòng)物模型中，該疫苗未顯示出系統(tǒng)毒性或自身免疫反應(yīng)跡象。

這些發(fā)現(xiàn)提示，通過主動(dòng)免疫靶向PCSK9，該疫苗可能成為控制高膽固醇血癥和預(yù)防ASCVD的一種安全、有效且具有可規(guī)模化潛力的策略。

關(guān)鍵詞：PCSK9；AlphaFold3；高脂血癥；動(dòng)脈粥樣硬化；疫苗

01

研究背景及科學(xué)問題

心血管疾病（CVDs）仍是全球發(fā)病和死亡的首要原因，而動(dòng)脈粥樣硬化是其中多數(shù)疾病的重要病理基礎(chǔ)。在動(dòng)脈粥樣硬化的主要危險(xiǎn)因素中，高脂血癥，尤其是低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平升高，發(fā)揮著核心作用。全球25歲及以上成年人中，超過39%存在膽固醇升高問題，每年與此相關(guān)的死亡人數(shù)超過450萬。在中國，心血管疾病長期位居死亡原因首位，約占總死亡人數(shù)的五分之二。隨著城市化進(jìn)程加快和生活方式改變，血脂異常負(fù)擔(dān)迅速上升，近期全國調(diào)查顯示，近40%的成年人存在血脂異常。因此，有效控制血漿膽固醇水平，尤其是LDL-C，已成為預(yù)防和管理動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病（ASCVD）的關(guān)鍵策略。

PCSK9是LDL-C代謝的重要調(diào)節(jié)因子。它是一種主要由肝臟分泌的絲氨酸蛋白酶。PCSK9的催化結(jié)構(gòu)域可與肝細(xì)胞表面的低密度脂蛋白受體（LDLR）結(jié)合，促使LDLR內(nèi)吞并在溶酶體中降解。PCSK9功能獲得性突變可導(dǎo)致早發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化，而功能缺失性突變則與LDL-C水平降低和心血管風(fēng)險(xiǎn)下降相關(guān)。正因如此，PCSK9–LDLR軸在脂質(zhì)調(diào)控中的關(guān)鍵作用，使其成為治療干預(yù)的重要靶點(diǎn)。

目前，臨床血脂異常管理已有多種治療策略，包括他汀類藥物、依洛尤單抗、阿利西尤單抗、托萊西單抗等單克隆抗體，以及Inclisiran等小干擾RNA（siRNA）藥物。他汀類藥物通過抑制3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶，減少內(nèi)源性膽固醇合成并促進(jìn)LDL-C清除，仍是標(biāo)準(zhǔn)一線治療方案。然而，他汀類藥物常與肌肉相關(guān)癥狀、肝毒性等副作用有關(guān)，可能導(dǎo)致患者依從性下降甚至中斷治療。

靶向PCSK9的單克隆抗體可阻斷PCSK9與LDLR相互作用，從而增強(qiáng)LDL-C清除。與他汀聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，這類抗體可在他汀治療基礎(chǔ)上進(jìn)一步降低LDL-C約50%–60%。不過，這類治療通常需要每2–4周進(jìn)行一次皮下注射，長期依從性可能受到影響。Inclisiran等siRNA藥物通過沉默肝臟PCSK9表達(dá)發(fā)揮作用，給藥間隔較長，通常為首次給藥后3個(gè)月進(jìn)行第二次給藥，之后每6個(gè)月維持給藥一次。口服小分子抑制劑CVI-LM001可阻斷LDLR內(nèi)吞和降解，從而降低血漿LDL-C水平，但目前仍處于臨床階段。

盡管這些PCSK9靶向干預(yù)已顯示療效，其廣泛應(yīng)用仍受到高成本和反復(fù)給藥需求的限制。因此，亟需開發(fā)替代策略，在實(shí)現(xiàn)強(qiáng)效降脂的同時(shí)，提高長期ASCVD管理和預(yù)防中的可及性、經(jīng)濟(jì)性和便利性。

疫苗長期以來在感染性疾病預(yù)防中發(fā)揮重要作用，如今也被用于探索慢性疾病的預(yù)防和治療。在這一背景下，靶向PCSK9的疫苗可能為長期、低成本控制LDL-C水平并降低心血管風(fēng)險(xiǎn)提供新策略。既往PCSK9疫苗設(shè)計(jì)主要采用PCSK9完整催化結(jié)構(gòu)域作為免疫原，或基于PCSK9與LDLR之間的結(jié)構(gòu)界面選擇表位。與之不同，本研究采用了一種新的表位設(shè)計(jì)策略：通過整合AlphaFold3預(yù)測的PCSK9結(jié)構(gòu)信息和PDB中已有實(shí)驗(yàn)結(jié)構(gòu)，識(shí)別候選表位區(qū)域。這種由抗體結(jié)構(gòu)指導(dǎo)的設(shè)計(jì)方法，為表位篩選提供了更有針對(duì)性的依據(jù)，也是本研究的重要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)。

為增強(qiáng)免疫原性并降低免疫耐受風(fēng)險(xiǎn)，研究團(tuán)隊(duì)在疫苗構(gòu)建中加入了異源病毒來源的T輔助細(xì)胞（Th）表位。隨后，研究在多種小鼠模型和非人靈長類動(dòng)物（NHPs）中評(píng)價(jià)該疫苗的效果，以評(píng)估其在高膽固醇血癥預(yù)防和治療中的潛力。研究結(jié)果提示，結(jié)合Th表位的PCSK9表位疫苗，可能成為預(yù)防和治療高脂血癥及動(dòng)脈粥樣硬化的一種有前景的干預(yù)方式。

02

重要發(fā)現(xiàn)及亮點(diǎn)

基于結(jié)構(gòu)和保守性分析篩選PCSK9候選表位

研究團(tuán)隊(duì)首先利用AlphaFold3預(yù)測結(jié)果和PDB數(shù)據(jù)庫中已有晶體結(jié)構(gòu)，共獲得6個(gè)PCSK9–抗體復(fù)合物結(jié)構(gòu)。對(duì)于每一個(gè)結(jié)構(gòu)，研究計(jì)算了抗體結(jié)合界面中PCSK9各殘基的埋藏表面積（BSA）。根據(jù)BSA數(shù)值，研究篩選出3個(gè)BSA最高的肽段區(qū)域作為候選表位。

以候選肽3為例，其與抗體結(jié)合時(shí)總BSA達(dá)到466.7 ?2，并在結(jié)合界面形成多個(gè)穩(wěn)定氫鍵。這些結(jié)構(gòu)特征提示，候選肽3具有作為構(gòu)象性B細(xì)胞表位的潛力，并可能在抗原識(shí)別中發(fā)揮重要作用。

為進(jìn)一步驗(yàn)證這些候選表位的潛力，研究對(duì)來自19個(gè)不同物種的PCSK9同源序列進(jìn)行了多序列比對(duì)。結(jié)果顯示，3個(gè)候選肽段在所分析物種中均具有較高序列保守性。這種跨物種保守性說明兩點(diǎn)：一是這些肽段可能位于PCSK9功能上重要的區(qū)域；二是在動(dòng)物模型，尤其是嚙齒類動(dòng)物和非人靈長類動(dòng)物中由這些表位誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)，可能具有向人類研究轉(zhuǎn)化的參考價(jià)值。綜合來看，這3個(gè)肽段被認(rèn)為是具有潛力的疫苗抗原候選區(qū)域。

圖1：從PCSK9–抗體復(fù)合物中識(shí)別候選表位。（a）PDB數(shù)據(jù)庫中PCSK9與相應(yīng)抗體的相互作用結(jié)構(gòu)（PDB：3H42）。PCSK9蛋白以藍(lán)色顯示，抗體重鏈和輕鏈分別以綠色和紫色顯示，候選表位3以黃色顯示。（b）PCSK9–抗體界面處埋藏表面積（BSA）分析。數(shù)值較高的區(qū)域（紅色）提示可能為候選表位。人PCSK9氨基酸編號(hào)從PCSK9催化結(jié)構(gòu)域的第一個(gè)氨基酸開始計(jì)算。AA表示氨基酸。（c）候選表位氨基酸保守性分析。另見補(bǔ)充圖S1和S2。

PVC3疫苗在小鼠和豚鼠中誘導(dǎo)強(qiáng)抗體應(yīng)答

研究篩選出的PCSK9候選表位是長度約10個(gè)氨基酸的短線性肽。由于肽段較短，這類最小表位單獨(dú)給藥時(shí)通常免疫原性較弱。為解決這一問題，研究團(tuán)隊(duì)通過柔性連接肽，將Th表位連接到PCSK9表位的C端。每個(gè)PCSK9候選疫苗（PVC）均采用“PCSK9表位–KKKeK–Th表位”的共同模塊化結(jié)構(gòu)。

為了評(píng)價(jià)候選疫苗的免疫原性，研究將每種候選疫苗以10 μg劑量，并與CpG + Alum復(fù)合佐劑配伍，對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行皮下免疫。研究采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測PCSK9特異性抗體反應(yīng)。在3個(gè)候選疫苗中，只有PVC3誘導(dǎo)出明顯的抗PCSK9 IgG反應(yīng)。其IgG滴度逐漸升高，并在第4周達(dá)到約3.2（log10）的幾何平均滴度（GMT）。相比之下，PVC1和PVC2在整個(gè)觀察期內(nèi)均未誘導(dǎo)出高于基線水平的可檢測PCSK9特異性抗體，提示其免疫原性不足。

為篩選PVC3肽類疫苗的最佳佐劑，研究比較了4種配方：單獨(dú)Alum，即常規(guī)偏向Th2反應(yīng)的佐劑；單獨(dú)CpG寡脫氧核苷酸，即可促進(jìn)Th1偏向反應(yīng)的強(qiáng)Toll樣受體9（TLR9）激動(dòng)劑；MF59，即一種獲批用于人流感疫苗的角鯊烯水包油乳劑；以及Alum和CpG聯(lián)合配方，即混合Th1/Th2佐劑。第28天采集血清后發(fā)現(xiàn)，Alum + CpG聯(lián)合配方明顯優(yōu)于其他配方，可誘導(dǎo)最高水平的PCSK9特異性抗體，與其他各組相比差異顯著（P < 0.001）。雖然單獨(dú)Alum和單獨(dú)CpG也可產(chǎn)生可檢測抗體反應(yīng)，但滴度明顯低于聯(lián)合配方。MF59雖然在其他疫苗平臺(tái)中具有一定效果，但在該P(yáng)CSK9肽類疫苗模型中未顯示更優(yōu)反應(yīng)。因此，Alum + CpG被選為后續(xù)研究的標(biāo)準(zhǔn)佐劑配方。

隨后，研究進(jìn)一步確定最佳免疫劑量。BALB/c小鼠分別接種2.5 μg、10 μg或25 μg PVC3，并均采用Alum + CpG配方。結(jié)果顯示，25 μg劑量誘導(dǎo)的抗體滴度（GMT 4.7）顯著高于10 μg組（GMT 2.8），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.001）。

為了進(jìn)一步刻畫PVC3誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)，研究檢測了第4周血清樣本中的IgG亞型。PVC3接種可誘導(dǎo)PCSK9特異性IgG1、IgG2a和IgG2b的明顯升高，三者GMT均超過3。其中IgG1為優(yōu)勢亞型，GMT為3.8，顯著高于對(duì)照動(dòng)物（P < 0.001），提示該疫苗誘導(dǎo)了較強(qiáng)的Th2偏向免疫反應(yīng)。多種IgG亞型的出現(xiàn)說明該疫苗可誘導(dǎo)較廣泛、相對(duì)平衡的體液免疫反應(yīng)，這可能有助于形成更全面的免疫保護(hù)。

研究還檢測了抗體反應(yīng)的持久性。血清抗體滴度隨訪至第24周時(shí)，抗體GMT仍保持在4.2，與早期時(shí)間點(diǎn)相比未見明顯下降，說明PVC3誘導(dǎo)的體液免疫具有較長持續(xù)性。為評(píng)價(jià)PVC3的跨物種免疫原性，研究以50 μg劑量免疫豚鼠。第4周時(shí)，豚鼠PCSK9特異性IgG滴度達(dá)到GMT 3.8，說明該疫苗在豚鼠中同樣具有較強(qiáng)免疫原性。

總體而言，這些結(jié)果表明，PVC3疫苗能夠誘導(dǎo)強(qiáng)而持久的抗PCSK9抗體反應(yīng)，支持其作為有效疫苗候選物的潛力。

圖2：PCSK9疫苗在小鼠和豚鼠中的免疫原性。（a）疫苗構(gòu)建示意圖，顯示PCSK9候選表位通過柔性連接肽與Th表位相連。（b）BALB/c小鼠免疫流程圖，第0周進(jìn)行初次免疫，第2周加強(qiáng)免疫。3種候選疫苗各10 μg，并與CpG + Alum復(fù)合佐劑混合。生理鹽水作為對(duì)照，其中100 μL經(jīng)皮下注射至BALB/c小鼠。（c）不同PVC誘導(dǎo)抗體反應(yīng)的比較。在第0、2和4周采集血液樣本并分離血清。采用ELISA檢測抗PCSK9抗體，結(jié)果以10為底的對(duì)數(shù)表示。（d）不同佐劑配方下PCV3疫苗在BALB/c小鼠中誘導(dǎo)抗體反應(yīng)的比較。CpG + Alum表示CpG與鋁佐劑聯(lián)合；CpG表示單獨(dú)CpG佐劑；Alum表示單獨(dú)鋁佐劑；MF59表示MF59佐劑；Mock表示空白對(duì)照組。小鼠免疫、采血和抗體檢測方法與圖2b一致。（e）小鼠接種2.5、10或25 μg PVC3疫苗后的劑量依賴性抗體反應(yīng)。小鼠免疫、采血和抗體檢測方法與圖2b一致。（f）25 μg劑量免疫小鼠后抗PCSK9抗體的同種型分布，包括IgG1、IgG2a和IgG2b。第4周采集血清，并采用ELISA方法分析。（g）小鼠24周內(nèi)抗體反應(yīng)的持久性。（h）豚鼠免疫流程圖，第0周進(jìn)行初次免疫，第2周加強(qiáng)免疫。第0、2和4周采集血液樣本并分離血清。（i）豚鼠血清中PCSK9特異性IgG滴度的時(shí)間變化曲線。所有數(shù)據(jù)均以均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤（SEM）表示。樣本量為每組n = 6。統(tǒng)計(jì)分析采用非配對(duì)Student’s t檢驗(yàn)（f）、單因素方差分析并進(jìn)行Tukey事后檢驗(yàn)（d），以及雙因素方差分析并進(jìn)行Sidak事后檢驗(yàn)（a、e、g和i）。*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001。

PCSK9疫苗顯示良好安全性特征

疫苗安全性是其臨床可行性和長期可靠性的重要基礎(chǔ)。本研究中，疫苗接種組與對(duì)照組小鼠體重?zé)o顯著差異，提示未出現(xiàn)明顯系統(tǒng)毒性。血清生化指標(biāo)，包括血尿素氮（BUN）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、肌酐（CRE）和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST），在各組中均保持在生理范圍內(nèi)，提示沒有腎功能或肝功能損傷證據(jù)。主要器官，包括心、肝、脾、肺和腎的組織病理學(xué)分析也未發(fā)現(xiàn)疫苗接種動(dòng)物出現(xiàn)結(jié)構(gòu)異常或炎癥細(xì)胞浸潤，進(jìn)一步支持該疫苗具有較好的安全性。

為評(píng)估自身免疫反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)，研究采用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（ELISPOT）檢測免疫后脾細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生情況。脾細(xì)胞經(jīng)完整PVC3疫苗刺激后，可觀察到明顯的干擾素-γ（IFN-γ）和白細(xì)胞介素-4（IL-4）反應(yīng)，證實(shí)T細(xì)胞被激活。相比之下，單獨(dú)使用PCSK9 B細(xì)胞表位PEC3刺激時(shí)，未誘導(dǎo)可檢測的細(xì)胞因子分泌，說明該表位本身并未觸發(fā)T細(xì)胞介導(dǎo)免疫。這提示免疫系統(tǒng)并未將內(nèi)源性PCSK9識(shí)別為自身抗原，從而降低自身免疫風(fēng)險(xiǎn)。

圖3：PCSK9疫苗安全性評(píng)價(jià)。（a）接種疫苗或佐劑對(duì)照的BALB/c小鼠在4周內(nèi)的體重監(jiān)測。（b）血清生化標(biāo)志物分析。BALB/c小鼠接種25 μg PVC3疫苗或Mock對(duì)照后，于第12周采血并分離血清。隨后采用相應(yīng)檢測試劑盒檢測肝腎功能相關(guān)血清生化指標(biāo)，包括BUN、CRE、ALT和AST。（c）實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)，免疫組和對(duì)照組小鼠主要器官，包括心、肝、脾、肺和腎的代表性HE染色圖像。比例尺：20 μm。（d）ELISPOT分析脾細(xì)胞在PVC3疫苗、PEC3或Mock刺激下產(chǎn)生IFN-γ和IL-4的情況。小鼠于第4周處死并采集脾臟。所有數(shù)據(jù)均以均值 ± SEM表示。樣本量為每組n = 6。統(tǒng)計(jì)分析采用非配對(duì)Student’s t檢驗(yàn)（b）和雙因素方差分析并進(jìn)行Sidak事后檢驗(yàn)（a）。*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001。

PCSK9疫苗在預(yù)防性小鼠模型中抑制LDL-C升高并減輕肝臟脂質(zhì)積累

為研究PVC3疫苗對(duì)高膽固醇血癥的預(yù)防效果，研究團(tuán)隊(duì)采用了靜脈注射編碼人PCSK9D374Y的腺相關(guān)病毒（AAV-hPCSK9D374Y）誘導(dǎo)小鼠模型。BALB/c小鼠在第0周和第2周皮下接種PVC3疫苗，并在第2周經(jīng)尾靜脈注射AAV。與前述結(jié)果一致，該疫苗誘導(dǎo)了強(qiáng)PCSK9特異性抗體反應(yīng)，GMT超過4.6（P < 0.001），并持續(xù)至14周。

在第2周AAV給藥前，Mock組和PVC3接種組的基線LDL-C水平相近，分別為1.79和1.76 mmol/L（P > 0.99）。至第4周AAV給藥后，Mock組血清LDL-C明顯升高，而PVC3接種小鼠未出現(xiàn)類似升高，二者分別為3.05和1.75 mmol/L（P < 0.05），提示該疫苗可顯著抑制LDL-C升高。總膽固醇（T-CHO）在第4周也呈現(xiàn)相同趨勢，接種組表現(xiàn)出明顯抑制作用，兩組分別為4.94和2.90 mmol/L（P < 0.05）。值得注意的是，各組高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和甘油三酯（TG）水平未見差異，提示該疫苗對(duì)LDL-C調(diào)節(jié)具有一定選擇性。

組織學(xué)分析進(jìn)一步支持上述發(fā)現(xiàn)。HE染色和Oil Red O染色均顯示，與對(duì)照組相比，PVC3處理小鼠肝臟脂質(zhì)積累減少，提示該疫苗對(duì)肝臟脂肪變性具有一定保護(hù)作用。

圖4：PCSK9疫苗在預(yù)防性小鼠模型中的效果。（a）預(yù)防模型實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。BALB/c小鼠接受兩次皮下免疫。第2周，免疫后小鼠經(jīng)尾靜脈注射AAV-hPCSK9D374Y。（b）抗PCSK9抗體滴度隨時(shí)間變化。每2周采集小鼠血液樣本，并采用ELISA檢測抗體（第0–14周）。（c）采用血脂檢測試劑盒測定小鼠血脂譜。LDL-C（左）、T-CHO（中左）、HDL-C（中右）和TG（右）。（d）實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)，免疫組和對(duì)照組小鼠肝組織代表性HE染色圖像（左）及定量分析（右）。（e）實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)，免疫組和對(duì)照組小鼠肝組織代表性O(shè)il Red O染色圖像（左）及定量分析（右）。所有數(shù)據(jù)均以均值 ± SEM表示。統(tǒng)計(jì)分析采用雙因素方差分析并進(jìn)行Sidak事后檢驗(yàn)（b和c）。*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001。比例尺：100 μm。

PCSK9疫苗在治療性小鼠模型中緩解高脂血癥相關(guān)病理改變

為評(píng)估PVC3疫苗在血脂異常模型中的治療潛力，研究采用ApoE?/?小鼠。該模型可自發(fā)形成高膽固醇血癥和動(dòng)脈粥樣硬化病變。17–18周齡小鼠在第0周和第2周接受兩劑PVC3疫苗皮下免疫，血清樣本每2周采集一次，持續(xù)至第14周。接種疫苗后，小鼠產(chǎn)生了強(qiáng)PCSK9特異性IgG反應(yīng)，第4周GMT達(dá)到4.7，說明體液免疫反應(yīng)成功被誘導(dǎo)。

血清脂質(zhì)分析顯示，與Mock組相比，PVC3接種顯著減緩LDL-C升高。對(duì)照小鼠在整個(gè)觀察期間LDL-C水平持續(xù)處于高位，第4周達(dá)到16.5 mmol/L，第14周達(dá)到20.3 mmol/L。相比之下，PVC3接種小鼠LDL-C升高速度明顯較慢，第4周為12.7 mmol/L，第14周為16.0 mmol/L，相較對(duì)照組分別降低29%和20%（P < 0.01）。T-CHO水平也出現(xiàn)類似降低，而HDL-C和TG水平未受影響，這與預(yù)防模型中觀察到的血脂變化模式一致。

肝組織病理學(xué)評(píng)價(jià)顯示，疫苗接種小鼠肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積累減少，HE染色和Oil Red O染色均證實(shí)了這一結(jié)果。這些發(fā)現(xiàn)表明，PVC3疫苗不僅可預(yù)防高脂血癥相關(guān)異常，也可在治療性模型中緩解高脂血癥相關(guān)病理改變。

圖5：PCSK9疫苗在治療性小鼠模型中的效果。（a）治療性ApoE?/?模型實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。ApoE?/?小鼠于第0周和第2周接受兩次皮下免疫。從第0周至第14周，每2周采集一次血液樣本。（b）抗PCSK9抗體滴度隨時(shí)間變化。分離第0–14周采集血液樣本中的血清后，采用ELISA方法檢測抗體。（c）采用血脂檢測試劑盒測定小鼠血脂譜。LDL-C（左）、T-CHO（中左）、HDL-C（中右）和TG（右）。（d）實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)，免疫組和對(duì)照組小鼠肝組織代表性HE染色圖像（左）及定量分析（右）。（e）實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)，免疫組和對(duì)照組小鼠肝組織代表性O(shè)il Red O染色圖像（左）及定量分析（右）。所有數(shù)據(jù)均以均值 ± SEM表示。統(tǒng)計(jì)分析采用雙因素方差分析并進(jìn)行Sidak事后檢驗(yàn)（b和c）。*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001。比例尺：100 μm。

PCSK9疫苗減輕ApoE?/?小鼠動(dòng)脈粥樣硬化病變

鑒于PVC3疫苗具有較強(qiáng)降脂作用，研究進(jìn)一步評(píng)估其對(duì)ApoE?/?小鼠動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展的影響。全主動(dòng)脈Oil Red O染色顯示，接種疫苗的小鼠主動(dòng)脈病變面積顯著減少，占總主動(dòng)脈表面積的18.9%；而對(duì)照組為29.8%。這說明疫苗可明顯降低整體動(dòng)脈粥樣硬化負(fù)擔(dān)。

此外，主動(dòng)脈根部橫截面分析顯示，與Mock組相比，PVC3接種顯著降低病變面積。疫苗組病變面積為0.7 mm2，Mock組為1.0 mm2。疫苗還降低壞死核心占總斑塊面積的比例，疫苗組為10.1%，Mock組為22.0%。這些結(jié)果提示，該疫苗不僅可降低循環(huán)LDL-C水平，還可能對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化病變形成和進(jìn)展產(chǎn)生保護(hù)作用。

圖6：PCSK9疫苗對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的影響。（a）治療性研究結(jié)束時(shí)，即第14周，疫苗組和對(duì)照組ApoE?/?小鼠全主動(dòng)脈Oil Red O染色代表性圖像。（b）第14周主動(dòng)脈根部動(dòng)脈粥樣硬化病變面積測定。（c）第14周疫苗組和對(duì)照組小鼠主動(dòng)脈根部切片代表性HE染色圖像，并對(duì)壞死核心面積進(jìn)行定量。比例尺：500 μm。

PCSK9疫苗在非人靈長類動(dòng)物中誘導(dǎo)抗體反應(yīng)，但降脂效果仍需優(yōu)化

為進(jìn)一步評(píng)估PVC3疫苗的轉(zhuǎn)化潛力，研究在恒河猴中進(jìn)行了兩劑肌肉免疫實(shí)驗(yàn)。該疫苗誘導(dǎo)了強(qiáng)PCSK9特異性抗體反應(yīng)，第8周GMT超過4.3（P < 0.001），并維持至第16周。血清生化參數(shù)，包括BUN、ALT、CRE和AST，在各組中均處于正常生理范圍，提示未見肝腎毒性跡象。此外，ELISPOT分析未發(fā)現(xiàn)針對(duì)內(nèi)源性PCSK9表位的異常IFN-γ或IL-4反應(yīng)，進(jìn)一步證實(shí)在非人靈長類動(dòng)物中未觀察到自身免疫激活證據(jù)。

接種疫苗的猴產(chǎn)生了強(qiáng)抗PCSK9 IgG反應(yīng)，其滴度與小鼠和豚鼠中的結(jié)果相近。然而，與對(duì)照組相比，血漿脂質(zhì)參數(shù)，包括LDL-C、TC、HDL-C和TG，均未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異（均P > 0.05）。這些結(jié)果說明，PVC3疫苗在恒河猴中具有較強(qiáng)免疫原性，但其降脂效果可能在大型動(dòng)物模型中存在差異，仍需要進(jìn)一步優(yōu)化。

圖7：PCSK9疫苗在非人靈長類動(dòng)物（NHPs）中的評(píng)價(jià)。（a）恒河猴免疫流程圖，第0周和第4周進(jìn)行免疫。每4周采集一次血液樣本，并分離血清，用于ELISA檢測抗PCSK9抗體。（b）疫苗組和對(duì)照組猴隨時(shí)間變化的抗PCSK9抗體滴度（n = 3/組）。（c）疫苗組和對(duì)照組猴血清生化參數(shù)，包括BUN、CRE、ALT和AST。采用檢測試劑盒檢測第16周血清樣本。（d）ELISPOT分析第8周疫苗組和對(duì)照組猴外周血單個(gè)核細(xì)胞在PVC3疫苗、PEC3或Mock刺激下產(chǎn)生IFN-γ和IL-4的情況。（e）第16周檢測疫苗組和對(duì)照組猴血清脂質(zhì)參數(shù)，包括LDL-C、T-CHO、HDL-C和TG。所有數(shù)據(jù)均以均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤（SEM）表示。

【Citation】:Sun H, Li Z, Hu X, Zhang X, Ma K, Zhang J, Liu C, Xiao R. Structure-guided design of a PCSK9 epitope vaccine with efficacy against hyperlipidemia and atherosclerosis.Life Metabolism.2026;loag013.

【貢獻(xiàn)】★★★★★

本研究基于PCSK9–抗體相互作用的結(jié)構(gòu)信息，開發(fā)了一種新的靶向PCSK9的肽類疫苗。該疫苗能夠誘導(dǎo)強(qiáng)而持久的抗體反應(yīng)，并在高膽固醇血癥小鼠模型中降低LDL-C水平、減輕動(dòng)脈粥樣硬化。雖然其在非人靈長類動(dòng)物中尚未顯示明確降脂效果，這一結(jié)果提示后續(xù)轉(zhuǎn)化仍面臨挑戰(zhàn)，但本研究形成的系統(tǒng)性前臨床評(píng)價(jià)結(jié)果，為進(jìn)一步優(yōu)化和開發(fā)面向人類應(yīng)用的PCSK9靶向疫苗提供了基礎(chǔ)。

同時(shí)，研究也指出了當(dāng)前工作的局限性。由于該疫苗在非人靈長類動(dòng)物模型中未能降低LDL-C，其與他汀類等標(biāo)準(zhǔn)降脂藥物聯(lián)合應(yīng)用的潛在價(jià)值仍需進(jìn)一步評(píng)估。本研究主要集中于疫苗功能評(píng)價(jià)，尚未深入檢測更詳細(xì)的分子機(jī)制，例如肝臟LDLR蛋白水平、循環(huán)游離PCSK9水平，以及體外中和PCSK9介導(dǎo)LDLR降解的能力。未來研究需要進(jìn)一步解決這些問題，以支持PCSK9靶向疫苗的持續(xù)開發(fā)和臨床轉(zhuǎn)化。

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