Cell Metabolism (IF=37)｜破解肥胖相關(guān)“瘦素抵抗”：FGF21聯(lián)合瘦素，通過(guò)肝臟LEPRb恢復(fù)改善MASLD與糖脂代謝紊亂！(徐愛(ài)民-香港大學(xué))

2026年7月16日，香港大學(xué)徐愛(ài)民團(tuán)隊(duì)，聯(lián)合中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院、廣州實(shí)驗(yàn)室、中山大學(xué)、廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院、廣州中醫(yī)藥大學(xué)等單位，在Cell Metabolism（中科院1區(qū)，TOP期刊，IF=37.0）發(fā)表題為 “FGF21 synergizes with leptin to counteract obesity-related metabolic comorbidities by reversing hepatic leptin resistance” 的研究論文。該文由 Qing Shen、Hailan Zou、Leigang Jin 等共同完成，徐愛(ài)民為通訊作者。該文于2025年12月15日投稿，2026年4月22日修回，2026年6月23日接收。

肥胖誘導(dǎo)的瘦素抵抗是肥胖及其相關(guān)代謝共病臨床干預(yù)和藥物開(kāi)發(fā)中的重要難題。該研究發(fā)現(xiàn)，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21（fibroblast growth factor 21，F(xiàn)GF21）可與瘦素（leptin）產(chǎn)生協(xié)同作用，通過(guò)增強(qiáng)肝細(xì)胞對(duì)瘦素的敏感性，改善肥胖相關(guān)代謝共病。其核心機(jī)制在于：FGF21作用于脂肪細(xì)胞，促進(jìn)脂聯(lián)素（adiponectin，APN）分泌；脂聯(lián)素進(jìn)一步通過(guò)磷酸化并激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1（signal transducer and activator of transcription 1，STAT1），誘導(dǎo)肝細(xì)胞中功能性瘦素受體b（leptin receptor b，LEPRb/Leprb）表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)肥胖相關(guān)外周瘦素抵抗。

研究進(jìn)一步構(gòu)建了一種長(zhǎng)效FGF21/瘦素雙激動(dòng)劑 FGF21-Fc-leptin。與單獨(dú)使用FGF21或瘦素相比，該雙激動(dòng)劑在小鼠中更有效地抵抗飲食誘導(dǎo)的體重增加、胰島素抵抗、高血糖、血脂異常和代謝功能障礙相關(guān)脂肪性肝病（metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease，MASLD），且不影響攝食量。更具轉(zhuǎn)化意義的是，在人原代肝細(xì)胞和人肝類(lèi)器官中，脂聯(lián)素而非FGF21本身，可逆轉(zhuǎn)棕櫚酸/油酸誘導(dǎo)的LEPRb下調(diào)，恢復(fù)瘦素抑制糖異生和肝脂肪變性的作用。

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【摘 要】

瘦素抵抗限制了瘦素在肥胖相關(guān)代謝共病治療中的潛力。本研究表明，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21（FGF21）可通過(guò)逆轉(zhuǎn)肥胖誘導(dǎo)的外周瘦素抵抗，在代謝調(diào)控中與瘦素產(chǎn)生協(xié)同作用。FGF21作用于脂肪細(xì)胞，促進(jìn)脂聯(lián)素分泌；脂聯(lián)素隨后通過(guò)磷酸化并激活肝細(xì)胞中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1（STAT1），誘導(dǎo)瘦素受體表達(dá)。

腹腔注射一種長(zhǎng)效FGF21/瘦素雙激動(dòng)劑，相較于FGF21或瘦素單激動(dòng)劑，可在不影響攝食量的情況下，對(duì)飲食誘導(dǎo)的體重增加、胰島素抵抗、高血糖、血脂異常和代謝功能障礙相關(guān)脂肪性肝病（MASLD）產(chǎn)生更強(qiáng)的藥理保護(hù)作用。在人原代肝細(xì)胞和人肝類(lèi)器官中，脂聯(lián)素而非FGF21可抵消棕櫚酸/油酸誘導(dǎo)的瘦素受體b下調(diào)，從而恢復(fù)瘦素抑制糖異生和肝脂肪變性的作用。

因此，通過(guò)FGF21與瘦素在外周組織中的協(xié)同和互補(bǔ)作用，F(xiàn)GF21/瘦素雙激動(dòng)策略可能成為治療肥胖相關(guān)多重代謝共病的一種潛在方法。

01

研究背景及科學(xué)問(wèn)題

肽類(lèi)激素通過(guò)整合器官間通訊，在維持全身代謝穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮核心作用。肽類(lèi)激素產(chǎn)生異常或功能障礙，是一組相互關(guān)聯(lián)的慢性代謝疾病發(fā)生發(fā)展的重要因素，包括肥胖、2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）、血脂異常以及代謝功能障礙相關(guān)脂肪性肝病（MASLD）。基于肽類(lèi)激素的藥物治療已成為慢性代謝疾病臨床干預(yù)的重要方式。近年來(lái)，利用多種肽類(lèi)激素之間的協(xié)同代謝調(diào)控作用開(kāi)展聯(lián)合治療，相較于單藥治療，在肥胖相關(guān)共病中顯示出更優(yōu)治療潛力。例如，胰高糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）/葡萄糖依賴(lài)性促胰島素多肽（glucose-dependent insulinotropic polypeptide，GIP）雙受體激動(dòng)劑Tirzepatide已獲批用于肥胖和T2DM治療，而GLP-1/GIP/胰高糖素三受體激動(dòng)劑也已進(jìn)入III期臨床試驗(yàn)。

瘦素是一種主要由脂肪組織產(chǎn)生的16 kDa肽類(lèi)激素，可通過(guò)瘦素受體介導(dǎo)的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控能量平衡和代謝。瘦素的主要功能是向下丘腦神經(jīng)元傳遞能量狀態(tài)信號(hào)，從而調(diào)節(jié)攝食和能量消耗（energy expenditure，EE）。此外，瘦素還可在外周組織中發(fā)揮多種代謝作用，包括脂肪組織、肝臟和骨骼肌。在肝臟中，瘦素可抑制糖異生、增強(qiáng)脂肪酸氧化（fatty acid oxidation，F(xiàn)AO），并改善胰島素敏感性。然而，瘦素的治療應(yīng)用受到肥胖狀態(tài)下瘦素抵抗的限制。瘦素抵抗表現(xiàn)為高瘦素血癥，以及中樞和外周組織中瘦素作用受損。瘦素受體下調(diào)、受體脫敏以及下游信號(hào)級(jí)聯(lián)異常等機(jī)制，均被認(rèn)為參與瘦素抵抗發(fā)生。反過(guò)來(lái)，瘦素抵抗也會(huì)促進(jìn)肥胖、胰島素抵抗、高血糖和MASLD的發(fā)生發(fā)展。目前尚無(wú)獲批的針對(duì)瘦素抵抗的藥物治療手段。

FGF21是一種主要由肝臟產(chǎn)生的應(yīng)激激素，也是能量穩(wěn)態(tài)、糖代謝和脂代謝的重要調(diào)控因子。FGF21通過(guò)結(jié)合由經(jīng)典成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體1c（fibroblast growth factor receptor 1c，F(xiàn)GFR1c）和必需共受體β-Klotho（KLB）組成的受體復(fù)合物發(fā)揮多效性功能。KLB表達(dá)高度局限于少數(shù)細(xì)胞類(lèi)型，因此賦予FGF21作用的組織特異性。藥理性給予FGF21已在多種動(dòng)物模型中被反復(fù)證明可對(duì)肥胖相關(guān)共病產(chǎn)生多重治療作用。同樣，近期關(guān)于FGF21類(lèi)似物的臨床試驗(yàn)也顯示，其在治療MASLD、代謝功能障礙相關(guān)脂肪性肝炎（metabolic dysfunction-associated steatohepatitis，MASH）和血脂異常患者方面具有較好前景。然而，在多數(shù)臨床研究中，F(xiàn)GF21類(lèi)似物對(duì)體重下降和血糖控制的影響較弱，甚至沒(méi)有明顯作用，這提示基于FGF21的單藥治療可能不足以應(yīng)對(duì)肥胖相關(guān)多重代謝共病。

鑒于FGF21和瘦素在代謝調(diào)控中既有重疊又有差異的作用，作者在肥胖小鼠中研究了這兩種肽類(lèi)激素之間的藥理互作。結(jié)果顯示，F(xiàn)GF21與瘦素聯(lián)合給藥在預(yù)防肥胖及其相關(guān)共病方面具有顯著協(xié)同效應(yīng)。因此，研究者開(kāi)發(fā)了一種長(zhǎng)效FGF21/瘦素雙激動(dòng)劑，并進(jìn)一步在多種動(dòng)物模型以及人肝類(lèi)器官（human liver organoids，HLOs）中探索其藥效學(xué)和作用機(jī)制。出乎意料的是，研究發(fā)現(xiàn)FGF21與瘦素之間的協(xié)同作用主要來(lái)自FGF21逆轉(zhuǎn)肥胖誘導(dǎo)的外周瘦素抵抗的能力，即通過(guò)恢復(fù)肝細(xì)胞表面瘦素受體表達(dá)來(lái)增強(qiáng)瘦素作用，而這一過(guò)程并不影響攝食量。

02

重要發(fā)現(xiàn)及亮點(diǎn)

FGF21與瘦素協(xié)同改善小鼠肥胖相關(guān)代謝共病

為探索FGF21與瘦素之間的功能互作，研究者將重組人FGF21（hFGF21，100 nmol/kg）和重組人瘦素（hLEPTIN，100 nmol/kg）單獨(dú)或聯(lián)合給予飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠，每日腹腔注射，連續(xù)14天。結(jié)果顯示，hFGF21處理可使體重、脂肪量、血糖、胰島素、C肽以及循環(huán)甘油三酯（triglycerides，TG）和總膽固醇（total cholesterol，TC）水平出現(xiàn)輕度但顯著下降，而單獨(dú)給予瘦素對(duì)這些指標(biāo)沒(méi)有明顯影響。值得注意的是，hFGF21與hLEPTIN聯(lián)合處理在緩解肥胖、改善糖脂代謝譜方面的效果明顯強(qiáng)于任一單獨(dú)處理。間接量熱分析同樣顯示，F(xiàn)GF21與瘦素聯(lián)合給藥在提高能量消耗和呼吸交換率（respiratory exchange ratio，RER）方面明顯強(qiáng)于單獨(dú)FGF21，而單獨(dú)注射瘦素與溶劑對(duì)照相比無(wú)明顯差異。同時(shí)，四組小鼠在自主活動(dòng)、攝食量和瘦體重方面無(wú)明顯差異，提示這種協(xié)同作用并非主要依賴(lài)食欲抑制。

與既往研究一致，hFGF21連續(xù)處理14天可部分但顯著緩解肥胖誘導(dǎo)的MASLD，表現(xiàn)為肝臟重量和大小下降、肝脂肪變性改善、肝內(nèi)脂質(zhì)積累減少，以及血清肝損傷標(biāo)志物丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）降低。更突出的是，hFGF21與hLEPTIN聯(lián)合處理的小鼠幾乎完全緩解肝脂肪變性和脂質(zhì)積累，并使肝損傷標(biāo)志物恢復(fù)正常，而單獨(dú)瘦素處理并未改善這些指標(biāo)。對(duì)附睪白色脂肪組織（epididymal white adipose tissue，eWAT）和皮下白色脂肪組織（subcutaneous white adipose tissue，sWAT）的整體形態(tài)和組織學(xué)分析也顯示，hFGF21與hLEPTIN聯(lián)合處理在降低兩類(lèi)脂肪墊濕重、脂肪量和脂肪細(xì)胞大小方面均明顯強(qiáng)于單獨(dú)hFGF21，而單獨(dú)瘦素處理無(wú)顯著作用。綜上，這些發(fā)現(xiàn)提示，F(xiàn)GF21與瘦素之間存在協(xié)同作用，可在不依賴(lài)食欲調(diào)節(jié)的情況下緩解肥胖相關(guān)代謝并發(fā)癥。

圖1：FGF21與瘦素在小鼠中協(xié)同緩解肥胖及相關(guān)高血糖、高脂血癥和脂肪肝。（A）研究設(shè)計(jì)示意圖。8周齡雄性C57BL/6J小鼠接受高脂飲食（high-fat diet，HFD，45% kcal脂肪）喂養(yǎng)12周，隨后每日腹腔注射重組人瘦素（hLEPTIN，100 nmol/kg體重）、人FGF21（hFGF21，100 nmol/kg體重）、hFGF21聯(lián)合hLEPTIN（hF+hL），或生理鹽水作為對(duì)照（vehicle），連續(xù)14天。隨后處死小鼠并收集不同組織用于進(jìn)一步分析。（B和C）蛋白處理前基線與處理14天后體重變化（B）和脂肪量變化（C）。（D）單次注射蛋白后不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)食狀態(tài)下血糖水平的動(dòng)態(tài)變化。（E–H）血清胰島素（E）、C肽（F）、甘油三酯（TG，G）和總膽固醇（TC，H）水平。（I–N）在蛋白處理第12至13天，通過(guò)間接量熱法在連續(xù)48小時(shí)明暗周期內(nèi)測(cè)量總能量消耗（EE，I）、呼吸交換率（RER，K）和自主活動(dòng)（M）。明期和暗期平均EE（J）、RER（L）和自主活動(dòng)（N）如圖所示。（O和P）肝臟濕重（O）以及按肝組織總蛋白含量歸一化后的肝內(nèi)甘油三酯和膽固醇含量（P）。（Q）肝臟整體外觀代表性圖像（上排，比例尺5 mm）、肝切片H&E染色（中排，比例尺50 μm）和油紅O（oil red O，ORO）染色（下排，比例尺50 μm）。（R和S）通過(guò)生化檢測(cè)測(cè)定血清AST（R）和ALT（S）活性。（T）附睪白色脂肪組織和皮下白色脂肪組織（eWAT和sWAT）整體外觀代表性圖像（第一、第三排，比例尺3.5 mm）及相應(yīng)H&E切片（第二、第四排，比例尺50 μm）。（U–X）eWAT濕重（U）和脂肪細(xì)胞大小（V），以及sWAT濕重（W）和脂肪細(xì)胞大小（X）。所有柱狀圖中，黑點(diǎn)表示vehicle組，藍(lán)色三角形表示hLEPTIN組，紅色菱形表示hFGF21組，綠色倒三角形表示hF+hL組。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean ± SEM）表示。每組n=5–6只小鼠。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001；統(tǒng)計(jì)分析采用單因素方差分析（B、C、E–H、L、N–P、R、S和U–X）并進(jìn)行Bonferroni事后檢驗(yàn)。組間EE比較采用協(xié)方差分析（ANCOVA，J），以體重作為協(xié)變量。

長(zhǎng)效FGF21/瘦素雙激動(dòng)劑在小鼠中顯示更強(qiáng)治療效應(yīng)

天然FGF21和瘦素均為相對(duì)較小的多肽激素，循環(huán)半衰期較短，分別約為0.5–2小時(shí)和40分鐘。為進(jìn)一步探索二者的藥理協(xié)同作用，研究者將人FGF21和瘦素分別融合至免疫球蛋白G片段結(jié)晶區(qū)（fragment crystallizable region，F(xiàn)c）的N端和C端，構(gòu)建了一種具有更優(yōu)藥代動(dòng)力學(xué)特征的FGF21/瘦素雙激動(dòng)劑，命名為FGF21-Fc-leptin。SDS-PAGE和快速蛋白液相色譜證實(shí)，親和純化且去除內(nèi)毒素的FGF21-Fc-leptin、FGF21-Fc、Fc-leptin和Fc具有較高純度。體外活性實(shí)驗(yàn)顯示，F(xiàn)GF21-Fc-leptin和FGF21-Fc在誘導(dǎo)過(guò)表達(dá)FGFR1/KLB受體復(fù)合物的HEK293細(xì)胞ERK磷酸化方面活性相當(dāng)；同樣，F(xiàn)GF21-Fc-leptin和Fc-leptin在誘導(dǎo)過(guò)表達(dá)功能性Leprb的HEK293細(xì)胞STAT3 Tyr705位點(diǎn)磷酸化方面效果相近。藥代動(dòng)力學(xué)分析顯示，這些Fc融合蛋白在C57BL/6J小鼠循環(huán)中的半衰期約為20小時(shí)。

隨后，研究者在飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠中評(píng)價(jià)這些長(zhǎng)效Fc融合蛋白的治療效果：每2天腹腔注射一次，劑量為100 nmol/kg，持續(xù)2周。結(jié)果顯示，F(xiàn)GF21-Fc-leptin在降低體重和脂肪量方面明顯強(qiáng)于FGF21-Fc，并伴隨更高的能量消耗和RER。四組小鼠在自主活動(dòng)、瘦體重和攝食量方面無(wú)明顯差異。與FGF21和瘦素聯(lián)合給藥短暫降糖作用不同，F(xiàn)GF21-Fc-leptin的強(qiáng)效降糖作用可在14天治療期間持續(xù)存在，并伴隨循環(huán)胰島素和C肽明顯下降，提示胰島素敏感性改善。FGF21-Fc降低高血糖和高胰島素血癥的作用明顯弱于FGF21-Fc-leptin。同樣，與FGF21-Fc相比，F(xiàn)GF21-Fc-leptin處理小鼠血清甘油三酯和膽固醇降低幅度更大。

為進(jìn)一步評(píng)價(jià)長(zhǎng)效FGF21和瘦素單激動(dòng)劑及雙激動(dòng)劑對(duì)糖代謝的影響，研究者進(jìn)行了葡萄糖耐量試驗(yàn)（glucose tolerance test，GTT）、丙酮酸耐量試驗(yàn)（pyruvate tolerance test，PTT）和胰島素耐量試驗(yàn)（insulin tolerance test，ITT），并檢測(cè)胰島素誘導(dǎo)的靶組織蛋白激酶B（AKT）激活。與Fc處理的飲食誘導(dǎo)肥胖（diet-induced obesity，DIO）小鼠相比，F(xiàn)GF21-Fc-leptin處理的小鼠在腹腔葡萄糖負(fù)荷后血糖波動(dòng)明顯改善，丙酮酸誘導(dǎo)的糖異生顯著降低，胰島素誘導(dǎo)的血糖下降幅度更大。FGF21-Fc也可改善葡萄糖不耐受、糖異生和胰島素抵抗，但改善幅度明顯小于FGF21-Fc-leptin。相比之下，F(xiàn)c-leptin處理組與Fc對(duì)照組在GTT、PTT和ITT方面沒(méi)有差異。

在組織和分子層面，F(xiàn)GF21-Fc-leptin比FGF21-Fc更有效地改善肥胖誘導(dǎo)的MASLD，表現(xiàn)為肝臟大小和重量恢復(fù)正常，肝脂肪變性、脂質(zhì)積累和肝損傷標(biāo)志物顯著降低。FGF21-Fc-leptin降低eWAT和sWAT脂肪量及脂肪細(xì)胞大小的藥理作用也明顯強(qiáng)于FGF21-Fc。Fc-leptin對(duì)肥胖相關(guān)糖脂代謝紊亂、胰島素水平、MASLD、脂肪細(xì)胞大小或脂肪量均無(wú)明顯影響，提示FGF21-Fc-leptin的強(qiáng)效治療作用來(lái)源于這一雙激素激動(dòng)劑的協(xié)同效應(yīng)。

圖2：長(zhǎng)效FGF21/瘦素雙激動(dòng)劑在小鼠肥胖相關(guān)共病中具有強(qiáng)效治療作用。（A）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖。8周齡C57BL/6J小鼠接受HFD喂養(yǎng)12周，隨后分別每2天腹腔注射一次FGF21-Fc-leptin（L-Fc-F）、Fc-leptin、FGF21-Fc和Fc，持續(xù)2周，劑量均為100 nmol/kg。（B和C）治療前基線與治療14天后體重變化（B）和脂肪量變化（C）。（D）進(jìn)食狀態(tài)下血糖水平在每次注射前連續(xù)監(jiān)測(cè)14天。（E–G）在第12–13天，通過(guò)間接量熱法在48小時(shí)明暗周期內(nèi)測(cè)量總能量消耗（EE，E）、呼吸交換率（RER，F(xiàn)）和自主活動(dòng)（G）。明期和暗期平均EE、RER和活動(dòng)量如圖所示。（H–J）治療14天后測(cè)定血清胰島素（H）、C肽（I）、甘油三酯（TG）和總膽固醇（TC，J）水平。（K–P）在不同批次小鼠中，于蛋白治療14天后進(jìn)行葡萄糖耐量試驗(yàn)（GTT，K）、胰島素耐量試驗(yàn)（ITT，M）和丙酮酸耐量試驗(yàn)（PTT，O）。GTT和PTT前禁食16小時(shí)，ITT前禁食6小時(shí)。相應(yīng)曲線下面積（area under the curve，AUC）分別顯示于（L）、（N）和（P）。（Q）肝臟整體外觀代表性圖像（上排，比例尺5 mm）、肝切片H&E染色（中排，比例尺50 μm）和油紅O（ORO）染色（下排，比例尺50 μm）。（R和S）肝臟濕重（R）以及按肝蛋白含量歸一化后的肝臟甘油三酯和膽固醇含量（S）。（T）血清AST和ALT活性。（U和V）eWAT濕重（U）和脂肪細(xì)胞大小（V）。（W）eWAT和sWAT整體外觀代表性圖像（第一、第三排，比例尺3.5 mm）以及H&E染色的eWAT和sWAT切片（第二、第四排，比例尺50 μm）。（X和Y）sWAT濕重（X）和脂肪細(xì)胞大小（Y）。所有柱狀圖中，黑點(diǎn)表示Fc組，藍(lán)色三角形表示Fc-leptin組，紅色菱形表示FGF21-Fc組，綠色倒三角形表示L-Fc-F組。數(shù)據(jù)以均值±SEM表示。每組n=5–6只小鼠。*p < 0.05，**p < 0.01；統(tǒng)計(jì)分析采用單因素方差分析（B、C、F、G、H–J、L、N、P、R–V、X和Y）和雙因素方差分析（D、K、M和O），并進(jìn)行Bonferroni事后檢驗(yàn)。組間EE比較采用ANCOVA（E），以體重作為協(xié)變量。

FGF21-Fc-leptin在GAN飲食誘導(dǎo)MASH和肝纖維化中優(yōu)于FGF21-Fc

鑒于FGF21-Fc-leptin在DIO小鼠MASLD緩解中具有顯著作用，研究者進(jìn)一步在Gubra-Amylin NASH（GAN）飲食誘導(dǎo)的MASH小鼠模型中評(píng)價(jià)Fc標(biāo)記的FGF21/瘦素單激動(dòng)劑和雙激動(dòng)劑的藥理作用。該模型表現(xiàn)為更嚴(yán)重的肝損傷、脂肪性肝炎和肝纖維化。與DIO小鼠結(jié)果一致，F(xiàn)GF21-Fc-leptin在降低GAN誘導(dǎo)的肝重增加、肝內(nèi)脂質(zhì)積累和肝損傷酶水平方面明顯優(yōu)于FGF21-Fc單藥治療。ORO和H&E染色顯示，與FGF21-Fc相比，F(xiàn)GF21-Fc-leptin可更大程度改善MASH組織學(xué)特征和復(fù)合NAFLD活動(dòng)度評(píng)分（NAFLD activity score，NAS）。免疫組化分析顯示，F(xiàn)GF21-Fc-leptin處理小鼠肝臟中F4/80陽(yáng)性巨噬細(xì)胞減少幅度也明顯大于FGF21-Fc處理。Masson三色染色和天狼星紅染色進(jìn)一步提示，F(xiàn)GF21-Fc-leptin減輕肝纖維化的作用更強(qiáng)。與組織學(xué)變化一致，實(shí)時(shí)PCR分析顯示，F(xiàn)GF21-Fc-leptin處理小鼠肝組織中促炎基因Mcp1、Tnfα、Il1b以及纖維化相關(guān)基因Col1a1、Col3a1、Acta2下調(diào)幅度更大。相比之下，F(xiàn)c-leptin單藥對(duì)GAN飲食小鼠的肝重、脂質(zhì)積累、循環(huán)肝損傷標(biāo)志物、MASH和纖維化組織學(xué)特征，以及促炎和纖維化相關(guān)基因表達(dá)均無(wú)明顯影響。總體而言，這些結(jié)果進(jìn)一步支持FGF21與瘦素在對(duì)抗MASH和肝纖維化中的協(xié)同作用。

FGF21通過(guò)上調(diào)肝細(xì)胞瘦素受體增強(qiáng)瘦素作用，而非作用于大腦

肥胖與外周和中樞瘦素抵抗均相關(guān)，其中部分原因是瘦素受體表達(dá)降低。研究者重新分析小鼠肝細(xì)胞單細(xì)胞RNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)，與瘦小對(duì)照相比，飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠肝臟瘦素受體（Lepr）表達(dá)顯著降低。Lepr基因可通過(guò)可變剪接產(chǎn)生多種異構(gòu)體，包括能夠完整傳遞信號(hào)的長(zhǎng)異構(gòu)體Leprb、短異構(gòu)體Lepra和Leprc，以及可溶性異構(gòu)體Lepre。免疫印跡分析同樣顯示，DIO小鼠下丘腦和肝臟中Leprb蛋白表達(dá)降低。進(jìn)一步細(xì)胞分離分析顯示，DIO小鼠Leprb表達(dá)降低主要發(fā)生在肝細(xì)胞，而不是非實(shí)質(zhì)細(xì)胞（non-parenchymal cells，NPCs）。由于既往研究曾發(fā)現(xiàn)FGF21處理肥胖小鼠后，肝臟中瘦素受體mRNA是顯著上調(diào)基因之一，因此作者推測(cè)，F(xiàn)GF21與瘦素在肥胖小鼠中的協(xié)同效應(yīng)可能來(lái)自FGF21改善瘦素抵抗的能力。

研究隨后評(píng)估FGF21對(duì)多個(gè)主要瘦素靶組織中瘦素受體表達(dá)的慢性影響。與Fc對(duì)照組相比，F(xiàn)GF21-Fc處理顯著增加肥胖小鼠肝臟中Leprb及其截短異構(gòu)體Lepra、Leprc和Lepre表達(dá)，但在下丘腦、脂肪組織和腓腸肌中無(wú)此作用。進(jìn)一步細(xì)胞分離分析顯示，F(xiàn)GF21誘導(dǎo)的Leprb表達(dá)主要發(fā)生于肝細(xì)胞，而非NPCs。

天然形式的FGF21和瘦素均為小分子蛋白，可穿過(guò)血腦屏障進(jìn)入大腦并調(diào)節(jié)能量穩(wěn)態(tài)和代謝。為探索這些腹腔注射的Fc融合蛋白是否也能進(jìn)入大腦，研究者在給藥2小時(shí)后檢測(cè)血清和腦脊液（cerebrospinal fluid，CSF）中的人FGF21和人瘦素水平。結(jié)果顯示，F(xiàn)c-leptin和FGF21-Fc-leptin處理后，人瘦素在血清中含量豐富，但在CSF中幾乎檢測(cè)不到；同樣，F(xiàn)GF21-Fc和FGF21-Fc-leptin處理后，人FGF21在血清中含量豐富，但在CSF中也幾乎不可檢測(cè)。此外，處理0.5小時(shí)后，F(xiàn)GF21-Fc-leptin和Fc-leptin可誘導(dǎo)瘦小小鼠肝臟中STAT3 Tyr705位點(diǎn)磷酸化，但不能誘導(dǎo)下丘腦STAT3磷酸化。這提示FGF21-Fc-leptin的藥理活性主要由外周作用而非中樞作用介導(dǎo)。

圖3：長(zhǎng)期給予FGF21選擇性增加肥胖小鼠肝細(xì)胞中的瘦素受體表達(dá)。（A）（B）–（J）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖。8周齡C57BL/6J小鼠接受HFD喂養(yǎng)12周，隨后用FGF21-Fc或Fc處理（100 nmol/kg，腹腔注射，每2天一次，持續(xù)2周）。收集下丘腦、肝臟和eWAT用于評(píng)估Leprb表達(dá)，并分離肝細(xì)胞（hepatocytes，HEPs）和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞（NPCs）進(jìn)行細(xì)胞類(lèi)型特異性分析。（B和C）實(shí)時(shí)PCR分析肝臟中瘦素受體異構(gòu)體（Lepra、Leprb、Leprc和Lepre）的相對(duì)mRNA表達(dá)（B），以及下丘腦（Hypo）、eWAT和腓腸肌（gastrocnemius，Gas）中Leprb表達(dá)（C），并用β-actin歸一化。Fc組數(shù)值設(shè)為1。（D和E）不同組織中LEPRb蛋白代表性免疫印跡圖（D）及密度定量（E）。相對(duì)比較時(shí)，F(xiàn)c組數(shù)值設(shè)為1。印跡膜經(jīng)剝離后用指定抗體重新孵育。（F–H）Albumin mRNA表達(dá)（肝細(xì)胞特異性標(biāo)志物，F(xiàn)）和F4/80 mRNA表達(dá)（巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)志物，G）用于確認(rèn)HEPs和NPC組分分離成功。通過(guò)實(shí)時(shí)PCR測(cè)定HEPs和NPCs中Leprb mRNA表達(dá)（H）。（I和J）HEPs和NPCs中LEPRb蛋白表達(dá)水平的代表性免疫印跡圖（I）及密度定量（J）。印跡膜經(jīng)剝離后用指定抗體重新孵育。（K）（L）–（O）急性實(shí)驗(yàn)示意圖。8周齡C57BL/6J小鼠單次腹腔注射FGF21-Fc-leptin（L-Fc-F）、Fc-leptin、FGF21-Fc或Fc（100 nmol/kg）。注射后120分鐘收集血清和腦脊液（CSF）測(cè)定人瘦素和人FGF21；注射后30分鐘收集肝臟和下丘腦，通過(guò)免疫印跡檢測(cè)磷酸化STAT3（pSTAT3）。（L和M）使用ELISA試劑盒檢測(cè)血清和CSF中人瘦素（L）和人FGF21（M）水平。（N和O）肝臟和下丘腦中pSTAT3（Tyr705）的代表性免疫印跡圖（N）及定量（O）。數(shù)據(jù)以相對(duì)于Fc處理小鼠的倍數(shù)變化表示。印跡膜經(jīng)剝離后用指定抗體重新孵育。數(shù)據(jù)以均值±SEM表示。每組n=5–6。**p < 0.01，***p < 0.001；統(tǒng)計(jì)分析采用雙尾Student t檢驗(yàn)（B、C、E–H和J）以及單因素方差分析（L、M和O），并進(jìn)行Bonferroni事后檢驗(yàn)。

肝細(xì)胞特異性恢復(fù)功能性瘦素受體可恢復(fù)FGF21-Fc-leptin在db/db小鼠中的治療效應(yīng)

前述結(jié)果提示，F(xiàn)GF21/瘦素雙激動(dòng)劑的強(qiáng)效治療作用可能來(lái)自FGF21逆轉(zhuǎn)肝細(xì)胞中肥胖誘導(dǎo)的瘦素抵抗。為進(jìn)一步驗(yàn)證這一發(fā)現(xiàn)，研究者比較了FGF21-Fc-leptin在瘦素受體缺陷db/db小鼠中的藥理作用，并觀察在肝細(xì)胞中特異性恢復(fù)主要功能性瘦素受體Leprb后是否能恢復(fù)藥效。研究者將小鼠Leprb克隆至由肝細(xì)胞特異性甲狀腺素結(jié)合球蛋白（thyroxine-binding globulin，TBG）啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的慢病毒載體中，簡(jiǎn)稱(chēng)TBG-Leprb。隨后，將TBG-Leprb或僅表達(dá)熒光素酶對(duì)照（TBG-luci）的慢病毒以1 × 10? pfu/只劑量靜脈注射至db/db小鼠，2周后再腹腔給予FGF21-Fc-leptin或Fc，持續(xù)14天。生物發(fā)光成像顯示，熒光素酶主要在肝臟區(qū)域表達(dá)而非其他組織；Western blot進(jìn)一步證實(shí)，TBG-Leprb注射小鼠肝細(xì)胞中表達(dá)FLAG標(biāo)記的Leprb蛋白。

與TBG-luci對(duì)照小鼠相比，肝細(xì)胞特異性表達(dá)Leprb的db/db小鼠出現(xiàn)輕度但顯著的體重、脂肪量、血糖、血清胰島素、C肽、TC、TG和肝損傷標(biāo)志物下降，并伴隨肝脂肪變性緩解，以及eWAT和sWAT重量、脂肪細(xì)胞大小降低。這些由TBG-Leprb帶來(lái)的改善伴隨能量消耗增加，但攝食量和自主活動(dòng)無(wú)明顯變化。上述結(jié)果提示，僅恢復(fù)肝細(xì)胞中的功能性Leprb，即可部分改善db/db小鼠的肥胖相關(guān)代謝并發(fā)癥。在慢病毒介導(dǎo)肝細(xì)胞特異性mLeprb表達(dá)的db/db小鼠中，F(xiàn)GF21-Fc-leptin注射表現(xiàn)出強(qiáng)效藥理活性，可改善肥胖、高血糖、高胰島素血癥、高脂血癥和MASLD，并降低肝損傷標(biāo)志物、增加能量消耗。相反，在TBG-luci對(duì)照db/db小鼠中，F(xiàn)GF21-Fc-leptin的藥理作用顯著較弱。這說(shuō)明，肝細(xì)胞中特異性恢復(fù)功能性Leprb足以使db/db小鼠重新對(duì)FGF21/瘦素雙激動(dòng)劑敏感。

圖4：在db/db小鼠肝細(xì)胞中重建功能性瘦素受體（Leprb）可恢復(fù)FGF21/瘦素雙激動(dòng)劑的治療效應(yīng)。（A）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖。8周齡雄性db/db小鼠靜脈注射編碼TBG驅(qū)動(dòng)Leprb（TBG-Leprb）或熒光素酶對(duì)照（TBG-luci）的慢病毒，劑量為1 × 10? pfu/只，隨后接受FGF21-Fc-leptin（L-Fc-F）或Fc處理（100 nmol/kg，腹腔注射，每2天一次，持續(xù)2周）。（B）TBG-Leprb或TBG-luci注射2周后，分離肝細(xì)胞中C端FLAG標(biāo)記LEPRb的代表性免疫印跡圖。印跡膜經(jīng)剝離后用指定抗體重新孵育。（C）慢病毒注射2周及隨后蛋白處理2周期間體重動(dòng)態(tài)變化。（D）L-Fc-F或Fc處理2周前后脂肪量相對(duì)變化。（E和F）單次注射后不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定進(jìn)食狀態(tài)下血糖水平（E），或在每次注射前連續(xù)29天監(jiān)測(cè)血糖（F）。（G–I）小鼠處死后收集樣本，測(cè)定血清胰島素（G）、C肽（H）、總TC和TG（I）水平。（J）肝臟整體外觀代表性圖像（上排，比例尺5 mm）、H&E染色（中排，比例尺50 μm）和肝切片油紅O（ORO）染色（下排，比例尺50 μm）。（K）血清AST和ALT水平。（L和M）肝臟濕重（L）以及按肝蛋白含量歸一化后的肝臟甘油三酯和膽固醇含量（M）。（N）eWAT和sWAT整體外觀代表性圖像（第一、第三排，比例尺3.5 mm）和H&E切片（第二、第四排，比例尺50 μm）。（O–R）eWAT濕重（O）和脂肪細(xì)胞大小（P），以及sWAT濕重（Q）和脂肪細(xì)胞大小（R）。（S–X）在蛋白處理第12至13天，通過(guò)間接量熱法在連續(xù)48小時(shí)明暗周期內(nèi)測(cè)定總能量消耗（EE，S）、呼吸交換率（RER，U）和自主活動(dòng)（W）。明期和暗期平均EE（T）、RER（V）和活動(dòng)量（X）如圖所示。所有柱狀圖中，黑點(diǎn)、藍(lán)色三角形、紅色菱形和綠色倒三角形分別代表TBG-luci+Fc、TBG-luci+L-Fc-F、TBG-Leprb+Fc和TBG-Leprb+L-Fc-F。數(shù)據(jù)以均值±SEM表示。每組n=5–7只小鼠。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001；統(tǒng)計(jì)分析采用單因素方差分析（D、G–I、K–M、O–R、V和X）和雙因素方差分析（C、E和F），并進(jìn)行Bonferroni事后檢驗(yàn)。組間EE比較采用ANCOVA（T），以體重作為協(xié)變量。

肝細(xì)胞特異性敲除Lepr阻斷FGF21與瘦素的協(xié)同效應(yīng)

為進(jìn)一步闡明肝臟瘦素受體在FGF21與瘦素協(xié)同作用中的作用，研究者通過(guò)向Leprflox小鼠靜脈注射由肝細(xì)胞特異性TBG啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Cre重組酶AAV，構(gòu)建肝細(xì)胞特異性Lepr敲除小鼠（Lepr-HKO）。Western blot分析證實(shí)，Lepr-HKO小鼠肝細(xì)胞中Lepr被選擇性消融，而NPCs中未出現(xiàn)同樣改變。

如預(yù)期，HFD喂養(yǎng)的Leprflox野生型（WT）小鼠接受FGF21-Fc-leptin治療2周后，與Fc處理小鼠相比，體重、脂肪量、血糖、血清胰島素、C肽、TC和TG顯著下降，肝損傷和脂肪變性改善，eWAT和sWAT重量及脂肪細(xì)胞大小降低，EE和RER升高。然而，在HFD喂養(yǎng)的Lepr-HKO小鼠中，F(xiàn)GF21-Fc-leptin緩解HFD誘導(dǎo)脂肪堆積、高血糖、高胰島素血癥、低脂聯(lián)素血癥、高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥和MASLD的這些藥理益處均明顯減弱。FGF21-Fc-leptin或Fc處理后，Lepr-HKO小鼠與Leprflox小鼠的攝食量、瘦體重和自主活動(dòng)相當(dāng)。綜上，這些發(fā)現(xiàn)支持肝臟Lepr在FGF21/瘦素雙激動(dòng)劑對(duì)抗肥胖相關(guān)代謝并發(fā)癥藥理作用中具有必要作用。

圖5：肝細(xì)胞特異性消融瘦素受體可取消FGF21/瘦素雙激動(dòng)劑在肥胖小鼠中的治療作用。（A）研究設(shè)計(jì)示意圖。8周齡雄性Leprflox小鼠接受HFD喂養(yǎng)12周，隨后靜脈注射腺相關(guān)病毒8型，表達(dá)由TBG啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Cre重組酶（AAV8-TBG-Cre），以生成肝細(xì)胞（HEP）特異性Lepr敲除小鼠（Lepr-HKO）；或注射表達(dá)由TBG驅(qū)動(dòng)熒光素酶的AAV8作為對(duì)照（WT），劑量為5 × 1011 pfu/只。2周后，小鼠接受FGF21-Fc-leptin（L-Fc-F）或Fc處理（100 nmol/kg，腹腔注射，每2天一次，持續(xù)2周）。（B和C）AAV注射2周后，HEPs和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞（NPCs）中LEPRb蛋白表達(dá)：代表性免疫印跡圖（B）和密度定量（C），以相對(duì)于WT的倍數(shù)變化表示。印跡膜經(jīng)剝離后用指定抗體重新孵育。（D和E）治療14天期間體重變化（D）和脂肪量變化（E）。（F和G）單次注射后不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定進(jìn)食狀態(tài)下血糖水平（F），并在每次注射前連續(xù)14天監(jiān)測(cè)血糖（G）。（H–J）小鼠處死后測(cè)定血清胰島素（H）、C肽（I）、總膽固醇（TC）和甘油三酯（TG，J）。（K和L）肝臟濕重（K）以及按蛋白含量歸一化后的肝內(nèi)甘油三酯和膽固醇（L）。（M和N）血清AST（M）和ALT（N）活性。（O）肝臟整體外觀代表性圖像（上排，比例尺5 mm）、H&E染色（中排，比例尺50 μm）和肝切片油紅O（ORO）染色（下排，比例尺50 μm）。（P）eWAT和sWAT整體外觀代表性圖像（第一、第三排，比例尺3.5 mm）及相應(yīng)H&E切片（第二、第四排，50 μm）。（Q–T）eWAT濕重（Q）和脂肪細(xì)胞大小（R），以及sWAT濕重（S）和脂肪細(xì)胞大小（T）。（U–Z）在蛋白處理第12至13天，通過(guò)間接量熱法在連續(xù)48小時(shí)明暗周期內(nèi)測(cè)定總能量消耗（EE，U）、呼吸交換率（RER，W）和自主活動(dòng)（Y）。明期和暗期平均EE（V）、RER（X）和活動(dòng)量（Z）如圖所示。除（C）外，所有柱狀圖中黑點(diǎn)、藍(lán)色三角形、紅色菱形和綠色倒三角形分別代表WT+Fc、WT+L-Fc-F、Lepr-HKO+Fc和Lepr-HKO+L-Fc-F。數(shù)據(jù)以均值±SEM表示。每組n=5–7只小鼠。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001；統(tǒng)計(jì)分析采用雙尾Student t檢驗(yàn)（C）、單因素方差分析（E、H–N、Q–T、X和Z）以及雙因素方差分析（F和G），并進(jìn)行Bonferroni事后檢驗(yàn)。組間EE比較采用ANCOVA（V），以體重作為協(xié)變量。

FGF21通過(guò)脂肪細(xì)胞來(lái)源的脂聯(lián)素誘導(dǎo)肝臟Leprb表達(dá)

FGF21通過(guò)結(jié)合由FGFR1和β-Klotho組成的受體復(fù)合物發(fā)揮作用。然而，肝細(xì)胞是否為FGF21的直接靶細(xì)胞仍存在爭(zhēng)議。研究者重新分析GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中健康和MASLD小鼠肝臟肝細(xì)胞及NPCs的單細(xì)胞RNA測(cè)序數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)，只有肝細(xì)胞同時(shí)表達(dá)KLB和FGFR1，但KLB和FGFR1雙陽(yáng)性細(xì)胞僅占總肝細(xì)胞群的0.17%。值得注意的是，脂肪細(xì)胞分泌的脂聯(lián)素已被證明是介導(dǎo)FGF21多種代謝作用的下游效應(yīng)因子。因此，研究者進(jìn)一步探討FGF21是直接作用于肝細(xì)胞，還是通過(guò)脂聯(lián)素間接誘導(dǎo)Lepr表達(dá)。

在體外，研究者用油酸（oleic acid，OA，500 μM）和棕櫚酸（palmitic acid，PA，250 μM）混合物處理小鼠原代肝細(xì)胞，以模擬肥胖誘導(dǎo)的肝脂肪變性。PA/OA處理顯著降低Leprb mRNA和蛋白表達(dá)。脂質(zhì)負(fù)載肝細(xì)胞經(jīng)重組小鼠脂聯(lián)素處理后，Leprb表達(dá)明顯升高，而重組小鼠FGF21沒(méi)有這一作用。同樣，脂聯(lián)素而非FGF21可顯著增強(qiáng)瘦素抑制PA/OA誘導(dǎo)的兩個(gè)關(guān)鍵糖異生基因PEPCK1和G6Pase表達(dá)的作用，并降低肝糖輸出。此外，脂聯(lián)素處理還明顯增強(qiáng)瘦素促進(jìn)FAO相關(guān)基因Cpt1ɑ、Cpt2和Pparɑ表達(dá)以及氧消耗的活性。PA/OA或蛋白處理均未影響小鼠原代肝細(xì)胞活力。總體而言，這些發(fā)現(xiàn)提示，F(xiàn)GF21在脂質(zhì)負(fù)載肝細(xì)胞中增強(qiáng)瘦素敏感性的作用，可能由脂肪細(xì)胞來(lái)源的脂聯(lián)素介導(dǎo)。

脂聯(lián)素通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄因子STAT1誘導(dǎo)肝臟Leprb表達(dá)

為研究脂聯(lián)素如何誘導(dǎo)肝細(xì)胞Leprb表達(dá)，研究者進(jìn)行了計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)分析，在hTFtarget、ENCODE、GTRD、FIMO_JASPAR和KnockTF五個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中預(yù)測(cè)參與Leprb基因調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子。交集分析確定了三個(gè)轉(zhuǎn)錄因子STAT1、JUND和SP1，這些因子可能結(jié)合Leprb基因啟動(dòng)子區(qū)域。染色質(zhì)免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP）分析顯示，脂聯(lián)素處理可顯著誘導(dǎo)STAT1結(jié)合其預(yù)測(cè)DNA結(jié)合位點(diǎn)，但對(duì)JUND或SP1與各自Leprb啟動(dòng)子DNA基序的結(jié)合無(wú)明顯影響。序列比對(duì)分析顯示，Leprb基因啟動(dòng)子中的STAT1結(jié)合基序在多種哺乳動(dòng)物物種中高度保守，進(jìn)一步支持STAT1對(duì)Leprb基因表達(dá)的調(diào)控作用。

既往研究提示，脂聯(lián)素可在體外誘導(dǎo)OCCM-30細(xì)胞中STAT1磷酸化。因此，研究者進(jìn)一步考察脂聯(lián)素是否通過(guò)STAT1磷酸化誘導(dǎo)肝臟Leprb基因表達(dá)。小鼠原代肝細(xì)胞接受脂聯(lián)素處理30分鐘后，STAT1 Tyr701位點(diǎn)磷酸化顯著增強(qiáng)。進(jìn)一步使用STAT1特異性抑制劑氟達(dá)拉濱（fludarabine，F(xiàn)LU）進(jìn)行藥理抑制后，脂聯(lián)素促進(jìn)STAT1結(jié)合Leprb啟動(dòng)子和誘導(dǎo)肝細(xì)胞Leprb蛋白表達(dá)的作用大幅消失。

圖6：脂聯(lián)素通過(guò)STAT1介導(dǎo)的瘦素受體上調(diào)，使瘦素對(duì)肝細(xì)胞糖脂代謝的作用重新敏化。（A）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖。從6周齡雄性C57BL/6J小鼠分離原代肝細(xì)胞，先用250 μM棕櫚酸和500 μM油酸（PA/OA）孵育24小時(shí)，隨后在有或無(wú)10 μg/mL高分子量（high-molecular-weight，HMW）脂聯(lián)素（APN）或100 ng/mL重組小鼠FGF21條件下處理20小時(shí)，再根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要有或無(wú)100 ng/mL重組小鼠瘦素處理4小時(shí)（B–F）。（B）APN或FGF21處理20小時(shí)后，通過(guò)實(shí)時(shí)PCR測(cè)定Leprb mRNA表達(dá)。（C和D）原代肝細(xì)胞中LEPRb蛋白：代表性免疫印跡圖（C）和密度定量（D）。（E）糖異生基因Pepck1、G6Pase以及脂肪酸氧化（FAO）相關(guān)基因Cpt1a、Cpt2和Pparɑ的相對(duì)mRNA水平。（F）瘦素處理4小時(shí)后，使用葡萄糖檢測(cè)試劑盒測(cè)定肝糖輸出。（G）使用FAO檢測(cè)和氧消耗檢測(cè)試劑盒測(cè)定FAO驅(qū)動(dòng)的肝細(xì)胞O?消耗（每3分鐘一個(gè)點(diǎn)）。FCCP和依托莫昔（etomoxir）分別作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。熒光信號(hào)每3分鐘采集一次，激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為380/650 nm。（H和I）從6周齡雄性C57BL/6J小鼠分離小鼠原代肝細(xì)胞，有或無(wú)10 μg/mL小鼠APN處理24小時(shí)，隨后超聲處理并分別使用抗STAT1、抗SP1和抗JUND抗體進(jìn)行ChIP。（H）終點(diǎn)ChIP-PCR產(chǎn)物代表性凝膠圖像；（I）三個(gè)轉(zhuǎn)錄因子與其順式DNA元件結(jié)合的半定量結(jié)果，以輸入DNA百分比表示：% of input = 2^(CTInput?CTi.p.)/稀釋因子 × 100%。（J和K）有或無(wú)小鼠APN處理30分鐘后，肝細(xì)胞用于免疫印跡分析磷酸化STAT1（Tyr701）。（J）代表性印跡圖；（K）密度定量。印跡膜經(jīng)剝離后用指定抗體重新孵育。（L和M）肝細(xì)胞接受APN（10 μg/mL）處理，并有或無(wú)STAT1抑制劑氟達(dá)拉濱（FLU，2 μg/mL）共同處理24小時(shí)，隨后進(jìn)行STAT1 ChIP。（L）代表性ChIP-PCR凝膠圖。（M）柱狀圖表示輸入DNA百分比：% of input = 2^(CTInput?CTi.p.)/稀釋因子 × 100%。（N和O）STAT1抑制對(duì)APN誘導(dǎo)LEPRb蛋白的影響。APN ± FLU處理肝細(xì)胞24小時(shí)后檢測(cè)LEPRb蛋白：（N）代表性免疫印跡圖；（O）密度定量。印跡膜經(jīng)剝離后用指定抗體重新孵育。數(shù)據(jù)以均值±SEM表示。每組n=5–6。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001；統(tǒng)計(jì)分析采用雙尾Student t檢驗(yàn)（I和K）、單因素方差分析（B、D、E、F、M和O）以及雙因素方差分析（G），并進(jìn)行Bonferroni事后檢驗(yàn)。

脂聯(lián)素缺失消除FGF21與瘦素在肥胖小鼠中的協(xié)同作用

為進(jìn)一步驗(yàn)證體內(nèi)FGF21是否通過(guò)脂聯(lián)素增強(qiáng)肝臟瘦素敏感性，研究者比較了FGF21-Fc-leptin在脂聯(lián)素敲除（APN-KO）小鼠和WT同窩小鼠飲食誘導(dǎo)肥胖模型中的作用。結(jié)果顯示，WT小鼠接受FGF21-Fc-leptin治療14天后，肝細(xì)胞Leprb mRNA和蛋白表達(dá)顯著升高，而這一作用在APN-KO小鼠中被取消。同樣，F(xiàn)GF21-Fc-leptin處理WT小鼠后，體重、脂肪量、血糖水平，以及血清膽固醇、甘油三酯、胰島素和C肽水平均明顯下降，同時(shí)伴隨EE和RER升高、肝脂肪變性減少、AST和ALT降低，以及eWAT和sWAT質(zhì)量、重量和脂肪細(xì)胞大小下降。然而，在APN-KO小鼠中，F(xiàn)GF21-Fc-leptin緩解飲食誘導(dǎo)肥胖相關(guān)代謝共病的協(xié)同作用被顯著削弱。此外，F(xiàn)GF21-Fc-leptin可在WT小鼠中顯著抑制肥胖誘導(dǎo)的兩個(gè)關(guān)鍵糖異生基因PEPCK1和G6Pase表達(dá)，并上調(diào)FAO相關(guān)基因Cpt1ɑ、Cpt2和Pparɑ表達(dá)，但在APN-KO小鼠中沒(méi)有相同效果。WT和APN-KO小鼠在FGF21-Fc-leptin或Fc處理后的自主活動(dòng)和攝食量相當(dāng)。綜合來(lái)看，這些結(jié)果提示，脂聯(lián)素缺失會(huì)損害FGF21增加肝細(xì)胞瘦素受體的能力，從而取消FGF21與瘦素之間的協(xié)同作用。

脂聯(lián)素改善脂質(zhì)負(fù)載人肝細(xì)胞和人肝類(lèi)器官中的瘦素敏感性與糖脂代謝

為探索動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)化潛力，研究者進(jìn)一步在人肝細(xì)胞中考察FGF21、脂聯(lián)素和瘦素之間的功能互作。細(xì)胞先用OA（500 μM）和PA（250 μM）預(yù)孵育24小時(shí)誘導(dǎo)脂肪變性，隨后用人脂聯(lián)素或FGF21處理20小時(shí)，并在最后4小時(shí)有或無(wú)加入人瘦素。與小鼠肝細(xì)胞結(jié)果相似，脂聯(lián)素而非FGF21顯著逆轉(zhuǎn)PA/OA誘導(dǎo)的Leprb基因表達(dá)下降。同樣，脂聯(lián)素而非FGF21顯著增強(qiáng)瘦素抑制PA/OA誘導(dǎo)肝糖輸出以及促進(jìn)氧消耗的作用。這些脂聯(lián)素誘導(dǎo)的變化，與共同刺激瘦素和脂聯(lián)素時(shí)兩個(gè)糖異生基因Pepck1和G6pase表達(dá)顯著降低、FAO相關(guān)基因Cpt1ɑ、Cpt2和Pparɑ表達(dá)升高相一致。

為進(jìn)一步驗(yàn)證FGF21與瘦素在MASLD中的藥理協(xié)同作用，研究者構(gòu)建了人肝類(lèi)器官（HLOs）。具體而言，研究者將無(wú)足跡人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）來(lái)源的后前腸細(xì)胞在肝球培養(yǎng)基中分化12天，再在肝類(lèi)器官培養(yǎng)基中成熟14天，并在成熟階段加入250 μM PA和500 μM OA誘導(dǎo)脂肪變性。成熟階段第8至14天，類(lèi)器官接受重組人FGF21、人脂聯(lián)素、人瘦素或人瘦素聯(lián)合人脂聯(lián)素刺激。結(jié)果顯示，與BSA對(duì)照相比，PA/OA誘導(dǎo)HLOs中Leprb表達(dá)明顯下降。脂聯(lián)素或脂聯(lián)素聯(lián)合瘦素，而非FGF21或瘦素，可在很大程度上將PA/OA處理HLOs中的Leprb基因表達(dá)恢復(fù)至接近BSA對(duì)照水平。同樣，脂聯(lián)素和瘦素聯(lián)合處理HLOs可更顯著降低糖輸出和兩個(gè)糖異生基因表達(dá)，并更強(qiáng)地上調(diào)FAO相關(guān)基因。尼羅紅染色和生化分析顯示，PA/OA誘導(dǎo)的HLOs脂滴形成和甘油三酯積累幾乎可被脂聯(lián)素聯(lián)合瘦素處理完全阻斷，而單獨(dú)脂聯(lián)素僅產(chǎn)生輕度降低；相反，F(xiàn)GF21處理對(duì)PA/OA誘導(dǎo)的HLOs糖異生、脂滴形成或甘油三酯積累無(wú)影響。總體而言，這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持這樣一種觀點(diǎn)：FGF21與瘦素改善糖脂代謝和緩解MASLD的協(xié)同效應(yīng)，是通過(guò)脂聯(lián)素依賴(lài)性的肝細(xì)胞瘦素作用敏化實(shí)現(xiàn)的。

圖7：APN抵消游離脂肪酸導(dǎo)致的瘦素脫敏，從而在人肝細(xì)胞和HLOs中抑制脂肪變性與糖異生。（A）（B）–（E）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖。人肝細(xì)胞先用溶解于1% BSA中的棕櫚酸（PA，250 μM）和油酸（OA，500 μM）（PA/OA）或僅1% BSA處理24小時(shí)，隨后用重組人脂聯(lián)素（APN，10 μg/mL）或人FGF21（100 ng/mL）處理20小時(shí)，或用PBS作為對(duì)照，再根據(jù)指定條件用重組人瘦素（100 ng/mL）刺激4小時(shí)。（B）不同處理?xiàng)l件下肝細(xì)胞LEPRb mRNA水平，表示為相對(duì)于未接受蛋白處理細(xì)胞的倍數(shù)變化。（C和D）不同處理?xiàng)l件下肝糖輸出（C）以及兩個(gè)關(guān)鍵糖異生基因PEPCK1和G6Pase的相對(duì)mRNA豐度（D）。（D和E）若干脂肪酸氧化（FAO）相關(guān)基因Cpt1a、Cpt2和Pparɑ的mRNA表達(dá)水平（D）。使用FAO和氧消耗檢測(cè)試劑盒評(píng)估FAO依賴(lài)性O(shè)?消耗（E），F(xiàn)CCP和依托莫昔分別作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照，信號(hào)每3分鐘在380/650 nm記錄一次。（F）HLOs實(shí)驗(yàn)流程示意圖。在分化階段，將無(wú)足跡人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）細(xì)胞系在肝球培養(yǎng)基中培養(yǎng)12天，形成肝球（LivS）。在成熟階段，LivS在肝類(lèi)器官（LivO）培養(yǎng)基中培養(yǎng)14天，并用游離脂肪酸（PA/OA，500 μM油酸和250 μM棕櫚酸）或1% BSA作為空白對(duì)照處理，最終形成脂肪肝類(lèi)器官（fatty liver organoid，F(xiàn)LO）。在成熟階段第8至14天，F(xiàn)LOs接受人瘦素（100 ng/mL）、人FGF21（100 ng/mL）、人APN（10 μg/mL）、人APN聯(lián)合人瘦素（APN+leptin）以及PBS對(duì)照處理。（G和H）指定處理?xiàng)l件下FLOs中LEPRb mRNA（G）和肝糖輸出（H）。（I）糖異生基因PEPCK1、G6Pase以及FAO相關(guān)基因Cpt1a、Cpt2和PPARα的mRNA水平，表示為相對(duì)于PBS處理FLOs的水平。（J）FLO中甘油三酯濃度。（K）FLO脂滴的尼羅紅染色。明場(chǎng)圖像顯示類(lèi)器官整體形態(tài)。脂滴和細(xì)胞核分別用尼羅紅（紅色）和DAPI（藍(lán)色）染色/復(fù)染。比例尺50 μm。（L）不同處理?xiàng)l件下PA/OA誘導(dǎo)脂肪變性的半定量脂質(zhì)評(píng)分。評(píng)分基于任意顏色標(biāo)尺，范圍從0（綠色，未接受PA/OA處理的對(duì)照類(lèi)器官基礎(chǔ)脂質(zhì)水平）到1（紅色，未接受蛋白處理的PA/OA處理類(lèi)器官最大脂質(zhì)積累）。每個(gè)柱代表一個(gè)單獨(dú)類(lèi)器官。（M）FLOs中各組平均脂質(zhì)評(píng)分。數(shù)據(jù)以均值±SEM表示。每組n=4–7。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001；統(tǒng)計(jì)分析采用單因素方差分析（B–D、G–J和M）以及雙因素方差分析（E），并進(jìn)行Bonferroni事后檢驗(yàn)。

【貢獻(xiàn)】★★★★★

本研究揭示了一種此前未被充分認(rèn)識(shí)的外周組織層面FGF21與瘦素協(xié)同互作模式，可改善能量穩(wěn)態(tài)和糖脂代謝。考慮到多項(xiàng)肥胖人群臨床試驗(yàn)顯示，基于FGF21類(lèi)似物的單藥治療效果有限，尤其在減重和血糖控制方面較弱，本研究開(kāi)發(fā)的長(zhǎng)效FGF21/瘦素雙激動(dòng)劑FGF21-Fc-leptin，可能為增強(qiáng)FGF21類(lèi)藥物治療肥胖相關(guān)多重代謝共病的療效提供一種有前景的策略。

同時(shí)，作者也指出了研究局限：本研究主要在雄性小鼠中進(jìn)行，尚未評(píng)估FGF21與瘦素互作的性別差異，以及FGF21/瘦素雙激動(dòng)劑治療是否存在性別特異性反應(yīng)；每組小鼠實(shí)驗(yàn)樣本量相對(duì)較小；不同蛋白藥物處理持續(xù)時(shí)間較短，其長(zhǎng)期療效和安全性仍需進(jìn)一步研究；雖然研究使用了人原代肝細(xì)胞和人肝類(lèi)器官來(lái)探索小鼠發(fā)現(xiàn)的臨床轉(zhuǎn)化可能性，但尚未提供藥理性FGF21改善人類(lèi)肥胖誘導(dǎo)肝臟瘦素抵抗的直接證據(jù)。

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