Circulation Research｜心衰線粒體保護新軸：SBK2磷酸化NDUFV1促進其入線粒體，限制病理性心肌肥厚！（折志剛 /李紅良團隊—武漢大學）

2026年7月6日，武漢大學人民醫院折志剛團隊、李紅良團隊等，在Circulation Research（中科院1區，IF=18.0）在線發表題為“SBK2-Driven NDUFV1 Phosphorylation and Translocation Limits Cardiac Hypertrophy”的原創研究論文。

心力衰竭的重要病理基礎之一是病理性心肌肥厚，而線粒體功能障礙，尤其是線粒體復合物I活性受損，是推動心肌能量代謝失衡和心功能惡化的關鍵環節。該研究通過跨物種轉錄組篩選、UK Biobank遺傳關聯分析、細胞和小鼠功能實驗、蛋白質組學、體外激酶實驗、線粒體蛋白導入分析和藍色原位PAGE等方法，鑒定出心臟富集激酶SBK2是限制病理性心肌肥厚的重要保護因子。

研究發現，SBK2可直接結合并磷酸化線粒體復合物I核心亞基NDUFV1的Ser251位點，增強NDUFV1與胞質分子伴侶HSPA1A的相互作用，并促進其經TOM70依賴方式進入線粒體。進入線粒體后的NDUFV1有助于維持復合物I活性、呼吸超復合體組裝、氧化磷酸化、線粒體融合和氧化還原穩態，從而限制壓力負荷誘導的心肌肥厚和心功能損害。需要注意的是，本研究證據主要來自小鼠模型和心肌細胞實驗，尚不能直接等同于人體臨床療效。

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【摘 要】

背景：心力衰竭仍是全球重大健康負擔，其發生發展很大程度上由病理性心肌肥厚驅動。線粒體功能障礙，尤其是線粒體復合物I活性受損，是疾病進展的核心因素之一，但其調控機制尚未完全明確。跨物種轉錄組篩選和UK Biobank分析發現，SBK2（Src homology 3 domain-binding kinase 2）是一種保守的、心臟富集的激酶，可能與心力衰竭風險相關。研究假設，SBK2可通過調控線粒體復合物I功能影響心肌肥厚。

方法：研究首先基于Gene Expression Omnibus（GEO）數據集識別跨物種保守基因，并在UK Biobank隊列中分析SBK2、ADAMTSL2、LOX和SPP1基因上下游±10 kb區域內變異與心力衰竭之間的關聯。隨后，研究在實驗模型和公開的人肥厚型心肌病數據集中檢測SBK2表達，并通過心肌細胞和小鼠中的功能獲得與功能缺失實驗評估其作用。研究還通過蛋白質組學和相互作用組學分析鑒定SBK2底物及互作蛋白，并采用體外激酶實驗和共免疫沉淀進行驗證。線粒體蛋白導入和呼吸超復合體組裝則通過生化分級和藍色原位PAGE進行評估。

結果：SBK2在肥厚心臟和原代新生大鼠心室肌細胞中表達降低。心肌細胞特異性過表達SBK2可減輕心肌肥厚和纖維化，改善收縮功能，并抑制適應不良性基因表達；相反，敲低SBK2會加重這些表型。機制上，SBK2可直接結合并磷酸化NDUFV1（NADH: ubiquinone oxidoreductase core subunit V1）的Ser251位點。該修飾增強了NDUFV1與胞質分子伴侶HSPA1A（heat shock protein family A [Hsp70] member 1A）之間的相互作用，并促進TOM70（translocase of outer mitochondrial membrane 70）依賴的線粒體導入。線粒體內NDUFV1增加后，可促進復合物I活性、呼吸超復合體組裝、氧化磷酸化、線粒體融合和氧化還原穩態。藥理性抑制復合物I或沉默NDUFV1均可消除SBK2介導的保護作用。此外，不能被磷酸化的NDUFV1突變體S251A無法挽救SBK2缺失心肌細胞中的肥厚表型。

結論：SBK2是一個上游激酶，可通過磷酸化NDUFV1將胞質信號與線粒體蛋白導入過程連接起來，從而維持復合物I完整性和線粒體功能，限制病理性心肌肥厚。該研究揭示了一條此前未被認識的SBK2-NDUFV1信號軸，將激酶信號、線粒體蛋白穩態和心力衰竭潛在治療靶點聯系起來。

01

研究背景及科學問題

心力衰竭（heart failure，HF）是多種心血管疾病最終共同的病理結局，全球約1%—3%人群受到影響。2021年，全球心力衰竭患者約為5550萬人，且患病率仍在上升。心肌肥厚是心力衰竭的重要機制之一。早期心肌肥厚可作為心肌細胞增大的代償反應，但隨后會轉變為適應不良狀態，推動疾病進展，最終導致失代償和泵功能障礙。

目前臨床藥物治療，如血管緊張素受體-腦啡肽酶抑制劑、β受體阻滯劑、鹽皮質激素受體拮抗劑和鈉-葡萄糖協同轉運蛋白2抑制劑等，主要用于緩解癥狀并改善預后，但尚不能逆轉病理性重構。因此，尋找能夠有效阻止適應不良性心肌肥厚的新分子靶點，仍是當前研究中的重要問題。

病理性心肌肥厚涉及多種機制，包括心肌細胞死亡、Ca2?穩態紊亂、線粒體功能障礙、代謝重編程以及胎兒基因重新激活等。其中，線粒體功能障礙尤為關鍵，因為心肌細胞高度依賴氧化磷酸化產生ATP。能量生成受損已成為心力衰竭的典型特征。

在線粒體中，維持復合物I功能尤其重要。復合物I是氧化磷酸化過程中的關鍵限速環節。已有研究顯示，NDUFV1、NDUFS4和NDUFS6等復合物I亞基的致病性變異，可在人類和實驗模型中損害線粒體功能，并促進早發性心肌肥厚和心功能障礙。因此，維持或增強復合物I功能可能是一種具有潛力的治療思路。

然而，治療性調控復合物I并不容易。蛋白質翻譯后修飾，尤其是磷酸化，已經被認為是重要且具有藥物干預潛力的調控機制。蛋白質組學研究已在線粒體復合物I多個亞基中發現多個磷酸化位點，提示復合物I酶活性可能受激酶介導的動態調控。不過，在病理條件下負責這些修飾的具體激酶仍不清楚。鑒于線粒體功能具有組織特異性調控特點，心臟富集激酶可能在這一過程中發揮重要作用。

本研究通過整合無偏轉錄組分析和UK Biobank數據，發現SBK2表達降低與心力衰竭發生率升高相關，提示其可能參與心肌肥厚和心力衰竭發病。SBK家族是一類絲氨酸/蘇氨酸激酶，具有組織特異性調控作用。SBK1廣泛表達，并被報道可影響癌癥和代謝功能障礙相關脂肪性肝病中的線粒體膜電位和代謝重編程。這些發現提示，心臟富集的同源蛋白SBK2可能在心肌肥厚中具有關鍵調節功能。

SBK2在心肌細胞中高表達，并可與參與ATP消耗過程的蛋白相互作用，包括翻譯、細胞內轉運和肌節組織相關蛋白。然而，SBK2是否調控線粒體功能，此前研究仍然不足。

本研究發現，SBK2在人類衰竭心臟和小鼠肥厚心臟中顯著降低。功能上，SBK2可通過改善線粒體功能減輕病理性心肌肥厚和心力衰竭。機制上，SBK2可在Ser251位點磷酸化復合物I亞基NDUFV1，增強NDUFV1與HSPA1A之間的相互作用，促進NDUFV1進入線粒體，從而改善線粒體呼吸能力。整體而言，這些發現將SBK2確定為恢復線粒體功能并治療病理性心肌肥厚的潛在靶點。

02

重要發現及亮點

SBK2是病理性心肌肥厚中保守的應激響應基因，并在肥厚心臟中下調

為了尋找在病理性心肌肥厚發生中具有重要作用的保守調節因子，研究人員首先在多個物種中進行差異表達基因分析。研究從4個GEO小鼠數據集中識別出154個共同差異表達基因；再與大鼠GEO數據集整合，得到18個小鼠-大鼠共享差異表達基因；進一步與豬數據集取交集，得到6個小鼠-大鼠-豬共同差異表達基因；最后與人類Genome Sequence Archive數據集整合，篩選出4個跨物種保守差異表達基因：Sbk2、Adamtsl2、Lox和Spp1。

隨后，研究人員分析這些基因與心力衰竭遺傳風險的關系。UK Biobank數據中，SBK2、SPP1和ADAMTSL2位點附近可觀察到名義顯著的單核苷酸多態性信號，而LOX區域未見明顯關聯。進一步基于GTEx數據進行cis-eQTL分析發現，SBK2附近變異rs310451與人左心室組織中SBK2表達呈名義負相關，而ADAMTSL2和SPP1未顯示有意義的表達相關性。整合心力衰竭風險和基因表達后，研究最終鎖定SBK2位點內一個重要變異rs310451，其同時與SBK2表達降低和心力衰竭風險升高相關。

在小鼠橫主動脈縮窄（transverse aortic constriction，TAC）模型中，SBK2蛋白水平顯著下降，而心肌肥厚標志物MYH7、ANP和BNP升高。免疫組織化學也證實TAC心臟中SBK2表達降低。轉錄水平上，Sbk2 mRNA在TAC心臟中下調，而Myh7、Nppa和Nppb升高。相關性分析顯示，SBK2與這些心肌肥厚標志物呈顯著負相關。

在苯腎上腺素刺激的新生大鼠心室肌細胞（neonatal rat ventricular myocytes，NRVMs）中，SBK2在mRNA和蛋白水平上均隨刺激時間延長而下降，同時上述肥厚標志物在24—48小時內升高。人類肥厚型心肌病數據集分析也顯示，與健康對照相比，患者SBK2 mRNA表達顯著降低。上述結果共同表明，SBK2是病理性心肌肥厚中一個保守、下調且應激響應的基因。

圖1：SBK2（Src homology 3 domain-binding kinase 2）響應病理性心肌肥厚應激。A，病理性心肌肥厚中跨物種差異表達基因（DEGs）鑒定流程。差異表達基因（|log2FC|>2，校正后P<0.05）來自GEO數據庫中的小鼠、大鼠和豬轉錄組數據集，以及GSA數據庫中的人類數據集。通過對差異表達基因集進行連續取交集，獲得保守基因，包括SBK2、ADAMTSL2（ADAMTS樣蛋白2）、LOX（賴氨酰氧化酶）和SPP1（分泌型磷蛋白1）。B，展示SBK2、ADAMTSL2、LOX和SPP1上下游±10 kb范圍內單核苷酸多態性（SNPs）的區域關聯圖。C，SBK2、SPP1和ADAMTSL2上下游±10 kb范圍內SNPs與左心室組織中相應基因表達之間的相關性圖。D，SBK2、SPP1和ADAMTSL2上下游±10 kb范圍內SNPs與心力衰竭（HF）風險及基因表達的整合分析圖。E，小鼠Sham或TAC手術12周后心臟中MYH7（肌球蛋白重鏈7）、ANP（心房鈉尿肽）、BNP（B型鈉尿肽）和SBK2蛋白表達的代表性Western blot及定量分析（每組n=6只小鼠）。定量分析采用非配對雙尾Student t檢驗。F，小鼠Sham或TAC手術12周后心臟中SBK2表達的代表性免疫組織化學圖像及定量分析，IgG作為陰性對照（比例尺=50 μm；每組n=6只小鼠）。組間差異采用非配對雙尾Student t檢驗分析。G，小鼠Sham或TAC手術12周后心臟中Myh7、Nppa、Nppb和Sbk2的mRNA表達水平（每組n=6只小鼠），數據采用非配對雙尾Student t檢驗分析。H，小鼠Sham或TAC手術12周后心臟中Myh7、Nppa、Nppb和Sbk2 mRNA表達的相關性分析（每組n=6只小鼠），統計分析采用Spearman相關檢驗。I，NRVMs經苯腎上腺素（PE）刺激0、24或48小時后，MYH7、ANP、BNP和SBK2蛋白水平的代表性Western blot及定量分析（n=3次獨立實驗）。數據采用單因素方差分析，并進行Bonferroni多重比較檢驗。J，NRVMs經PE刺激0、24和48小時后，Myh7、Nppa、Nppb和Sbk2 mRNA表達水平（n=5次獨立實驗）。統計分析采用單因素方差分析，其中Myh7和Sbk2采用Tukey事后檢驗，Nppa和Nppb采用Bonferroni事后檢驗。K，健康對照和肥厚型心肌病（HCM）患者中SBK2 mRNA相對表達量（PMID: 38780967 IF: 12.8 Q1 B1；健康對照N=8，HCM患者N=12）。數值以均值±SD表示。

SBK2在心肌細胞中顯著抑制肥厚反應

研究人員進一步在NRVMs中通過功能獲得和功能缺失實驗分析SBK2對心肌細胞肥厚的影響。Western blot證實SBK2過表達成功。SBK2過表達顯著減輕PE誘導的心肌細胞增大、肥厚相關基因表達升高，以及蛋白水平上的胎兒基因重編程。

相反，SBK2敲低會加重PE誘導的心肌細胞肥厚，表現為細胞面積進一步增大，肥厚標志物在mRNA和蛋白水平上進一步升高。上述結果說明，SBK2可限制病理性心肌細胞肥厚。

圖2：SBK2保護新生大鼠心室肌細胞（NRVMs）免受肥厚刺激。A，NRVMs感染GFP（綠色熒光蛋白）對照腺病毒或過表達Sbk2的腺病毒后，FLAG-SBK2（外源性）和內源性SBK2蛋白水平的代表性Western blot及內源性SBK2定量分析（n=3次獨立實驗）。兩組差異采用非配對雙尾Student t檢驗分析。B，NRVMs感染GFP對照腺病毒或過表達Sbk2腺病毒后，經PBS或苯腎上腺素（PE）刺激24小時，α-actinin免疫熒光代表性圖像及心肌細胞表面積定量分析。數據采用單因素方差分析，并進行Bonferroni事后檢驗（比例尺=20 μm；n=5次獨立實驗）。C，NRVMs感染GFP對照腺病毒或過表達Sbk2腺病毒后，在PBS或PE刺激下，Nppa、Nppb和Myh7 mRNA相對表達水平（n=5次獨立實驗）。統計分析采用單因素方差分析，并進行Bonferroni事后檢驗。D和E，NRVMs感染GFP對照腺病毒或過表達Sbk2腺病毒后，經PBS或PE刺激24小時，ANP、BNP、MYH7和SBK2蛋白水平的代表性Western blot及定量分析（n=3次獨立實驗）。ANP、BNP和MYH7采用單因素方差分析并進行Bonferroni多重比較檢驗，SBK2采用Tamhane T2檢驗。F，NRVMs感染對照載體腺病毒或表達shSbk2腺病毒后，SBK2蛋白水平的代表性Western blot（n=3次獨立實驗）。G，NRVMs感染對照載體腺病毒或表達shSbk2腺病毒后，經PBS或PE刺激24小時，α-actinin免疫熒光代表性圖像及心肌細胞表面積定量分析。統計分析采用單因素方差分析并進行Bonferroni事后檢驗（比例尺=20 μm；n=5次獨立實驗）。H，NRVMs感染對照載體腺病毒或表達shSbk2腺病毒后，在PBS或PE刺激24小時條件下，Nppa、Nppb和Myh7 mRNA相對表達水平（n=5次獨立實驗）。Nppa和Myh7采用單因素方差分析并進行Tamhane T2檢驗，Nppb采用Bonferroni事后檢驗。I和J，NRVMs感染對照載體腺病毒或表達shSbk2腺病毒后，經PBS或PE刺激24小時，ANP、BNP、MYH7和SBK2蛋白水平的代表性Western blot及定量分析（n=3次獨立實驗）。ANP、BNP、MYH7和SBK2采用單因素方差分析并進行Bonferroni多重比較檢驗。數值以均值±SD表示。

心肌細胞特異性過表達SBK2可減輕小鼠壓力負荷誘導的心肌肥厚

為明確SBK2在體內心肌肥厚過程中的作用，研究人員使用攜帶心肌細胞特異性Sbk2的AAV9載體，在小鼠心肌細胞中過表達SBK2。GFP免疫熒光顯示，報告基因主要表達于心肌細胞，支持該策略具有心肌細胞靶向轉導特征。

在Sham條件下，AAV9-Sbk2顯著提高心臟組織SBK2表達；在TAC手術后，AAV9-Sbk2可將被TAC降低的SBK2表達恢復至接近正常Sham基線水平。在無病理刺激條件下，AAV9-Sbk2不影響心重、肺重及其與體重或脛骨長度的比值。但TAC 12周后，與AAV9-vector對照相比，AAV9-Sbk2處理小鼠心重、心重/體重、心重/脛骨長度、肺重/體重和肺重/脛骨長度均顯著降低，提示SBK2過表達可改善TAC誘導的心肌肥厚和肺水腫。

超聲心動圖顯示，在無病理刺激時AAV9-Sbk2不影響心臟結構和功能；但在TAC小鼠中，AAV9-Sbk2顯著降低左室舒張末內徑、收縮末內徑、舒張末容積和收縮末容積，提示肥厚性心室重構減輕。相應地，左室射血分數和短軸縮短率升高，說明心臟收縮功能改善。

組織病理學分析顯示，AAV9-Sbk2不影響生理狀態下心肌細胞橫截面積或纖維化，但在TAC后可顯著減小WGA染色顯示的心肌細胞面積，并減少間質和血管周圍纖維化。纖維化標志物Col1a1、Col3a1、Ccn2和Tgfβ1在mRNA和蛋白水平上均下降。SBK2過表達還減輕病理性基因重編程，降低應激標志物Nppa、Nppb和胎兒型Myh7，同時增加成人型Myh6和Tnni3，使Myh7/Myh6和Tnni1/Tnni3比值下降。總體而言，心肌細胞特異性過表達Sbk2可減輕壓力負荷誘導的心肌肥厚，改善心室功能，并抑制適應不良性重構和纖維化反應。

圖3：SBK2（Src homology 3 domain-binding kinase 2）過表達可減輕橫主動脈縮窄（TAC）誘導的小鼠心功能障礙。A，實驗設計示意圖。注射腺相關病毒（AAV）后3周驗證表達，隨后進行TAC或Sham手術；術后12周進行超聲心動圖檢測和組織采集。B，AAV-GFP（綠色熒光蛋白）和AAV-Sbk2組在Sham或TAC術后12周的SBK2蛋白表達水平。數據采用單因素方差分析并進行Tamhane T2多重比較檢驗（每組n=6）。C—H，AAV-GFP和AAV-Sbk2小鼠在Sham或TAC術后12周的心重（HW）、HW/脛骨長度（TL）、HW/體重（BW）、肺重（LW）、LW/TL和LW/BW統計分析（每組n=8）。HW/BW采用單因素方差分析并進行Bonferroni事后檢驗；HW、HW/TL、LW/TL和LW/BW采用單因素方差分析并進行Tamhane T2檢驗；LW采用非參數檢驗并進行Bonferroni校正。I，AAV-GFP和AAV-Sbk2小鼠在Sham或TAC術后12周左心室M型超聲心動圖代表性圖像。水平和垂直比例尺分別代表100 ms和1 mm。J—L，AAV-GFP和AAV-Sbk2小鼠在Sham或TAC術后12周的超聲心動圖參數定量分析（每組n=8），包括左室收縮末內徑（LVIDs）、左室舒張末內徑（LVIDd）、左室收縮末容積（LVESV）、左室舒張末容積（LVEDV）、左室射血分數（LVEF）和短軸縮短率（LVFS）。LVIDs和LVEF采用單因素方差分析并進行Bonferroni事后檢驗；LVIDd、LVESV、LVEDV和LVFS采用單因素方差分析并進行Tamhane T2檢驗。M，Sham或TAC術后12周心室橫切面組織學代表性圖像，包括蘇木精-伊紅（H&E）染色、麥胚凝集素（WGA）染色、血管周圍/間質Picro-Sirius Red（PSR）染色。比例尺：H&E為50 μm；WGA為20 μm；PSR為50 μm。N，心室切片中心肌細胞橫截面積定量分析（每組n=6），統計分析采用單因素方差分析并進行Bonferroni事后檢驗。O，心室切片中間質和血管周圍纖維化定量分析（每組n=6），統計分析采用單因素方差分析并進行Tamhane T2檢驗。P，TAC術后12周心室組織中纖維化標志物Col1a1（膠原I型α1鏈）、Col3a1（膠原III型α1鏈）、Ccn2（細胞通信網絡因子2）和Tgfβ1（轉化生長因子β1）mRNA相對表達水平（每組n=6），數據采用非配對雙尾Student t檢驗。Q，TAC術后12周心室組織中纖維化標志物COL1A1、COL3A1、CTGF（結締組織生長因子）和TGFβ1蛋白表達水平（每組n=6），兩組差異采用非配對雙尾Student t檢驗分析。R，TAC術后12周心室組織中心臟重構標志物Nppa、Nppb、Myh7、Myh6（肌球蛋白重鏈6）、Tnni1（肌鈣蛋白I1）和Tnni3（肌鈣蛋白I3）mRNA相對表達水平（每組n=6），數據采用非配對雙尾Student t檢驗分析。S，TAC術后12周心室組織中心臟重構標志物ANP、BNP、MYH7、MYH6、TNNI1和TNNI3蛋白表達水平（每組n=6），兩組差異采用非配對雙尾Student t檢驗分析。數據以均值±SD表示。對于圖3F中非正態分布數據，數值以中位數和四分位距（IQR）表示。

心肌細胞特異性敲除SBK2會加重小鼠心肌肥厚

為進一步確認SBK2在病理性心肌肥厚中的保護作用，研究人員構建心肌細胞特異性Sbk2敲除（Sbk2-CKO）小鼠，并與對照同窩小鼠一起接受TAC手術。Sham條件下，Sbk2-CKO小鼠心臟SBK2表達顯著低于對照組，說明基因刪除成功。TAC手術本身會降低對照小鼠SBK2表達，而Sbk2-CKO背景進一步加劇這一下降，使SBK2水平顯著耗竭。

TAC后，Sbk2-CKO小鼠出現更嚴重的心肌肥厚，表現為心重、心重/體重、心重/脛骨長度和肺重/體重升高。超聲心動圖顯示，Sbk2-CKO小鼠心室擴張和收縮功能障礙加重，包括舒張末容積、收縮末內徑和左室收縮末容積升高，同時左室射血分數和短軸縮短率降低。

組織學結果顯示，Sbk2-CKO心臟中TAC誘導的心肌細胞肥大更明顯，間質和血管周圍纖維化更廣泛。與此一致，SBK2缺失強化病理性基因重編程，肥厚標志物Nppa、Nppb、Myh7和Tnni1升高，成人型Myh6和Tnni3下降，Myh7/Myh6和Tnni1/Tnni3比值相應升高。纖維化相關基因Col1a1、Col3a1、Ccn2和Tgfβ1進一步上調，提示纖維化重構加重。上述結果說明，心肌細胞特異性SBK2缺失可加速壓力負荷誘導的心肌肥厚、心功能障礙和纖維化重構。

圖4：心肌細胞特異性刪除SBK2（Src homology 3 domain-binding kinase 2）加重橫主動脈縮窄（TAC）誘導的小鼠心功能障礙。A，實驗方案示意圖：AAV注射后3周驗證表達，隨后進行TAC手術；術后12周進行超聲心動圖檢測并收集心臟組織。sgRNA在U6啟動子驅動下廣泛表達，而由于Rosa26-LSL-Cas9小鼠中心肌細胞依賴Cre表達Cas9，基因組編輯被限制在心肌細胞中。B，Control和Sbk2-CKO組在Sham或TAC術后12周的SBK2蛋白表達水平。數據采用單因素方差分析并進行Tamhane T2多重比較檢驗（每組n=6只小鼠）。C—F，Control和Sbk2-CKO小鼠TAC術后12周的心重（HW）、HW/脛骨長度（TL）、HW/體重（BW）和肺重（LW）/BW統計分析（n=8）。HW和HW/TL采用方差分析并進行Bonferroni校正，HW/BW、LW/BW、LW和LW/TL采用Tamhane T2檢驗。G，Control和Sbk2-CKO小鼠TAC術后12周左心室運動的M型超聲心動圖代表性圖像。水平和垂直比例尺分別代表100 ms和1 mm。H—J，Control和Sbk2-CKO小鼠TAC術后12周左室收縮末內徑（LVIDs）、左室舒張末內徑（LVIDd）、左室收縮末容積（LVESV）、左室舒張末容積（LVEDV）、左室射血分數（LVEF）和左室短軸縮短率（LVFS）的定量分析（每組n=8）。LVIDs、LVIDd和LVEDV采用單因素方差分析并進行Bonferroni事后檢驗，LVESV、LVEF和LVFS采用單因素方差分析并進行Tamhane T2檢驗。K，Control和Sbk2-CKO小鼠TAC術后12周心室組織橫切面代表性圖像，包括H&E染色、WGA染色、血管周圍PSR染色和間質PSR染色。比例尺：H&E=2 mm，WGA=20 μm，PSR=50 μm。L，Control和Sbk2-CKO小鼠TAC術后12周心肌細胞橫截面積定量分析（n=6，方差分析并進行Bonferroni校正）。M，Control和Sbk2-CKO小鼠TAC術后12周間質及血管周圍纖維化百分比定量分析（n=6，方差分析并進行Tamhane T2校正）。N，Control和Sbk2-CKO小鼠TAC術后12周左心室中心臟重構標志物Nppa、Nppb、Myh7、Myh6、Tnni1和Tnni3的mRNA表達定量（n=6，雙尾t檢驗）。O，Control和Sbk2-CKO小鼠TAC術后12周左心室中纖維化標志物Col1a1、Col3a1、Ccn2和Tgfβ1的mRNA表達定量（n=6，雙尾t檢驗）。P，TAC術后12周心室組織中心臟重構標志物ANP、BNP、MYH7、MYH6、TNNI1和TNNI3的代表性Western blot及定量分析（每組n=6），兩組差異采用非配對雙尾Student t檢驗分析。Q，TAC術后12周心室組織中纖維化標志物COL1A1、COL3A1、CTGF和TGFβ1的代表性Western blot及定量分析（每組n=6），兩組差異采用非配對雙尾Student t檢驗分析。數值以均值±SD表示。

質譜鑒定NDUFV1是SBK2的直接下游靶標

鑒于SBK2是一種激酶，研究人員推測其保護作用可能通過結合并磷酸化下游底物實現。因此，研究在Ad-Sbk2感染的NRVMs中進行共免疫沉淀，并開展質譜分析。基于Metascape數據庫對所得蛋白進行相互作用通路分析，發現有氧呼吸和呼吸電子傳遞是最顯著富集的通路。

在與這一通路相關的14個潛在分子中，MATR3、NDUFV2、NDUFB10和DLAT由于未能通過共免疫沉淀驗證相互作用而被排除。隨后，GST pull-down實驗確認SBK2與NDUFV1和SLC25A12存在直接相互作用。其他候選蛋白，如CTNNB1、PARP1、NDUFB9、NDUFA10、NDUFA9、SLC25A11、CS和NDUFS3，由于GST pull-down實驗未顯示直接結合而被排除。

鑒于NDUFV1突變此前已與心功能障礙相關，研究人員將NDUFV1作為后續研究重點。免疫熒光顯示，293T細胞中NDUFV1與SBK2存在共定位。NRVMs中的共免疫沉淀進一步證實，FLAG-SBK2過表達后可與內源性NDUFV1結合。為確定互作結構基礎，研究構建了一系列缺失線粒體靶向序列、FMN結合結構域、可溶性配體結合結構域或鐵硫結合結構域的NDUFV1截短突變體。結果顯示，SBK2優先結合NDUFV1的FMN結合結構域。這些結果說明，SBK2可直接與NDUFV1相互作用，NDUFV1可能介導SBK2在心肌肥厚中的保護作用。

圖5：NDUFV1（NADH: ubiquinone oxidoreductase core subunit V1）被鑒定為SBK2（Src homology 3 domain-binding kinase 2）的潛在直接下游靶標。A，免疫沉淀-質譜（IP-MS）流程。新生大鼠心室肌細胞（NRVMs）感染Ad-Sbk2 12小時，隨后接受苯腎上腺素（PE）刺激24小時。進行IgG或Flag免疫沉淀，并通過銀染和后續質譜分析樣本。B，鑒定蛋白的通路富集分析點圖。質譜（MS）數據篩選標準定義為特異性肽段≥3，并且Flag組相較IgG對照組多出≥3個肽段。富集分析采用Metascape數據庫。在點圖中，點的大小代表每條通路中富集基因的數量，x軸表示統計顯著性，即?log（P值）。C，Flag-SBK2與HA-CTNNB1（β-catenin）、MATR3（matrin 3）、PARP1（poly[ADP-ribose] polymerase 1）、NDUFV2、NDUFB10、NDUFB9、NDUFA10、DLAT、NDUFA9、SLC25A11、SLC25A12、CS、NDUFS3和NDUFV1共免疫沉淀（Co-IP）的代表性結果（n=3次獨立實驗）。D—M，GST-HA或GST-HA-SBK2與Flag-NDUFV1、SLC25A12、NDUFA9、NDUFA10、NDUFB9、NDUFS3、SLC25A11、CS、CTNNB1和PARP1進行GST pull-down實驗的代表性結果（n=3次獨立實驗）。N，293T細胞中Flag-SBK2和HA-NDUFV1共定位的代表性共聚焦圖像（n=3次獨立實驗），比例尺=10 μm。O，NRVMs感染Ad-Sbk2 12小時并經PE刺激24小時后，NDUFV1與FLAG-SBK2相互作用的代表性Co-IP結果（n=3次獨立實驗）。P，293T細胞共轉染Flag-SBK2和不同HA-NDUFV1截短突變體后進行Co-IP實驗的代表性結果（n=3次獨立實驗）。GST表示谷胱甘肽S-轉移酶。

SBK2通過Ser251位點磷酸化促進NDUFV1進入線粒體

研究進一步探索SBK2結合如何影響NDUFV1功能。TAC體內模型或NRVMs中PE刺激均不改變NDUFV1總蛋白水平，但PE刺激會減少NDUFV1在線粒體中的定位。SBK2過表達促進NDUFV1在線粒體中積累，而SBK2敲低則減少NDUFV1線粒體積累。

Phos-tag分析顯示，PE刺激后NDUFV1磷酸化水平降低。相應地，在肥厚應激條件下，SBK2過表達增加NDUFV1磷酸化，而SBK2敲低降低NDUFV1磷酸化。體內結果與體外一致：TAC顯著降低野生型小鼠心肌組織中NDUFV1磷酸化；AAV介導的SBK2過表達可在TAC后維持NDUFV1磷酸化；心肌細胞特異性SBK2敲除則進一步加重TAC誘導的NDUFV1磷酸化下降。體外激酶實驗表明，SBK2可直接磷酸化NDUFV1。

為判斷激酶活性是否必要，研究人員構建了激酶失活SBK2突變體D185N。該突變體不能在293T細胞和NRVMs中增強NDUFV1磷酸化，也不能緩解PE誘導的肥厚和肥厚基因表達，說明SBK2的心臟保護功能依賴其激酶活性。

亞細胞分級顯示，SBK2幾乎不定位于線粒體，而主要分布于胞質，提示SBK2主要在胞質中發揮功能。跨物種序列分析在NDUFV1中發現4個保守絲氨酸位點：S21、S31、S34和S251。分別將這些位點突變為丙氨酸后發現，僅S251A突變可消除SBK2誘導的磷酸化，而不影響SBK2-NDUFV1結合。體外實驗同樣顯示，SBK2不能磷酸化S251A突變體，說明Ser251是主要磷酸化位點。

進一步實驗顯示，Ser251磷酸化控制NDUFV1線粒體靶向。SBK2可促進野生型NDUFV1進入線粒體，但不能促進S251A突變體進入線粒體；相反，磷酸化模擬突變體S251D表現出持續的線粒體定位。上述結果說明，Ser251磷酸化調控NDUFV1線粒體轉位。

為了闡明這一導入過程的機制，研究人員檢測NDUFV1與線粒體導入相關組分的相互作用。NDUFV1可與多個胞質分子伴侶和TOM受體相關聯。值得注意的是，SBK2選擇性增強NDUFV1與HSPA1A之間的相互作用，但不改變其與HSPA1B、TOM20或TOM70的結合。HSPA1A過表達可增加NDUFV1向TOM70而非TOM20的募集，支持HSPA1A在其中具有“分子伴侶橋接”作用。重要的是，S251A突變會消除SBK2增強的NDUFV1-HSPA1A相互作用，并阻止HSPA1A依賴的TOM70募集。HSPA1A siRNA敲低也可阻斷SBK2驅動的NDUFV1線粒體積累。

總體而言，這些數據支持一個連續機制：SBK2在Ser251位點磷酸化NDUFV1，增強其被HSPA1A識別，并促使其通過TOM70依賴方式進入線粒體。

圖6：SBK2（Src homology 3 domain-binding kinase 2）促進NDUFV1（NADH: ubiquinone oxidoreductase core subunit V1）磷酸化及其在線粒體中的積累。A，小鼠Sham或橫主動脈縮窄（TAC）手術12周后心臟中NDUFV1蛋白水平的代表性Western blot及定量分析（每組n=6）。兩組差異采用非配對雙尾Student t檢驗分析。B，新生大鼠心室肌細胞（NRVMs）經苯腎上腺素（PE）刺激24小時后NDUFV1蛋白水平的代表性Western blot及定量分析（n=3次獨立實驗）。兩組差異采用非配對雙尾Student t檢驗分析。C，NRVMs經PE或Vehicle刺激24小時后，全細胞裂解物（WCL）、胞質（Cytosol）和線粒體（Mito）組分中NDUFV1蛋白水平的代表性Western blot及定量分析（n=3次獨立實驗）。兩組差異采用非配對雙尾Student t檢驗分析。D，NRVMs感染Ad-GFP或Ad-Sbk2并經PE刺激24小時后，WCL、胞質和線粒體組分中NDUFV1蛋白水平的代表性Western blot及定量分析（n=3次獨立實驗）。兩組差異采用非配對雙尾Student t檢驗分析。E，NRVMs感染Ad-vector或Ad-shSbk2并經PE刺激24小時后，WCL、胞質和線粒體組分中NDUFV1蛋白水平的代表性Western blot及定量分析（n=3次獨立實驗）。兩組差異采用非配對雙尾Student t檢驗分析。F，野生型小鼠Sham和TAC組心肌組織中磷酸化NDUFV1（Phos-NDUFV1）的代表性Phos-tag Western blot及定量分析（每組n=6）。Phos表示在預期分子量位置檢測到的磷酸化NDUFV1。兩組差異采用非配對雙尾Student t檢驗分析。G，AAV-GFP或AAV-Sbk2注射小鼠TAC 12周后心肌組織中NDUFV1磷酸化水平的代表性Western blot及定量分析（每組n=6）。兩組差異采用非配對雙尾Student t檢驗分析。H，Control和Sbk2-CKO小鼠TAC 12周后心肌組織中NDUFV1磷酸化水平的代表性Western blot及定量分析（每組n=6）。兩組差異采用非配對雙尾Student t檢驗分析。I，使用純化GST-HA或GST-HA-SBK2與純化FLAG-NDUFV1孵育進行體外激酶實驗（n=3次獨立實驗）。J，在候選磷酸化位點S21A、S31A、S34A和S251A進行定點突變后，HA-NDUFV1磷酸化水平的代表性Western blot及Co-IP實驗（n=3次獨立實驗）。K，使用純化GST-HA或GST-HA-SBK2與純化Flag-NDUFV1或Flag-NDUFV1S251A進行體外激酶實驗（n=3次獨立實驗）。L，293T細胞中S251位點定點突變（S251A或S251D）后，HA-NDUFV1在WCL、胞質和線粒體中的分布及定量分析（n=3次獨立實驗）。M，Flag-SBK2對HA-NDUFV1與V5-HSPA1A相互作用影響的代表性Co-IP結果（n=3次獨立實驗）。N，HSPA1A對NDUFV1與TOM70相互作用影響的代表性Co-IP結果（n=3次獨立實驗）。O，S251A突變對SBK2增強的NDUFV1-HSPA1A相互作用及HSPA1A依賴性TOM70募集影響的代表性Co-IP結果（n=3次獨立實驗）。P和Q，在NRVMs先感染Ad-GFP或Ad-Sbk2后，再轉染si-NC或si-Hspa1a 24小時，WCL、胞質和線粒體組分中NDUFV1蛋白水平的代表性Western blot及定量分析（n=3次獨立實驗）。WCL數據采用單因素方差分析但未進行事后檢驗；胞質和線粒體數據采用單因素方差分析并進行Bonferroni事后檢驗。數值以均值±SD表示。GST表示谷胱甘肽S-轉移酶；HSPA1A表示heat shock protein family A (Hsp70) member 1A。

SBK2增強線粒體復合物I活性并維持線粒體完整性

研究隨后分析SBK2是否調控線粒體呼吸功能。心臟中過表達SBK2可提高復合物I、II和IV活性，而心肌細胞特異性刪除SBK2則降低這些復合物活性。相比之下，復合物III和V未發生明顯變化。

在PE刺激心肌細胞的應激條件下，Seahorse檢測顯示，SBK2過表達顯著增強基礎呼吸、ATP相關呼吸、最大呼吸和備用呼吸能力；相反，SBK2敲低顯著抑制這些呼吸參數。這說明SBK2可在肥厚應激下提高氧化磷酸化效率。

與此一致，SBK2過表達提高復合物I代表性亞基NDUFB8、復合物II亞基SDHB和復合物IV亞基MTCO2水平，而SBK2敲低降低這些亞基水平；復合物III亞基UQCRC1和復合物V亞基ATP5A1基本不受影響。藍色原位PAGE進一步顯示，SBK2過表達促進呼吸超復合體CI+III2和CI+III2+IVn組裝，結果與酶活性變化一致。

透射電鏡結果顯示，TAC后SBK2過表達可維持線粒體超微結構，表現為線粒體體積增加、圓形度降低，而不影響基線形態；相反，SBK2缺失降低線粒體體積并增加線粒體碎片化。SBK2過表達還調控線粒體動力學相關蛋白，促進融合相關蛋白表達并抑制過度裂變趨勢。功能上，SBK2過表達有助于維持線粒體膜電位，并減少PE誘導的線粒體活性氧升高。綜合來看，SBK2可通過增強復合物I功能、促進呼吸超復合體組裝、支持線粒體融合并降低氧化應激，維持線粒體完整性。

圖7：SBK2（Src homology 3 domain-binding kinase 2）改善線粒體復合物I活性，減輕線粒體碎片化，并維持線粒體功能。A，AAV-GFP（綠色熒光蛋白）、AAV-Sbk2、Control和Sbk2-CKO小鼠TAC術后12周心臟組織中線粒體復合物I—V的酶活性（每組n=6只小鼠）。統計顯著性采用雙尾Student t檢驗確定。B和C，NRVMs感染Ad-GFP或Ad-Sbk2，或感染Ad-vector或Ad-shSbk2，并經苯腎上腺素（PE）刺激24小時后，采用Seahorse線粒體壓力測試分析基礎呼吸、ATP相關呼吸、最大呼吸和備用呼吸能力（n=5次獨立實驗）。兩組差異采用雙尾Student t檢驗分析。D和E，NRVMs感染Ad-GFP或Ad-Sbk2（D），或感染Ad-vector或Ad-shSbk2（E），并經PE刺激24小時后，氧化磷酸化（OXPHOS）復合物I（NDUFB8）、II（SDHB）、III（UQCRC1）、IV（MTCO2）和V（ATP5A1）蛋白的代表性Western blot及定量分析（n=3次獨立實驗）。統計比較采用雙尾Student t檢驗。F和G，NRVMs感染Ad-GFP或Ad-Sbk2（F），或感染Ad-vector或Ad-shSbk2（G），并經PE刺激24小時后，采用藍色原位PAGE（BN-PAGE）分析線粒體復合物I（NDUFB8）水平（n=3次獨立實驗）。統計比較采用雙尾Student t檢驗。H—K，AAV9-GFP、AAV9-Sbk2、Control和Sbk2-CKO小鼠TAC術后12周心臟組織透射電鏡（TEM）代表性圖像，并對線粒體面積和圓形度進行定量分析（每組n=6只小鼠）。比例尺：2 μm（5000×）和1 μm（12000×）。過表達組線粒體面積采用單因素方差分析并進行Tamhane T2事后檢驗；圓形度指數采用單因素方差分析并進行Bonferroni事后檢驗。Sbk2-CKO比較中，線粒體面積和圓形度均采用單因素方差分析并進行Tamhane T2事后檢驗。L，NRVMs感染Ad-GFP或Ad-Sbk2并經PE刺激24小時后，線粒體動力學相關蛋白OPA1（mitochondrial dynamin like GTPase）、MFN2（mitofusin 2）、FIS1（mitochondrial fission 1 protein）和DRP1（dynamin-1-like protein）的代表性Western blot及定量分析（n=3次獨立實驗）。兩組差異采用雙尾Student t檢驗分析。M，NRVMs感染Ad-GFP或Ad-Sbk2后，經PBS或PE刺激24小時，四甲基羅丹明乙酯（TMRE）熒光強度的代表性直方圖及定量分析（n=5次獨立實驗）。平均TMRE熒光強度反映線粒體膜電位（ΔΨm）。數據采用單因素方差分析并進行Bonferroni事后檢驗。N，NRVMs感染Ad-GFP或Ad-Sbk2后，經PBS或PE刺激24小時，MitoSOX染色代表性圖像及線粒體活性氧（ROS）水平定量分析（n=5次獨立實驗）。統計分析采用單因素方差分析并進行Bonferroni事后檢驗（比例尺=10 μm）。數值以均值±SD表示。

SBK2的保護作用依賴NDUFV1及其Ser251磷酸化

為了判斷SBK2抗心肌肥厚作用是否依賴復合物I，研究人員在PE刺激下使用復合物I抑制劑魚藤酮處理NRVMs。復合物I抑制可消除SBK2過表達的保護作用，Ad-Sbk2+魚藤酮組心肌細胞增大和肥厚標志物表達與魚藤酮處理的對照組相當。這說明完整的復合物I活性是SBK2發揮保護作用所必需的。

隨后，研究人員檢測NDUFV1是否是SBK2功能所必需。siRNA介導的NDUFV1敲低消除了SBK2過表達的保護作用，使心肌細胞面積增大、肥厚基因表達升高，支持SBK2作用依賴NDUFV1。

為評估Ser251磷酸化的重要性，研究構建表達磷酸化缺陷型NDUFV1-S251A和磷酸化模擬型NDUFV1-S251D的腺病毒。在SBK2敲低心肌細胞中，S251A突變體不能挽救肥厚表型；而S251D突變體顯著抑制肥厚反應，并比野生型NDUFV1產生更強保護作用。與此一致，S251A突變體線粒體定位受損，而S251D突變體線粒體定位增強。

功能上，野生型NDUFV1可部分恢復SBK2缺失心肌細胞中的復合物I活性，而NDUFV1-S251A無法恢復這一活性；相反，磷酸化模擬型NDUFV1-S251D使復合物I活性進一步高于野生型水平。BN-PAGE分析也顯示，Ser251磷酸化影響呼吸超復合體組裝：S251A減少超復合體形成，而S251D促進超復合體組裝。

綜合這些結果，研究支持這樣一個模型：SBK2通過在Ser251位點磷酸化NDUFV1，促進其線粒體導入，增強復合物I功能并促進呼吸超復合體組裝，從而抑制病理性心肌肥厚。

圖8：SBK2（Src homology 3 domain-binding kinase 2）的功能作用依賴NDUFV1（NADH: ubiquinone oxidoreductase core subunit V1）及其磷酸化。A，NRVMs感染Ad-GFP（綠色熒光蛋白）或Ad-Sbk2，預先用DMSO或魚藤酮處理，并經苯腎上腺素（PE）刺激24小時后，α-actinin免疫熒光代表性圖像及心肌細胞橫截面積定量分析（n=5次獨立實驗）。統計分析采用單因素方差分析并進行Bonferroni事后檢驗（比例尺=20 μm）。B，NRVMs按照A所述處理后，Nppa、Nppb和Myh7 mRNA相對表達水平（n=5次獨立實驗）。統計分析采用單因素方差分析并進行Bonferroni事后檢驗。C，NRVMs按照A所述處理后，ANP、BNP和MYH7蛋白水平的代表性Western blot及定量分析（n=3次獨立實驗）。統計分析采用單因素方差分析并進行Bonferroni多重比較檢驗。D，NRVMs轉染si-NC或si-Ndufv1 24小時后，NDUFV1蛋白水平的代表性Western blot及定量分析（n=3次獨立實驗）。兩組差異采用非配對雙尾Student t檢驗分析。E，NRVMs感染Ad-GFP或Ad-Sbk2、轉染si-NC或si-Ndufv1，并經PE刺激24小時后，α-actinin免疫熒光代表性圖像及心肌細胞橫截面積定量分析（n=5次獨立實驗）。統計分析采用單因素方差分析并進行Tamhane T2檢驗（比例尺=20 μm）。F，NRVMs按照E所述處理后，Nppa、Nppb和Myh7 mRNA相對表達水平（n=5次獨立實驗）。Nppa和Nppb采用單因素方差分析并進行Tamhane T2檢驗，Myh7采用Bonferroni事后檢驗。G，NRVMs按照E所述處理后，ANP、BNP和MYH7蛋白水平的代表性Western blot及定量分析（n=3次獨立實驗）。統計分析采用單因素方差分析并進行Bonferroni多重比較檢驗。H，NRVMs過表達Ndufv1、Ndufv1S251A或Ndufv1S251D 24小時后，Flag-NDUFV1磷酸化水平的代表性Phos-tag Western blot及定量分析（n=3次獨立實驗）。Phos表示在預期分子量位置檢測到的磷酸化NDUFV1。統計分析采用單因素方差分析并進行Bonferroni事后檢驗。I，NRVMs感染Ad-shSbk2，并隨后感染Ad-GFP、Ad-Ndufv1、Ad-Ndufv1S251A或Ad-Ndufv1S251D，再經PE刺激24小時后，actinin免疫熒光代表性圖像及心肌細胞橫截面積定量（n=5次獨立實驗）。統計分析采用單因素方差分析并進行Bonferroni事后檢驗。比例尺=20 μm。J，NRVMs按照I所述處理后，Nppa、Nppb和Myh7 mRNA相對表達水平（n=5次獨立實驗）。統計分析采用單因素方差分析并進行Tamhane T2檢驗。K，NRVMs按照I所述處理后，ANP、BNP和MYH7蛋白水平的代表性Western blot及定量分析（n=3次獨立實驗）。L，NRVMs按照I所述處理后，胞質和線粒體組分中NDUFV1蛋白水平的代表性Western blot及定量分析（n=3次獨立實驗）。胞質組分采用單因素方差分析并進行Bonferroni事后檢驗，線粒體組分采用單因素方差分析并進行Tamhane T2事后檢驗。M，NRVMs按照I所述處理后，線粒體復合物I酶活性定量分析（n=5次獨立實驗）。統計分析采用單因素方差分析并進行Bonferroni事后檢驗。數值以均值±SD表示。

【貢獻】★★★★★

本研究明確了SBK2是線粒體復合物I功能的重要調節因子，并將“激酶控制的線粒體蛋白穩態”定位為心臟重構中的關鍵調節軸。SBK2可在Ser251位點磷酸化NDUFV1，促進其被HSPA1A識別，并通過TOM70依賴機制進入線粒體。NDUFV1進入線粒體后，有助于維持復合物I完整性、呼吸超復合體組裝和線粒體生物能量功能，從而限制病理性心肌肥厚和心功能惡化。

研究還提示，壓力負荷等心臟應激條件下SBK2表達降低，會削弱這一保護性信號軸，造成NDUFV1線粒體導入不足、復合物I功能下降、氧化磷酸化受損、線粒體碎片化和氧化應激升高，最終加重心肌肥厚和心力衰竭相關表型。

從轉化角度看，維持SBK2活性，或模擬其對NDUFV1 Ser251位點的磷酸化效應，可能成為改善心力衰竭中線粒體功能障礙的新方向。不過，研究也存在局限：實驗主要使用雄性小鼠，尚需評估性別差異；AAV過表達策略主要屬于預防性干預，尚未證明其對已建立疾病的治療效果；SBK2敲低后仍存在一定殘余NDUFV1磷酸化，提示可能還有其他激酶參與調控；此外，內源性NDUFV1 Ser251磷酸化的體內直接驗證以及HSPA1A/TOM70依賴導入模型的動態過程，仍有待進一步研究。總體而言，該研究揭示了一條新的“胞質激酶信號-線粒體蛋白導入-復合物I穩態”通路，為未來緩解心力衰竭中的線粒體功能障礙提供了新的機制基礎和潛在干預方向。

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