Cell Rep Med I 精準放療如何避免“傷肝”？大動物模型給出新答案！(張魯迪/惠利健/蔡秀軍/王益凡-中國科學院分子細胞科學卓越創新中心)

2026年5月19日，中國科學院分子細胞科學卓越創新中心/上海生物化學與細胞生物學研究所張魯迪、惠利健團隊聯合浙江大學醫學院附屬邵逸夫醫院蔡秀軍、王益凡團隊，Montefiore Medical Center 與 Albert Einstein College of Medicine Chandan Guha 團隊等，在Cell Reports Medicine （中科院1區，IF=10.6）在線發表題為 “A pig model of human radiation-induced veno-occlusive liver disease reveals ferroptosis as a therapeutic target” 的研究論文。該研究聚焦放射誘導性肝病（RILD）缺乏臨床相關大動物模型、早期發病機制不清以及缺少有效藥物干預手段這一關鍵難題，建立了能夠模擬人類重癥RILD病理特征的小型豬肝臟放療模型，并通過單核轉錄組學揭示肝細胞鐵死亡是RILD早期發生發展的重要驅動因素。進一步研究發現，鐵死亡抑制劑 Liproxstatin-1（Lip-1）不僅能夠阻止RILD進展，還可逆轉組織損傷、恢復肝功能，并促進肝細胞與內皮細胞協同增殖，為RILD防治提供了新的治療靶點和轉化研究平臺。

▼編者按:

該研究首先針對臨床中RILD難以建模的問題，采用低分割立體定向放療方式，對小型豬進行20 Gy、30 Gy和40 Gy不同劑量的全肝照射。結果顯示，20 Gy和30 Gy主要引起可耐受的中度肝損傷，而40 Gy照射后，小型豬在約28天出現食欲下降、體重減輕、乏力、黃疸、腹水以及肝功能指標顯著異常等表現，整體病程與人類重癥RILD高度相似。更重要的是，40 Gy照射能夠誘導肝小葉中央靜脈閉塞、肝竇內皮損傷、小葉中央區壞死和肝纖維化等典型病理改變，從而較好再現了人類放射誘導性靜脈閉塞性肝病的核心特征。

在機制層面，研究團隊發現高劑量肝照射不僅造成嚴重DNA損傷和細胞衰老，還顯著削弱肝臟再生能力。通過對照不同劑量組的細胞增殖標志物，研究顯示20 Gy和30 Gy照射后肝細胞仍具有一定再生反應，而40 Gy照射后肝細胞增殖明顯受阻，并伴隨P21陽性細胞增加和衰老相關分泌表型增強。這提示重癥RILD并非單純由放射損傷累積造成，而是與“肝細胞死亡增加—再生能力下降—內皮和纖維化反應加重”的惡性循環密切相關。

進一步的單核RNA測序分析揭示，RILD早期肝臟中多種細胞類型均發生明顯轉錄改變，其中肝細胞表現出DNA損傷、細胞死亡、細胞周期阻滯和鐵死亡相關通路的顯著激活。研究團隊檢測到脂質過氧化標志物4-HNE增加、鐵離子沉積增強，同時鐵死亡抑制因子SLC7A11和GPX4表達下降，說明鐵死亡貫穿RILD早期和晚期病程。該發現將RILD的關鍵機制從傳統的內皮損傷、炎癥和纖維化擴展到肝細胞鐵死亡，為理解放射性肝損傷提供了新的分子解釋。

在治療驗證方面，研究團隊使用鐵死亡抑制劑 Liproxstatin-1 進行干預。結果顯示，早期給予Lip-1能夠顯著改善照射后小型豬的生存狀態，降低肝損傷相關血清指標，減輕靜脈閉塞、小葉中央壞死和肝纖維化，并促進肝細胞及內皮細胞增殖。該結果表明，鐵死亡抑制不僅具有細胞保護作用，還可能通過改善肝臟微環境和恢復再生程序，推動受損肝組織修復。

總體來看，該研究的創新性主要體現在三個方面：第一，建立了一個更接近人類RILD臨床病理特征的大動物模型，彌補了傳統嚙齒類模型難以模擬靜脈閉塞性肝病和重癥肝壞死的不足；第二，利用單核轉錄組學在疾病早期識別出肝細胞鐵死亡這一關鍵驅動機制；第三，從治療角度證明鐵死亡抑制劑Lip-1具有阻斷RILD進展、逆轉組織損傷和促進肝再生的潛力。該研究不僅為放療相關肝損傷的機制研究提供了重要模型，也為優化肝癌放療方案、改善移植預處理安全性以及開發放射防護藥物提供了新的理論依據和轉化方向。

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【摘要】

放射性肝病（RILD）在放射治療、移植預處理或輻射事故中構成重大的臨床挑戰。然而，由于動物模型有限，其發病機制仍缺乏充分認識。本文建立了一種具有轉化價值的豬模型，該模型在40 Gy照射后4周內再現了人類RILD的病理表現，主要特征包括肝靜脈閉塞性疾病（VOD）和小葉中央壞死。單細胞圖譜分析顯示，鐵死亡是RILD起始階段肝細胞死亡的關鍵驅動因素。使用liproxstatin-1（Lip-1）抑制鐵死亡不僅可以阻止RILD進展，還能逆轉組織學損傷并恢復肝功能。機制上，Lip-1治療可恢復異常的基因表達譜，尤其是與肝細胞鐵死亡相關的基因表達，同時通過肝細胞和內皮細胞的協同增殖促進肝臟再生。本研究確立了鐵死亡抑制作為RILD治療策略的意義，并顯示其在細胞保護和組織再生中的雙重作用。該大型動物模型為優化放射治療方案、改進移植預處理以及開發靶向放射防護藥物提供了可靠平臺。

01

研究背景及科學問題

放射治療（RT）是癌癥治療和移植醫學的重要基礎手段，但其療效受到對放射敏感器官毒性的限制。由于肝臟具有較高的放射敏感性且器官體積較大，因此發生放射性肝病（RILD）的風險較高，這也成為RT中的重要挑戰。此外，在造血干細胞和肝細胞移植的預處理過程中，以及核事故情境下，肝臟同樣容易受到輻射損傷。接受超過35 Gy全肝照射的患者中，RILD發生率可達44%，死亡率為10%–76%。遺憾的是，目前尚無針對RILD的藥物治療方案，這在很大程度上源于對其發病機制的分子層面認識不足。

迄今為止，關于RILD的研究主要依賴臨床觀察以及終末期RILD患者的組織病理學資料。RILD通常在RT后4–8周發生，患者表現為乏力、腹水和堿性磷酸酶（ALP）升高。此外，存在基礎肝病的患者可出現嚴重肝功能障礙，表現為黃疸和血清轉氨酶水平顯著升高。RILD的組織病理學標志是肝靜脈閉塞性疾病（VOD），也稱肝竇阻塞綜合征，其特征是中央靜脈被困于網狀纖維和膠原纖維中的紅細胞所閉塞。這會導致小葉中央壞死和肝星狀細胞（HSC）活化，通常進一步進展為肝纖維化，甚至惡化為肝衰竭。然而，利用患者樣本闡明RILD的發病機制并不可行，主要原因是疾病早期肝組織樣本十分稀缺。因此，建立RILD動物模型對于研究其發病機制、評估藥物療效以及優化RT方案至關重要。

不同物種之間的肝臟放射敏感性存在顯著差異。目前已有的動物模型，包括嚙齒動物、兔、犬和恒河猴，均不能完全再現人類RILD的許多關鍵病理特征，尤其是VOD。相比之下，有研究報道食蟹猴接受40 Gy全肝照射后，在治療10周后中央靜脈出現明顯的靜脈閉塞性改變。然而，這些動物的肝損傷程度較輕，表現為輕度肝纖維化且未見小葉中央壞死，說明其無法模擬嚴重RILD。此外，猴模型的成本和可及性也限制了其廣泛應用。

深入認識RILD的分子機制將有助于開發有效的治療策略。既往研究主要集中于理解輻射誘導肝纖維化的機制，而肝纖維化是受照射嚙齒動物中觀察到的主要組織學改變。TGF-β和Hedgehog（Hh）通路被認為通過促進HSC活化和膠原沉積參與照射后的肝纖維化形成。然而，這些嚙齒動物模型并未發展出VOD，因此RILD，尤其是VOD發生發展的機制仍不清楚。

豬因其在生理、代謝和解剖結構上與人類相似，常被用作大型動物模型。具體而言，豬在人類肝臟重量、肝臟分葉、肝酶譜、血清白蛋白水平以及其他關鍵生理參數方面具有顯著相似性。此外，CFTR（囊性纖維化跨膜電導調節因子）和FAH（延胡索酰乙酰乙酸水解酶）基因受損的豬可出現類似人類的病理表型，例如伴隨嚴重纖維化的進展性肝損傷，而這些表型在小鼠模型中無法再現，這可能與肝臟代謝的物種差異有關。與此同時，豬的體型使臨床相關干預和操作成為可能。基于這些優勢，并考慮到該模型的成本效益和倫理可接受性，本研究選擇豬作為研究對象。本文在小型豬中開展全肝照射劑量遞增研究，建立了一個能夠復制嚴重RILD臨床和組織學特征的豬模型，尤其是VOD和肝壞死。此外，單細胞圖譜分析顯示，RILD早期肝細胞中出現顯著鐵死亡。值得注意的是，使用鐵死亡抑制劑Lip-1治療可顯著阻止RILD發生并改善肝臟再生。總體而言，該豬模型對于理解RILD機制以及評估旨在降低輻射誘導肝毒性、改善患者生存的治療藥物具有重要意義。

02

重要發現及亮點

肝臟照射誘導豬出現RILD的典型表現

鑒于30 Gy被視為臨床最大安全劑量，研究設計了劑量遞增實驗（20、30和40 Gy），以確定小型豬肝臟的放射敏感性。人類RILD通常最早可在照射后28天出現。因此，研究團隊對受照射豬進行了35天監測，通過每周檢測血液生化指標、體重和食欲，并對活檢樣本進行組織學分析，以評估肝毒性。為模擬臨床情境，總劑量采用低分割立體定向體部放療（SBRT）在連續5天內精確遞送，同時未對周圍器官造成致死性不良影響。

接受20 Gy照射的豬（每組n=3）均存活35天，并保持體重穩定。其食欲在第21天短暫下降，并在第28天迅速恢復。與基線相比，第35天ALP和天冬氨酸氨基轉移酶（AST）水平分別顯著升高2.2倍和5.4倍。其他肝功能指標，包括總膽紅素（TBIL）、總膽汁酸（TBA）、血清白蛋白（ALB）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、國際標準化比值（INR）和血氨，在第35天與基線水平相近。尸檢顯示，這些豬未發生腹水。接受30 Gy照射的豬（每組n=3）表現出與20 Gy組相似的表型，提示20和30 Gy均可誘導中度肝損傷，但豬可以耐受。

接受40 Gy處理的豬（每組n=3）從第21天開始出現食欲下降，隨后在第28天出現體重下降、乏力和黃疸。3頭豬中1頭在第33天死亡，另2頭在第35天處于瀕死狀態。與這些癥狀一致，ALP、AST、TBIL和TBA水平在第28天急劇升高，分別為基線的4.5倍、33.0倍、29.6倍和9.5倍，并在第35天仍維持高水平，提示顯著肝損傷。TBIL平均升幅明顯，但個體間差異較大。此外，ALB水平在第35天下降37.1%，提示大量肝細胞喪失。INR和血氨水平仍處于正常范圍，而ALT在受照射豬中僅輕度升高。尸檢還顯示出現腹水。總體來看，這些癥狀最早在第28天出現，并與嚴重RILD患者的臨床特征相似。

綜上，肝臟照射（HIR）對豬肝臟造成的損傷具有劑量依賴性，高劑量HIR可導致豬發生致死性肝功能障礙，類似于更嚴重形式的RILD。

圖1 HIR誘導豬出現RILD的典型表現

（A）對受照射豬進行35天監測以評估肝毒性的示意圖。

（B）對豬實施SBRT的模型示意圖。該圖使用BioRender.com繪制。

（C）放射劑量體積直方圖。

（D）接受不同放射劑量豬的生存曲線（每組n=3）。

（E）照射后豬體重的動態變化（每組n=3）。

（F）照射后豬食欲的動態變化（每組n=3）。

（G–N）照射后豬血液指標的動態變化。檢測指標包括血清ALP（G）、血清AST（H）、TBIL（I）、TBA（J）、ALB（K）、ALT（L）、INR（M）和血氨（N）（每組n=3）。比例尺：100 μm。

數據以均值±SEM表示；p值表示在40 Gy組內比較第28天與第1天（基線）的未配對雙尾t檢驗結果。

HIR誘導豬發生VOD

VOD是RILD的標志性表現，但尚未在動物模型中被充分再現。為研究HIR是否可在豬中誘導VOD，研究團隊對終點肝樣本進行了蘇木精-伊紅（H&E）染色和Masson三色染色。在20 Gy和30 Gy組中，中央靜脈出現明顯組織學改變，包括內皮突出、內皮下炎癥以及向周圍肝竇延伸的中度纖維化，但管腔仍未閉塞。值得注意的是，接受40 Gy照射的豬在中央靜脈出現明顯靜脈閉塞性改變，表現為內膜下水腫、紅細胞外滲和大量膠原沉積，導致中央靜脈完全阻塞。這些結果說明40 Gy可在豬中誘導VOD；因此，研究后續集中于該劑量以分析VOD相關病理特征。

輻射誘導的肝竇內皮細胞（LSECs）和中央靜脈內皮損傷被認為是VOD的主要原因和主要病理特征。針對肝竇內皮標志物的免疫熒光染色，包括淋巴管內皮透明質酸受體1（LYVE1）和血管內皮鈣黏蛋白（VECAD），顯示與未照射對照相比，40 Gy組肝竇密度降低2.4倍，并出現肝竇擴張。CD31染色進一步證實了這些結果。此外，內皮標志物CD31和中央靜脈周圍肝細胞標志物GS的共染顯示，中央靜脈內皮幾乎消失。為進一步識別與VOD相關的表達改變基因和信號通路，研究團隊對40 Gy組受照射肝臟與未照射肝臟進行了整體組織RNA測序分析。基因集富集分析（GSEA）顯示，40 Gy組中異常出血通路和缺氧通路富集，這與既往認識一致：輻射誘導內皮損傷后，擴大內皮下空間內發生出血，是流出道阻塞的主要原因，并可形成缺氧環境。

缺氧環境觸發的小葉中央肝細胞死亡是VOD的另一項重要病理特征，而這一特征在其他RILD動物模型中尚未觀察到。在40 Gy處理豬中，H&E染色顯示肝小葉中央區域出現黃色壞死灶，覆蓋約10.2%的肝實質。MPO免疫熒光染色顯示顯著中性粒細胞浸潤。更重要的是，與未照射肝臟相比，GS陽性肝細胞面積減少16.4倍，進一步證明小葉中央肝細胞大量丟失。這些發現與40 Gy組AST水平顯著升高和ALB水平下降相一致。鑒于ALP和TBA顯著升高，研究團隊進行了MRP2染色，以分析輻射誘導的肝細胞膽小管損傷。與未照射肝臟中連續、放射狀分布的膽小管不同，40 Gy組MRP2陽性膽小管結構紊亂，其密度降低3.1倍，提示肝細胞膽小管嚴重受損。與染色結果一致，GSEA顯示40 Gy組壞死通路顯著富集。相反，主要在中央靜脈周圍肝細胞中表達的CYP通路基因顯著下調，進一步支持存在小葉中央壞死。

除內皮細胞和肝細胞損傷外，VOD患者還會出現HSC活化和進展性肝纖維化，而這些改變與不良預后相關。為判斷40 Gy是否誘導肝纖維化，研究團隊對活化HSC標志物α-SMA進行了免疫熒光染色，發現受照射肝臟中活化HSC數量顯著增加。此外，膠原I和纖連蛋白I免疫熒光染色顯示細胞外基質（ECM）過度積累。Masson三色染色還顯示，40 Gy組膠原體積分數較正常肝臟高4.2倍（22.2%對5.3%），表明40 Gy照射后存在明顯膠原沉積和纖維化。與染色結果一致，GSEA顯示40 Gy組ECM和纖維化通路顯著富集。

綜上，暴露于40 Gy HIR的豬會出現類似人類VOD的病理特征，并伴隨內皮細胞損傷、大量小葉中央壞死和肝纖維化。

圖2 HIR誘導豬發生靜脈閉塞性肝病

（A）照射后35天受照射肝臟H&E和Masson三色染色的代表性圖像。

（B–G）40 Gy和0 Gy條件下照射后35天肝臟LYVE1（B和C）、VE-cadherin（D和E）以及CD31（F和G）免疫熒光染色的代表性圖像與定量結果（每組n=3）。

（H）GSEA分析顯示40 Gy相對于0 Gy中與異常出血和缺氧相關基因的富集情況。左側：0 Gy中較高表達的基因；右側：40 Gy中較高表達的基因。

（I和J）40 Gy和0 Gy條件下照射后35天肝臟H&E染色的代表性圖像及壞死面積定量（每組n=3）。

（K–N）40 Gy和0 Gy條件下照射后35天肝臟GS（K和L）和MRP2（M和N）免疫熒光染色的代表性圖像與定量結果（每組n=3）。

（O）GSEA分析顯示40 Gy相對于0 Gy中與細胞死亡和CYP代謝相關基因的富集情況。左側：0 Gy中較高表達的基因；右側：40 Gy中較高表達的基因。

（P–S）40 Gy和0 Gy條件下照射后35天肝臟α-SMA（P和Q）和膠原I（R和S）免疫熒光染色的代表性圖像與定量結果（每組n=3）。

（T和U）40 Gy和0 Gy條件下照射后35天肝臟Masson三色染色的代表性圖像與定量結果（每組n=3）。正常豬肝小葉由富含膠原的結締組織界定。0 Gy對照中未檢測到壞死。

（V）GSEA分析顯示40 Gy相對于0 Gy中與ECM和纖維化相關基因的富集情況。左側：0 Gy中較高表達的基因；右側：40 Gy中較高表達的基因。比例尺：100 μm。

數據以均值±SEM表示；p值采用未配對雙尾Student t檢驗評估。

高劑量HIR損害豬肝臟再生能力

肝臟在損傷后具有顯著再生能力。然而，相當一部分RILD患者會死于肝衰竭，這可能與肝臟再生受損有關。已有研究顯示，單次低劑量（14 Gy）HIR可在豬中誘導肝細胞增殖。在本研究中，40 Gy可誘導致死性RILD，而被視為臨床最大安全劑量的30 Gy僅造成中度、可耐受的肝損傷。因此，研究團隊評估了接受20、30和40 Gy照射豬的肝臟再生差異。針對磷酸化視網膜母細胞瘤蛋白（pRb）的免疫染色顯示，20和30 Gy組中分別有22.7%和32.4%的細胞為pRb陽性；而40 Gy組僅檢測到5.3%的pRb陽性細胞。此外，Ki67和HNF4A共染顯示，20和30 Gy誘導的肝損傷中分別有2.9%和6%的肝細胞發生增殖。與20和30 Gy組相比，40 Gy組中僅有1.2%的Ki67陽性肝細胞。表達譜分析和GSEA還顯示，與20 Gy組相比，40 Gy組中細胞增殖相關基因下調。總體而言，這些結果表明，40 Gy HIR會損害肝細胞對輻射損傷的增殖反應。

隨后，研究團隊進一步探討高劑量HIR損害肝臟再生的機制。輻射可誘導大量DNA損傷。值得注意的是，在接受40 Gy HIR后35天，62.5%的細胞顯示DNA損傷反應激活，這一比例為20 Gy組的8.6倍；這一結果由DNA損傷標志物γH2A.X免疫染色證實。與γH2A.X染色一致，GSEA顯示40 Gy組DNA損傷通路富集，而20 Gy組DNA修復通路富集。當DNA損傷無法成功修復時，細胞會發生衰老。值得注意的是，P21和HNF4A共免疫染色顯示，接受40 Gy照射的豬中有21.6%的肝細胞處于細胞周期停滯或衰老狀態。此外，在40 Gy條件下，與衰老相關分泌表型（SASP）相關的基因顯著上調。與此同時，GSEA顯示DNA損傷誘導的衰老通路富集。綜上，這些結果提示，高劑量照射通過造成嚴重DNA損傷和廣泛肝細胞衰老來損害肝臟再生。

RILD的潛在治療窗口

目前RILD的治療主要是支持性治療，并不能改變疾病的自然進程。由于RILD具有潛在致死性，早期干預十分關鍵。研究團隊推測，肝臟再生顯著受損可能是有效治療的關鍵節點。為此，研究分析了40 Gy組在第1、7、14、21和28天肝活檢樣本中的細胞衰老情況。20 Gy組作為對照，因為該組存在肝臟再生且細胞衰老有限。P21和HNF4A共染顯示，與20 Gy組相比，40 Gy組早在第1天即出現肝細胞細胞周期停滯或衰老，并在第14天更加明顯。類似地，SA-β-Gal染色顯示，40 Gy組從第14天開始出現顯著細胞衰老。這些發現提示，第14天是研究分子機制的關鍵時間點，而RILD的最佳治療窗口可能位于照射后14天內。

為描繪細胞功能障礙的動態過程，研究團隊分析了連續肝活檢樣本。與20 Gy組相比，40 Gy組中衰老標志物P21在肝細胞中早在照射后第1天顯著升高，在LSEC中則于照射后第7天顯著升高。相反，HSC活化表現為α-SMA陽性細胞從第7天開始呈增加趨勢，但尚未達到統計學顯著性。這些數據提示，肝細胞和LSEC可能是輻射的主要早期響應細胞。

圖3 高劑量HIR損害豬肝臟再生能力

（A–D）照射后35天受照射肝臟pRb（A和B）、HNF4A和Ki67（C和D）免疫熒光染色的代表性圖像與定量結果（每組n=3）。

（E）照射后參與細胞增殖的基因和衰老相關分泌表型（SASP）基因表達熱圖。

（F–I）照射后35天受照射肝臟γH2A.X（F和G）、HNF4A和P21（H和I）免疫熒光染色的代表性圖像與定量結果（每組n=3）。

（J–M）照射后28天內，20和40 Gy條件下受照射肝臟HNF4A與P21共染（J和K）以及SA-β-Gal染色（L和M）的代表性圖像與定量結果（每組n=3）。比例尺：100 μm。

數據以均值±SEM表示；p值采用未配對雙尾Student t檢驗評估。

snRNA-seq分析提示RILD豬中存在肝細胞鐵死亡

為全面理解RILD早期發病過程和分子機制，研究團隊對40 Gy組照射后第14天肝活檢樣本以及未照射對照進行了單核RNA測序（snRNA-seq）。0 Gy和40 Gy樣本分別捕獲9,432個和15,217個細胞用于建庫和雙端測序，其中分別有87.6%和91.6%通過質量控制。對這些細胞轉錄組進行UMAP降維和亞群聚類后顯示，該方法捕獲了構成豬肝臟的主要細胞類型。15個細胞簇被鑒定為11種細胞類型，包括肝細胞、膽管細胞、LSEC、HSC、自然殺傷（NK）細胞、Kupffer細胞（KC）、樹突狀細胞（DC）、T細胞、B細胞、成纖維細胞（FB）以及增殖細胞。這些結果表明，該單細胞圖譜能夠有效捕獲高劑量輻射肝活檢樣本中的主要細胞類型及其在RILD早期病理過程中的轉錄組多樣性。

基于該數據集，研究團隊比較了0 Gy和40 Gy樣本中各細胞類型的轉錄組變化。通過比較0 Gy與40 Gy之間的基因表達，獲得差異表達基因（DEGs）。鑒于LSEC、HSC和KC在HIR過程中反應顯著，研究首先對這些細胞類型的DEGs進行了基因本體（GO）富集分析。作為肝臟中第二豐富的細胞類型，LSEC對輻射高度敏感，輻射損傷后凋亡、衰老和自噬上調。此外，與纖溶、血管形態發生、氧化損傷反應和血管生成相關的通路顯著下調，提示血管修復和凝血功能可能受損，從而導致微循環血流紊亂，引發肝細胞損傷、肝淤血和肝功能障礙。

在HSC中，包括TGF-β和Wnt反應在內的多種信號通路在40 Gy樣本中顯著上調，這些通路在HSC活化中發揮關鍵作用。此外，纖溶和創傷反應通路顯著下調，可能加速纖維化進展。40 Gy樣本中KC的基因表達分析顯示，參與巨噬細胞細胞因子產生和內吞作用的基因上調，提示適應性免疫系統被激活。同時，與0 Gy樣本相比，40 Gy樣本中的KC在細菌反應、缺氧反應和炎癥反應相關通路上顯著下調，提示HIR后KC功能受損，可能對肝臟修復和再生產生不利影響。有趣的是，與LSEC和肝細胞不同，HSC和KC并未表現出凋亡或程序性壞死通路的顯著激活，提示其輻射抵抗性可能涉及另一種機制。研究確實觀察到KC在輻射后衰老標志物上調，這與胎源性KC通過形成衰老表型來抵抗輻射誘導細胞死亡的現象一致。已有研究顯示，非實質細胞（NPC）中的DNA感知和干擾素信號激活參與輻射誘導肝損傷進展。與此一致，研究發現I型干擾素（IFN）信號通路在LSEC和KC中特異性顯著激活，而在其他NPC群體中未見類似變化。這提示LSEC和KC可能是受照射豬肝臟中IFN-α/β分泌的主要來源。

隨后，研究團隊將重點轉向肝細胞，因為肝細胞是肝臟中的主要細胞類型。GO分析證實，與未照射對照相比，40 Gy處理肝細胞中包括輻射反應和DNA損傷反應在內的信號通路顯著上調，提示肝細胞對輻射產生強烈反應。此外，這一過程伴隨凋亡激活以及負向調控細胞死亡通路的下調。這些發現與組織學分析中觀察到的小葉中央壞死一致。研究還發現，與未照射對照相比，40 Gy HIR下調了有絲分裂過程和細胞衰老負調控因子，提示細胞轉向細胞周期停滯狀態，從而導致再生失敗。值得注意的是，40 Gy樣本中鐵死亡信號被激活，同時鐵離子轉運信號下降。與鐵死亡相關，40 Gy樣本中脂肪酸氧化和P53信號通路顯著富集，這兩者均被認為與鐵死亡相關。具體而言，鐵死亡抑制因子（如SOD2、CD44、GCH1、ATF4和DHODH）的基因表達顯著下降，而鐵死亡驅動因子（如ACSL1、TP53、ACADSB和TFR2）的表達顯著升高。這些數據表明，在RILD發病早期，肝細胞進入細胞周期停滯狀態，并伴隨包括鐵死亡在內的多種細胞死亡形式。

在RILD早期發病過程中發現鐵死亡是意料之外的。為確定鐵死亡是否持續存在于RILD晚期，研究團隊分析了40 Gy照射后35天的肝樣本，并評估了鐵死亡關鍵指標，包括脂質過氧化和Fe2+積累。鑒于脂質過氧化是鐵死亡的關鍵驅動因素，研究進行了4-羥基壬烯醛（4-HNE）免疫熒光染色，這是一種公認的脂質過氧化標志物。結果顯示，與未照射對照相比，受照射肝臟中4-HNE陽性細胞數量增加。此外，研究通過檢測多個時間點的血清丙二醛（MDA）水平來測定血清脂質過氧化。值得注意的是，脂質過氧化在第28天顯著升高，提示血清MDA可作為追蹤RILD進展的有價值標志物。Perls染色顯示受照射肝臟中肝細胞Fe2+積累。此外，針對鐵死亡抑制因子SLC7A11和GPX4的免疫熒光染色顯示，受照射肝臟中陽性細胞數量顯著減少。綜上，這些數據提示肝細胞在RILD早期和晚期均發生顯著鐵死亡。

為驗證鐵死亡在RILD中的臨床相關性，研究團隊分析了接受過RT的患者可獲得肝樣本，包括HIR和放射性栓塞治療后的樣本。值得注意的是，來自5名獨立患者的8份樣本均顯示，與正常肝組織相比，脂質過氧化水平和Fe2+積累明顯升高。這一發現強調了鐵死亡在輻射后肝損傷病理生理中的作用，并提示靶向這種細胞死亡形式可能具有治療意義。

圖4 snRNA-seq分析提示RILD豬中存在肝細胞鐵死亡

（A）實驗流程示意圖。該圖使用BioRender.com繪制。

（B和C）0 Gy和40 Gy樣本照射后14天合并單細胞轉錄組數據的降維展示（每組n=2）；UMAP圖顯示主要細胞類型。

（D–I）內皮細胞簇（D–F）和肝細胞簇（G–I）中標志基因熱圖和GO術語富集分析。

（J）氣泡圖顯示鐵死亡相關基因在0 Gy和40 Gy樣本中的富集情況。

（K–N）0 Gy和40 Gy條件下照射后35天肝臟4-HNE（K和L）和Perls（M和N）染色的代表性圖像與定量結果（每組n=3）。0 Gy對照中未檢測到4-HNE陽性細胞和Perls陽性細胞。比例尺：100 μm。

（O–R）0 Gy和40 Gy條件下照射后35天肝臟SLC7A11（O和P）和GPX4（Q和R）免疫熒光染色的代表性圖像與定量結果（每組n=3）。比例尺：100 μm。

（S和T）正常人肝和受照射人肝中4-HNE和Perls染色的代表性圖像。正常人肝（樣本1）和受照射人肝（樣本7）也在補充圖中展示。樣本1比例尺：500 μm；樣本7比例尺：1,000 μm。

數據以均值±SEM表示；p值采用未配對雙尾Student t檢驗評估。

鐵死亡抑制劑Lip-1逆轉RILD

為檢驗抑制鐵死亡是否能夠逆轉RILD，研究團隊使用鐵死亡抑制劑Lip-1治療40 Gy照射豬。Lip-1可抑制脂質過氧化。鑒于照射后14天是干預的關鍵時期，研究在這一窗口期向動物給予Lip-1，劑量為2 mg/kg/天。該劑量根據小鼠模型中的既往藥代動力學和療效研究確定，并以體表面積換算指導向大型物種轉化。40 Gy照射后，6頭成年巴馬小型豬被隨機分為兩組。第1組接受溶劑對照（HIR［40 Gy+veh］組，n=3）。第2組自第0天起接受Lip-1治療（E-Lip-1組，n=3）。為更好模擬患者常在損傷已經形成后就診的臨床情境，研究還納入第3組，該組在照射后第21天開始Lip-1治療（L-Lip-1組，n=3）。未照射（0 Gy+vehicle）肝臟也被納入，作為基線組織學和免疫染色讀出的參考對照。

研究首先評估E-Lip-1治療是否能夠阻止RILD發生。HIR組3頭豬中1頭在照射后30天死亡，其余2頭在同一時期出現嗜睡和步態不穩。值得注意的是，E-Lip-1組3頭豬均存活至35天。照射后第1天采集豬血清，用于確定基線水平。HIR組豬在暴露于40 Gy照射后28天出現血清ALP和TBIL顯著升高，同時血清AST明顯升高。此外，血清ALB水平逐漸下降，提示肝功能障礙。與前述觀察一致，ALT無明顯變化。相反，與基線相比，Lip-1治療豬的血清生化參數沒有顯著變化。這些結果表明，早期Lip-1治療可有效阻止豬發生RILD癥狀。

為進一步評估Lip-1治療是否抑制鐵死亡和VOD相關病理特征，研究團隊分析了照射后35天的肝樣本。4-HNE染色顯示，與HIR組相比，Lip-1治療后脂質過氧化水平顯著降低。Perls染色顯示，Lip-1組Fe2+積累顯著減少。此外，SLC7A11和GPX4免疫熒光染色顯示，E-Lip-1組陽性細胞數量顯著增加，達到與未照射肝臟相近的水平，提示鐵死亡應激得到有效抑制。H&E染色顯示，Lip-1組僅有極少肝細胞壞死，而對照組存在大量壞死。此外，Masson三色染色、膠原I和α-SMA染色顯示，E-Lip-1組肝纖維化明顯減輕，達到與未照射肝臟相近的水平，提示Lip-1治療可有效逆轉VOD相關病理特征。

隨后，研究團隊評估了在損傷已經形成后啟動Lip-1治療的治療潛力。經過2周延遲治療后，所有豬均存活至第35天，并表現出接近正常的生化譜。組織學上，HIR組觀察到的嚴重小葉中央壞死在L-Lip-1組得到解決。此外，肝纖維化顯著減輕，盡管纖維化水平仍略高于未照射肝臟。總體而言，這些發現強調了Lip-1在RILD治療中的顯著治療效果。

圖5 鐵死亡抑制劑Lip-1逆轉RILD

（A）對接受HIR（40 Gy+veh）、早期Lip-1（E-Lip-1）或晚期Lip-1（L-Lip-1）處理的受照射豬進行監測，以評估治療效果的示意圖。

（B）接受HIR（40 Gy+veh）或E-Lip-1處理的小型豬。

（C）照射后35天內，接受HIR（40 Gy+veh）、E-Lip-1或L-Lip-1處理豬的生存曲線（每組n=3）。

（D–H）照射后28天內，接受HIR（40 Gy+veh）、E-Lip-1或L-Lip-1處理豬血液指標的動態變化（每組n=3）。標注的p值表示HIR（40 Gy+veh）組中比較第28天與第1天（基線）的未配對雙尾t檢驗結果。

（I–L）正常肝臟（0 Gy+veh）以及接受HIR（40 Gy+veh）、E-Lip-1或L-Lip-1處理的受照射肝臟在照射后35天SLC7A11（I和J）和GPX4（K和L）免疫熒光染色的代表性圖像與定量結果（每組n=3）。

（M–P）正常肝臟（0 Gy+veh）以及接受HIR（40 Gy+veh）、E-Lip-1或L-Lip-1處理的受照射肝臟在照射后35天H&E（M和N）和Masson三色染色（O和P）的代表性圖像與定量結果（每組n=3）。E-Lip-1或L-Lip-1中未檢測到壞死。（M）和（O）所示圖像來自相鄰連續切片。比例尺：100 μm。

數據以均值±SEM表示；p值采用未配對雙尾Student t檢驗評估。

Lip-1治療抑制肝細胞鐵死亡并促進肝臟再生

為進一步研究Lip-1預防RILD的治療機制，研究團隊對Lip-1治療組（E-Lip-1）照射后14天的豬肝活檢樣本進行了snRNA-seq分析。由于40 Gy照射動物之間的病理和轉錄組特征高度一致，同一批40 Gy活檢樣本被用作對照組。基于前述豬肝活檢中所有細胞類型的轉錄組表征，研究比較了Lip-1與對照之間各細胞類型的轉錄組變化。為確定Lip-1治療是否具有細胞類型特異性，研究首先定量比較Lip-1治療活檢樣本相對于對照樣本中各細胞類型的基因改變數量。值得注意的是，肝細胞顯示出最多的DEGs，共有749個基因在Lip-1治療后顯著上調或下調。此外，GO分析顯示，與KC、LSEC和HSC等其他細胞類型相比，肝細胞DEGs中鐵死亡通路顯著富集。基因表達氣泡圖還顯示，68%的鐵死亡驅動基因在肝細胞中顯著下調，而65%的鐵死亡抑制基因顯著上調。這些結果提示，Lip-1治療具有細胞類型特異性，主要作用于肝細胞。

伴隨鐵死亡受到抑制，與脂質過氧化相關的基因顯著下調，而與ATP合成和缺氧反應相關的基因明顯上調，從而增強肝細胞對氧化損傷的抵抗力。此外，包括凝血和外源性藥物代謝在內的肝功能相關通路被激活，提示肝功能改善。值得注意的是，Lip-1上調的DEGs顯著富集于肝臟再生和細胞死亡負調控相關通路，提示肝細胞增殖和存活增強。此外，其他細胞類型如LSEC中，與細胞增殖和血管生成相關的基因表達增加，而止血相關通路下調，提示血管功能和循環系統穩態恢復。這些數據提示，鐵死亡抑制可能直接刺激肝細胞和LSEC再生。對于HSC，研究觀察到與纖溶和創傷反應相關的基因表達增強，提示可能抑制纖維化。對于KC，細菌反應和缺氧相關通路被激活，提示其功能恢復。

與這些發現一致，Ki67、HNF4A和CD31共染進一步證明，Lip-1治療顯著改善肝細胞和內皮細胞的增殖。Lip-1治療后γH2A.X陽性細胞數量顯著減少，這與鐵死亡抑制可減輕DNA損傷并逆轉衰老的認識一致。此外，P21和HNF4A共染顯示，對照組衰老肝細胞比例為Lip-1治療肝臟的60.5倍（13.3%對0.2%），表明Lip-1治療明顯抑制肝細胞衰老和細胞周期停滯。綜上，這些發現證明，Lip-1治療可有效恢復RILD中異常的DEGs，尤其是與肝細胞鐵死亡相關的DEGs，并改善肝臟再生。

圖6 Lip-1治療抑制肝細胞鐵死亡并促進肝臟再生

（A）實驗流程示意圖。該圖使用BioRender.com繪制。

（B和C）40 Gy和E-Lip-1樣本合并單細胞轉錄組數據的降維展示（每組n=2）；UMAP圖顯示主要細胞類型。

（D）不同細胞類型中逆轉基因與鐵死亡相關基因的結合顯著性。

（E和F）氣泡圖顯示鐵死亡相關基因在40 Gy和E-Lip-1樣本中的富集情況。

（G–J）40 Gy和E-Lip-1樣本中肝細胞簇（G和H）以及內皮細胞簇（I和J）的標志基因熱圖和GO術語富集分析。

（K和L）HIR（40 Gy+veh）和E-Lip-1處理受照射肝臟在照射后35天HNF4A、CD31、Ki67和P21免疫熒光染色的代表性圖像與定量結果（每組n=3）。HIR（40 Gy+veh）組中未檢測到Ki67陽性CD31陽性細胞。比例尺：100 μm。

數據以均值±SEM表示；p值采用未配對雙尾Student t檢驗評估。

【Citation】:Sun Z, Zhang X, Zheng Q, et al. A pig model of human radiation-induced veno-occlusive liver disease reveals ferroptosis as a therapeutic target.Cell Rep Med.Published online April 16,2026.

【貢獻】★★★★★

RILD是RT中的限制性因素，尤其是在肝癌治療中，并且在具有基礎肝病的患者中與較高死亡率相關。RILD最初被組織學描述為類似VOD已有約六十年，但人們對其發病機制的認識仍然有限，該疾病仍不可治愈。主要障礙之一是缺乏能夠再現RILD標志性特征且易于獲得的動物模型。本文利用臨床相關的SBRT建立了RILD豬模型，復制了人類RILD的臨床癥狀和病理特征，包括VOD和小葉中央壞死。值得注意的是，研究揭示肝細胞鐵死亡在RILD發病機制中發揮關鍵作用，且鐵死亡抑制劑治療可顯著逆轉其表現，為臨床轉化提供了有前景的可能性。

為研究RILD的發病機制和分子機制，已有研究在從嚙齒動物到非人靈長類的多種動物模型中考察了HIR的影響。在嚙齒動物中，高劑量HIR（30–60 Gy）可導致轉氨酶水平升高和肝細胞凋亡，并可在2–6個月后形成輕度肝纖維化。若干大型動物，如兔、犬和恒河猴，據報道可耐受HIR，且未出現肝功能障礙的臨床或生化表現。其中，受照射犬在數年時間內被發現存在輕度肝纖維化。重要的是，這些動物在HIR后均未發生VOD。另有研究觀察到，食蟹猴在低分割放療后出現ALP升高、ALB下降，以及明顯靜脈閉塞性改變和輕度肝纖維化。然而，這通常需要超過40 Gy的劑量，并在HIR后約10周才顯現。相比之下，本研究的小型豬模型在暴露于40 Gy后5周內即出現VOD表型。值得注意的是，該模型模擬的RILD形式比食蟹猴中觀察到的更嚴重。40 Gy HIR在豬中造成廣泛小葉中央壞死和膽小管損傷，并與AST和ALP顯著升高相關；同時還觀察到嚴重肝纖維化和肝臟再生受損。這些結果提示，與食蟹猴相比，豬對HIR更敏感，可在更短時間內出現更急性、更嚴重的肝損傷。該小型豬模型彌補了RILD研究中動物模型不足的問題，并對研究RILD發病機制具有重要意義。

肝細胞比非實質細胞更具放射抵抗性，因此在RILD發病機制中，輻射誘導的肝細胞損傷常被低估。除肝纖維化外，豬RILD模型中還觀察到VOD和小葉中央壞死。snRNA-seq證實HSC中TGF-β通路被激活。值得注意的是，鐵死亡通路在受照射肝細胞中特異性富集。輻射誘導的脂質過氧化以及SLC7A11和GPX4等鐵死亡抑制因子下調，可能促進肝細胞鐵死亡。現有證據提示，豬肝細胞膜對脂質過氧化的敏感性更接近人類而非小鼠，這可能解釋了豬更適合模擬人類RILD病理的原因。更重要的是，在照射后2周內使用Lip-1抑制肝細胞鐵死亡，不僅可防止VOD相關小葉中央壞死和肝纖維化，還可促進肝細胞和內皮細胞增殖，凸顯了肝細胞損傷在RILD發病機制中的核心作用。這些結果支持未來進一步在豬肝細胞中通過遺傳操作鐵死亡過程，以證明肝細胞鐵死亡是RILD的關鍵驅動因素。

雖然ferrostatin-1（Fer-1）和Lip-1是廣譜脂質過氧化抑制劑，但它們對特定基因表達的影響可能較為復雜，并且依賴具體情境。已有研究顯示，Fer-1或Lip-1可在肝損傷模型中下調鐵死亡驅動基因，并上調GPX4等抑制基因。與此一致，本研究在RILD豬模型中顯示，Lip-1治療可下調ACSL1、ACADSB和P53。Lip-1治療廣泛下調鐵死亡驅動基因并上調抑制基因，這可能是通過降低脂質過氧化和氧化應激，從而間接使P53等上游轉錄調控因子的活性恢復正常。轉鐵蛋白（TF）作為肝細胞功能的重要標志物，其上調可能反映了Lip-1治療后受照射肝臟總體功能改善。相比之下，DPP4的上調較為意外，因為在某些特定情境下，如P53缺陷癌細胞中，DPP4被報道可促進鐵死亡，并且通常在酶活性水平而非mRNA表達水平上受調控。因此，DPP4在肝臟鐵死亡抑制中的作用仍需進一步研究。

基于輻射的預處理在多種應用中顯示出前景，包括造血干細胞、肝細胞、間充質細胞和神經細胞移植。在肝細胞移植中，HIR可破壞內皮屏障并使KC失活，從而增強移植肝細胞的植入。在高劑量條件下，HIR還可抑制宿主肝細胞有絲分裂，為移植細胞提供增殖優勢。因此，移植效率隨劑量增加而提高。然而需要注意的是，在嚙齒動物中用于實現治療性肝再殖的單次50 Gy劑量，通常施加于全肝或30%肝體積，已超過人類最大安全劑量。此類高劑量與RILD風險高度相關，并可導致顯著發病。此外，一項臨床研究顯示，在給予10 Gy HIR后24小時內進行肝細胞移植，其預期植入率較低。這強調了優化照射時機和劑量以提升肝細胞移植成功率的必要性。在本研究中，豬發生的RILD在劑量、時間和病理方面均與人類情況高度相似。因此，該模型非常適合用于評估HIR在肝細胞移植中的療效和毒性，并優化HIR預處理方案。由這些研究獲得的認識可有效轉化到臨床，為人類患者提供更安全、更有效的預處理策略。

總之，本研究使用SBRT建立了一個能夠高度模擬人類RILD表型的小型豬模型。該模型使研究團隊能夠表征疾病早期的病理事件和多細胞反應，并揭示鐵死亡是一個治療靶點。這些發現對于推進RILD的臨床治療和預防、加深對其發病機制的理解，以及為肝細胞移植制定有效HIR方案具有重要意義。

研究局限性

本研究強調了鐵死亡抑制劑治療RILD的潛在價值，但仍有若干問題需要解決。盡管Lip-1在多種小鼠模型中已被證明是活性、溶解性和穩定性較優的自由基捕獲抗氧化劑之一，但其對CYP2D酶活性的抑制引發了臨床安全性方面的擔憂。因此，在大型動物中開展Lip-1的全面藥代動力學研究，并開發具有更優藥物性質的新一代自由基捕獲抗氧化劑，對于未來臨床應用至關重要。此外，FerroTerminator1、去鐵胺和地拉羅司等鐵螯合劑已被報道可通過抑制鐵死亡減輕代謝功能障礙相關脂肪性肝炎（MASH）小鼠模型中的疾病表現。因此，值得在RILD豬中測試這些鐵螯合劑的療效。最后，除鐵死亡外，研究還觀察到受照射豬肝細胞中凋亡被激活。未來在這些大型動物模型中使用凋亡抑制劑（如Z-VAD-FMK）進行研究，有助于闡明凋亡在RILD發病機制中的作用。

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