ADC中酶促偶聯技術的研究進展

引言

抗體藥物偶聯物（ADC）構成了一類靶向治療藥物，它們利用單克隆抗體的特異性和細胞毒性藥物的高效力，在有限的全身副作用下選擇性地消除癌細胞。靶向細胞毒性的概念基礎最初由Paul Ehrlich在1913年作為“魔法子彈”理論提出。隨著抗體發現、蛋白質工程、連接子化學和有效載荷設計方面數十年的進展，最終2000年首個ADC藥物吉妥珠單抗奧唑米星（Mylotarg）獲批用于CD33陽性急性髓系白血病，隨后又有16款獲批的ADC和數百種候選藥物在多種腫瘤適應癥中注冊進行臨床試驗。

通過ADC拓寬小分子藥物治療窗口的目標，包括降低最小有效劑量和提高最大耐受劑量，已得到動物數據的強力支持。然而，由于非特異性藥物偶聯，ADC異質性是阻礙從臨床前研究成功臨床轉化的關鍵因素之一。ADC中區域異構體和藥物抗體比的廣泛變異可導致不同的藥代動力學、降低的治療指數和不可預測的毒性特征。因此，具有確定DAR和藥物附著位點的ADC越來越被認為能提供更優的治療結局。

定點偶聯策略包括化學方法、親和肽導向的Fc修飾和酶促生產，每種方法都有其獨特的優勢和局限性。使用生物正交反應和工程化氨基酸殘基的化學策略提供了多功能性和可擴展性，但可能需要大量優化以平衡化學反應性與抗體完整性。引入突變、非天然氨基酸和重建的二硫鍵也帶來抗體支架穩定性、親和力、特異性、免疫原性和生物相容性改變的風險。親和肽導向的Fc修飾利用具有Fc結合選擇性的短肽來引導在特定位點的化學偶聯。類似地，親和配體可以引導有效載荷與抗體形成非共價相互作用以產生均質性ADC。這種基于親和力的方法提高了選擇性，減少了偶聯位點異質性，且無需抗體的基因工程，同時保持相對簡單的反應條件。然而，親和肽/配體的使用面臨結合結構域的要求、偶聯有效載荷數量和位置限制以及有效載荷附著時潛在結合親和力降低的問題。相比之下，酶促方法利用蛋白質催化劑的內在選擇性，在溫和條件下實現精確修飾，并具有已證實的基因可編碼性、催化周轉性、正交性、模塊化和生物相容性。

酶介導的偶聯已成為一種強大的策略，用于生成具有確定DAR以及增強的藥代動力學、安全性和有效性特征（與傳統化學方法相比）的定點ADC。從機制上講，這些偶聯工具分為兩種主要作用模式：與藥物分子形成共價鍵的自標記標簽，以及識別肽基序以安裝有效載荷的催化機器。開發平臺也可根據酶來源（細菌、古菌、真菌、植物和哺乳動物）進行分類，反映了為實現受控、選擇性和生物相容性偶聯而利用的廣泛催化反應。

一、細菌酶

微生物轉谷氨酰胺酶是一種不依賴鈣離子的?；D移酶，可在谷氨酰胺殘基與伯胺之間形成異肽鍵。作為一種小型單結構域酶，MTGase比哺乳動物轉谷氨酰胺酶更易于生產和體外應用。用于生成ADC的最常見MTGase來源于Streptomyces mobaraensis。MTGase中的活性位點半胱氨酸可攻擊去糖基化IgG上的Gln295，形成硫酯中間體，然后與攜帶有效載荷-連接子的親核胺反應。所得均質性ADC的DAR為2。通過基因工程，該系統可從完全糖基化的抗體、抗原結合片段、單鏈可變片段以及重鏈可變結構域生產ADC。然而，MTGase可交聯內源性谷氨酰胺和賴氨酸殘基，產生高分子量物質，使ADC生產復雜化。通過完全去除C末端賴氨酸（一個主要的交聯位點），可顯著降低最終產品中高分子量變體的水平。該平臺也可用于兩步化學酶促過程，其中MTGase首先催化性地向抗體添加一個間隔基，然后通過點擊化學安裝連接子-有效載荷。MTGase被FDA認定為一般認為安全的物質，并因其在廣泛溫度和pH范圍內工作而廣泛應用于食品工業。3期ADC候選藥物DP303利用MTGase介導的含胺MMAE與靶向人表皮生長因子受體2的單克隆抗體Gln295位點的偶聯，并展現出高穩定性、良好的藥代動力學和強效性。

內切糖苷酶如來自Streptococcus pyogenes的Endo-S和Endo-S2是水解酶，可切割宿主IgG抗體上殼二糖核心兩個N-乙酰葡糖胺殘基之間的Fc N-聚糖，作為逃避免疫清除的機制。為了促進藥物偶聯，ENGase被工程化，可高效去除天然N-聚糖并將帶有功能化標簽的合成聚糖轉移到抗體的暴露GlcNAc殘基上，且不水解所得轉糖基化產物。內切糖苷酶與糖基轉移酶在Synaffix的GlycoConnect技術中相結合，以生產IBI343（一種攜帶依沙替康的抗Claudin抗體，DAR=4）。該藥物在多項1期臨床試驗中顯示出有前景的活性，并正在推進至胃癌的3期研究。

甲酰甘氨酸生成酶識別一個包含半胱氨酸的短肽基序，并將其氧化為甲酰甘氨酸——一種在所有生命領域中保守的翻譯后修飾。來自Mycobacterium tuberculosis和Streptomyces coelicolor的細菌FGE已被充分研究，并已成為抗體偶聯中的重要工具。對于融合了CXPXR序列的抗體，FGE會生成一個具有獨特醛基官能團的甲酰甘氨酸殘基，用于有效載荷的定點化學附著。幾種生物偶聯化學方法，包括肼基-異-Pictet-Spengler偶聯和Knoevenagel連接，已被優化用于將含肼和吡唑啉酮的細胞毒性藥物附著到這些醛位點上，分別產生確定的藥物與醛標簽比為1:1和2:1的偶聯物。使用這種方法，已生成了靶向表皮生長因子受體和CD22的ADC。TRPH-222是一種通過FGE策略將美登素偶聯到CD22靶向抗體上的ADC，在B細胞淋巴瘤的1期臨床研究中顯示出令人鼓舞的結果。

Sortase A是一種屬于半胱氨酸蛋白酶家族的半胱氨酸轉肽酶，主要存在于革蘭氏陽性菌（如Staphylococcus aureus）的膜中。它催化工程化的帶有五肽識別基序LPXTG的抗體與攜帶N端寡甘氨酸基序的藥物連接子之間的轉肽反應，產生均質性ADC。在SrtA催化過程中，其Cys184殘基與LPXTG基序之間形成硫酰基-酶中間體，隨后由(Gly)n-有效載荷底物的氨基進行親核攻擊，完成藥物偶聯并釋放SrtA。通過SrtA介導偶聯生產的靶向受體酪氨酸激酶樣孤兒受體1的ADC NBE-002已進入臨床試驗。

磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶是細菌脂肪酸和非核糖體肽合成中激活酰基-和肽基-載體蛋白所必需的酶，它通過將4'-磷酸泛酰巰基乙胺基團從輔酶A轉移到ACP和PCP結構域的保守絲氨酸殘基上來發揮作用。為了利用PPTases進行生物偶聯，Walsh等人開發了可被PPTases識別的11和12個殘基的短肽標簽，避免了融合80-100個殘基的大型ACP和PCP結構域的需求。在PPTases中，來自Bacillus subtilis的Sfp和來自Escherichia coli的AcpS是生物工程應用中研究最廣泛的。Sfp在識別短肽標簽和偶聯多種CoA衍生物方面表現出卓越的效率。Grünewald等人將相同的11和12聚體標簽插入曲妥珠單抗的不同環區，用于Sfp催化的澳瑞他汀偶聯。所生產的95種均質性ADC幾乎都對HER2陽性細胞系顯示出亞納摩爾效價，而那些在重鏈恒定區1攜帶有效載荷的ADC則顯示出良好的藥代動力學特征。

脂酸連接酶A來自E. coli，是一種ATP依賴性連接酶，可催化脂酸的脫酰化，然后將其轉移到其天然蛋白底物的賴氨酸殘基上。在生物偶聯背景下，已開發出一個13個殘基的脂酸接受肽用于基因融合到抗體中，并被LplA識別，在賴氨酸側鏈與脂酸羧基之間生成酰胺鍵。已創建了LplA變體以改善連接活性和對脂酸衍生物的底物混雜性。通過LplA在LAP標簽上安裝修飾的脂酸后，可通過生物正交反應附著細胞毒性有效載荷。有趣的是，最近的研究確定IgG1中的Lys188適合由LplA進行優先修飾，而無需LAP標簽，從而產生了抗HER2和抗CD20的ADC。此外，LplA與MTGase結合使用，可在曲妥珠單抗的不同位點上偶聯兩種不同的熒光有效載荷。

二、古菌、真菌和植物酶

生物素連接酶存在于多種物種中，包括細菌、古菌（Pyrococcus horikoshii）和真菌（Saccharomyces cerevisiae），催化兩步ATP依賴性反應，其中生物素被轉移到生物素受體結構域的特異性賴氨酸殘基上。已開發出可點擊的生物素類似物，用于酵母和古菌生物素連接酶的催化。為了生成定點ADC，將來源于人丙酰輔酶A羧化酶α亞基C端序列的p67標簽基因融合到抗HER2曲妥珠單抗輕鏈或重鏈的C端。在通過P. horikoshii生物素連接酶將脫硫生物素-疊氮化物定點修飾該抗體融合標簽后，通過應變促進的疊氮-炔環加成反應共價附著MMAE細胞毒性有效載荷。盡管具有高特異性和與生物正交化學的兼容性，但該模塊化平臺受限于ATP依賴性、與其他連接酶相比更慢的催化周轉以及需要表達相對較大的p67識別序列。

酪氨酸酶來源于真菌（如Agaricus bisporus）和細菌（如Bacillus megaterium），已作為定點生物偶聯的酶促工具被使用，通過在溫和有氧條件下將酚類氧化為高反應性鄰醌。它們可以將Fc結構域（如Tyr296）上的表面酪氨酸殘基轉化為鄰醌基團，用于隨后與功能化有效載荷的偶聯；或者將酚-藥物衍生物轉化為反應性鄰醌中間體，與抗體上存在的苯胺、脯氨酸和硫醇進行偶聯。Cao等人使用酪氨酸酶將酚標記的MMAE與攜帶工程化半胱氨酸的抗HER2抗體偶聯，合成了DAR為2-4的ADC。雖然酪氨酸酶輔助偶聯允許在溫和條件下進行位點特異性反應，且無需基因摻入非天然氨基酸，但只有表面可接觸或工程化的酪氨酸殘基適用于這種方法。除了潛在的脫靶氧化或副反應外，生成的醌中間體可能導致交聯或不需要的反應性，需要進一步研究和優化以用于ADC開發。

肽天冬酰胺連接酶是天冬酰胺內肽酶家族的植物成員。來自Clitoria ternatea的Butelase-1和來自Viola yedoensis的VyPAL2已被廣泛研究用于蛋白質工程。PAL催化的反應涉及識別三肽基序、切割Asn殘基后的肽鍵、形成硫?；?酶中間體，以及與另一肽段的N端連接，高效且最小水解地產生新肽鍵。它們在生物偶聯中的關鍵優勢包括快速反應動力學、短識別序列，以及幾乎無痕的修飾（連接后目標蛋白上只留下一個Asn殘基）。PAL已用于工程化具有雙功能的蛋白質和肽。例如，通過Butelase-1和VyPAL2的串聯連接，可以將EGFR靶向的親和體共價標記上熒光標簽和細胞毒性肽。該方法還使親和體環化并隨后進行阿霉素偶聯。來自Singzyme的PAL技術衍生的ADC正處于針對不同癌癥的臨床前開發中。

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三、哺乳動物/人源酶

法尼基轉移酶是在真核生物中發現的異二聚體異戊二烯基轉移酶。目前，特征最明確的FTase來源于哺乳動物和酵母。FTase催化將15碳法尼基異戊二烯從異戊二烯供體法尼基焦磷酸轉移到含有Cys-脂肪族-脂肪族-X基序的蛋白底物上，與CaaX的半胱氨酸殘基形成穩定的硫醚鍵。工程化帶有可接觸CaaX基序的抗體或抗體片段，可在存在疊氮基或炔基功能化法尼基類似物的情況下，通過FTase安裝可點擊手柄，隨后通過點擊化學與細胞毒性有效載荷偶聯。FS-1502是一種由FTase平臺開發的攜帶單甲基澳瑞他汀F的抗HER2 ADC，在HER2陽性癌癥患者的1a/1b期試驗中顯示出有前景的抗腫瘤活性和低毒性，并已進入3期臨床研究?；贔Tase的ADC方法具有高特異性偶聯、穩定的硫醚鍵、生物相容性條件以及對抗體結構影響最小的特點。

哺乳動物糖基轉移酶，特別是β-1,4-半乳糖基轉移酶和唾液酸轉移酶，允許將反應性糖類（如疊氮基或酮基修飾的單糖）摻入Asn297處保守的Fc N-聚糖中，提供生物正交手柄而不改變抗體骨架。幾項臨床前研究證明了通過GalT介導的聚糖重塑高效添加疊氮基或炔基基團，用于附著細胞毒性有效載荷和熒光團。這種糖工程策略產生了可選擇性殺傷癌細胞的抗CD22-阿霉素和抗HER2-MMAE的定點偶聯物。通過將工程化內切糖苷酶與天然糖基轉移酶結合，GlycoConnect技術促進將6-疊氮基-N-乙酰半乳糖胺轉移到Fc聚糖上，通過無金屬環加成反應實現有效載荷偶聯，產生與傳統偶聯方法相比具有改善安全性和藥代動力學的穩定定點ADC。由GlycoConnect平臺開發的ADC目前正處于1期和3期研究。雖然這種偶聯策略通過空間上遠距離、高度保守且化學性質獨特的聚糖位點，對抗原結合幾乎沒有影響，但在30-37°C下延長孵育以及對Fc聚糖的修飾可能會影響藥代動力學特征和與Fc受體的相互作用，需要在ADC開發過程中進行進一步評估。

微管蛋白酪氨酸連接酶是一種翻譯后ATP依賴性酶，在所有哺乳動物中廣泛保守。它催化將酪氨酸添加到α-微管蛋白的C端，生成酪氨酸化微管蛋白，對調節微管穩態至關重要。通過使用TTL，酪氨酸衍生物成功通過融合在C端的Tub-tag（模擬α-微管蛋白的TTL識別序列）附著到抗GFP納米抗體上。基于此酶促平臺，TTL已被應用于開發針對造血系統惡性腫瘤的CD30特異性ADC。TUB-010是一種攜帶MMAE有效載荷的抗CD30 ADC，在CD30陽性淋巴瘤的嚙齒動物和非人靈長類動物模型中，以等效MMAE劑量給藥時，與Adcetris相比展現出更優的腫瘤控制，同時改善了耐受性。

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四、高度工程化的酶

SNAP-tag是人O6-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉移酶的修飾版本，可催化性地將烷基從DNA的O6鳥嘌呤轉移到活性位點的Cys145，以修復DNA損傷。通過噬菌體展示輔助篩選，鑒定出AGT變體，其尺寸減小、對O6-芐基鳥嘌呤類似物的活性增強，并與內源性DNA的相互作用最小化。通過將SNAP-tag融合到抗體片段上，芐基鳥嘌呤衍生的細胞毒性藥物可以1:1的化學計量比共價附著。SNAP標記的抗EGFR和HER2 scFv與澳瑞他汀F有效載荷偶聯后，在納摩爾水平顯示出對乳腺癌細胞系的強效活性?；赟NAP-tag的偶聯迄今已應用于scFv抗體，而非全長IgG。它提供了偶聯后無需去除酶的實際優點。相關的自標記系統HaloTag，融合了工程化的細菌鹵代烷脫鹵酶，以類似的不逆方式運作，但尚未用于生成ADC。

SpyLigase是一種源自S. pyogenes的CnaB2結構域的工程化酶，被分成SpyTag、KTag和SpyLigase片段。SpyTag中的天冬氨酸殘基和KTag中的賴氨酸殘基的側鏈可在SpyLigase催化下，在溫和水性條件下形成穩定的異肽鍵。使用攜帶C端融合SpyTag的抗EGFR抗體和MMAE-KTag肽，大腸桿菌表達的SpyLigase合成了一種均質性ADC，偶聯效率約80%，DAR約1.7，并對EGFR陽性癌細胞顯示出亞納摩爾細胞毒性。盡管SpyTag和KTag很小，且SpyLigase不整合到最終偶聯物中，但它主要被工程化以有利于穩定組裝而非快速釋放，導致周轉率低，需要相對于底物多摩爾當量的酶。受細菌CnaB2型結構域啟發的類似技術包括SpyCatcher、SnoopLigase和SnoopCatcher，但尚未應用于ADC開發。

內含肽存在于細菌、古菌和真核生物中，通過自剪接或反式剪接，以天然肽鍵連接兩個蛋白質片段。通過將整個內含肽基因融合到抗體上，表達的蛋白質連接策略可以生成硫酯中間體，用于附著合成肽?；谶@種方法，可以以60%的產率生產免疫偶聯物。通過內含肽將MMAF偶聯到抗HER2抗體上，可在小鼠乳腺癌異種移植模型中有效抑制腫瘤生長。雖然基于內含肽的偶聯方法在ADC上留下最小的標簽殘基，但它需要維持還原性環境進行反應，導致重組表達復雜性增加且產率一般。

Trypsiligase來源于大鼠胰蛋白酶II，具有抑制蛋白水解同時增強連接酶/轉肽酶活性的突變。通過識別YRH基序并切割酪氨酸和精氨酸殘基之間的肽鍵，trypsiligase催化形成酰基-酶中間體，隨后將帶有?；w的第二肽連接至暴露的N端或C端。將YRH序列融合到抗HER2 Fab抗體的C端后，可通過trypsiligase合成具有細胞毒性有效載荷的均質性ADC。與其他酶促方法相比，trypsiligase需要較短的識別標簽用于偶聯反應。

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結語

酶催化偶聯技術為改善ADC的精確性和均質性提供了強大的幫助，這反過來又能增強批次控制、簡化產品規格、提高臨床和質量重現性，并促進監管批準。然而，它們的更廣泛臨床轉化仍面臨若干挑戰。一個潛在問題是源自非人源酶編碼的肽標簽或化學連接的免疫原性。此外，帶有識別標簽和/或酶促修飾的抗體結構的改變可能影響分子穩定性、生物活性、生物分布或清除特征。因此，在臨床前開發和臨床轉化過程中必須仔細評估這些因素。

制造和工藝開發需要為酶促偶聯技術考慮額外因素。與傳統偶聯方法相比，基于酶的策略可能引入新材料和工藝步驟，如生物催化劑、輔因子、工程化識別標簽和專門的連接子-有效載荷底物。這些要求可能增加工藝復雜性，并對反應優化和供應鏈管理施加額外限制。可擴展生產進一步要求精確控制酶促反應參數，包括酶濃度、反應時間和純化程序，以確保一致的偶聯效率并最小化產品相關雜質。

除了腫瘤學，酶相關技術可能促進攜帶標記試劑或非細胞毒性有效載荷（如免疫調節劑、抗菌化合物和酶抑制劑）的抗體偶聯物的生成。它可以將抗體相關偶聯物擴展到感染性疾病、炎癥性疾病和代謝性疾病的診斷和治療。此外，酶促策略可應用于非抗體蛋白和雙特異性偶聯物的定點偶聯。

參考資料：

The evolving landscape of enzymatic technologies for precision synthesis of antibody-drug conjugates. Antib Ther. 2026 Apr 29;9(3):259-272.