【PNAS】因勢利導！同志社大學Sakaba團隊揭示血清素增強突觸前鈣電流及遞質釋放的神經機制

撰文：大仲馬

我們大腦中突觸的強度，從來不是一成不變的。它既會隨著自身活動的節奏起舞，也會被神經調質這類化學信使左右。這些調質既能增強突觸傳遞，也能削弱它，在大腦環路的功能運轉中扮演著關鍵角色，也與精神類疾病的病理生理密不可分。

在海兔身上，科學家早已發現，突觸前的神經調質作用，是學習和記憶的重要基石。比如血清素，它通過抑制鉀離子通道，把突觸前動作電位的波形拉寬，從而讓神經遞質釋放得更多。然而，當目光轉向哺乳動物的大腦時，我們對突觸前調質如何實現增強效應，卻始終霧里看花。

圖片來源：Byrne & Kandel, J Neurosci. (1996)

Held氏囊泡是哺乳動物中樞神經系統中一個經典的模型突觸，它的突觸前末梢足夠大，便于膜片鉗直接記錄。但這個突觸只會表現出強烈的突觸前抑制——經由GABA-B受體和代謝型谷氨酸受體介導，而抑制的核心機制，是G蛋白依賴性地壓制了鈣通道。有趣的是，在這個突觸上，至今沒有發現任何一種神經調質能增強遞質釋放。研究者若要人為制造增強，往往只能借助毛喉素來拉高cAMP水平，或使用佛波酯激活蛋白激酶C或Munc13。但這些藥物像一把掃帚，掃過之處，腺苷酸環化酶或二酰甘油下游的所有通路都被無差別激活，結果常常是五花八門的附帶效應。何況，突觸前膜片鉗記錄技術門檻極高，即便是其他突觸，也鮮有人能深入其內部，看清增強效應的精細機制。

圖片來源：J Neurosci. (1998)

海馬的苔蘚纖維突觸，是皮層中少數擁有較大突觸前終末的成員之一，它本身就能表現出顯著的活動依賴性短時程和長時程增強。此外，去甲腎上腺素和血清素這類調質也能增強它的突觸強度，且極可能作用于突觸前。尤其血清素，已被證實能強力增強苔蘚纖維末梢的突觸傳遞。

在海馬中，血清素4型受體恰恰就表達在這些末梢上，并且參與情緒與焦慮的調控。更耐人尋味的是，SSRI類抗抑郁藥能顯著影響血清素誘導的這種增強效應，這讓它的意義不僅停留在基礎生理層面，更伸向了病理與藥理的交界。

圖片來源：J Neurosci. (2008)

不過，文獻中也有矛盾的音符——其他研究報道血清素反而起抑制作用。這種分歧，或許部分源于實驗方式的差異：大多數研究采用多纖維同步刺激來誘發突觸反應，這樣一來，很容易把海馬CA3區中的中間神經元和局部回路牽扯進來，引入了前饋抑制的雜音。這說明，只有把鏡頭拉近到單個突觸的水平，才能濾去網絡的噪音，看清真相。但此前，由于無法直接觸及突觸前末梢，這種增強效應的內在機理始終是一團未解之謎。

圖片來源：Hippocampus (2016)

近日，《PNAS》雜志在線刊登了同志社大學Sakaba課題組的最新重要工作，該研究通過建立突觸前與突觸后同步全細胞鉗記錄方法，有效克服領域內的技術瓶頸。他們發現，血清素主要通過蛋白激酶A（PKA）依賴性途徑，協同調控突觸前P/Q型鈣通道功能及遞質釋放過程，從而實現突觸傳遞效能的增強。

這篇文章作者行文風格非常奇怪，是沒有小標題那種，咱們一點點往后看^_^

5-HT增強CA3錐體細胞興奮性突觸后電流

為探究5-HT對苔蘚纖維-CA3突觸傳遞的影響，作者于圖1–4實驗采用小鼠海馬腦片，于圖5實驗采用大鼠海馬腦片行膜片鉗電生理實驗。他們將CA3錐體細胞置于電壓鉗模式下記錄，鉗制電位分別設定為–60 mV或–70 mV，并通過玻璃微電極對苔蘚纖維進行細胞外刺激，誘發興奮性突觸后電流（EPSCs）。

如圖1所示（A和B為同一細胞代表性記錄，C為匯總數據），他們先記錄約5分鐘的基線反應作為對照，隨后在細胞外人工腦脊液（ACSF）中給予50 μM 5-HT。給藥5分鐘后，EPSC增強至基線水平的186 ± 23%，該增強效應與既往研究結果一致。

在5-HT應用結束后，他們進一步給予DCG-IV以確認所記錄的EPSCs主要來源于苔蘚纖維輸入。其中，未被阻斷的成分很可能由非苔蘚纖維輸入所致。此外，非苔蘚纖維輸入同樣可能受到5-HT的增強作用。

由此，為在單突觸水平進行精確分析，他們認為有必要對單個末梢和單個苔蘚纖維突觸開展直接記錄。

筆者注：DCG-IV是一種選擇性II組代謝型谷氨酸受體激動劑，能夠特異性抑制苔蘚纖維末梢的遞質釋放，因此在本研究中被作者用作藥理學工具——他們在施加5-HT結束后給予DCG-IV，通過觀察EPSC是否被有效阻斷，來確認所記錄的興奮性突觸后電流確實主要來源于苔蘚纖維輸入，從而排除其他纖維的混雜貢獻。

圖1 5-HT增強CA3錐體細胞興奮性突觸后電流

5-HT不影響動作電位波形

盡管已有文獻報道5-HT能夠增強苔蘚纖維誘發的突觸反應，且該作用可能通過突觸前機制介導，但其背后的分子機理尚未被充分闡明。

為深入探究這一機制，作者對苔蘚纖維末梢進行了直接突觸前記錄。他們首先檢測了突觸前動作電位波形，原因在于已知5-HT在海兔中可改變動作電位形態，而動作電位時程的延長可通過增強鈣離子內流顯著增加苔蘚纖維突觸的遞質釋放水平。

在電流鉗模式下，他們向末梢注入電流以誘發動作電位。如圖2A所示，同一末梢在施加5-HT前后的動作電位波形未表現出顯著差異。圖2B匯總了靜息膜電位、動作電位上升時程及下降時程的數據，結果顯示對照組與5-HT處理組之間均無顯著變化。盡管動作電位峰值幅度略有減小，但降幅極小（詳細統計結果見SI附錄表S1）。

圖2 5-HT不影響動作電位波形

5-HT對鈣電流及遞質釋放的影響

為量化突觸前鈣電流及突觸囊泡胞吐，作者對苔蘚纖維末梢進行了突觸前電壓鉗和膜電容測量手段，后者可用于定量胞吐水平。由于去極化期間電導變化較大，無法測量電容，作者采用不同時程脈沖以確定累積釋放的時間進程。

為減少全細胞記錄中的胞吐衰減，圖3中對照組與5-HT組分別在獨立末梢上檢測，記錄在轉移后5-60分鐘內完成。在圖3A中，末梢去極化至+10 mV、持續10 ms，比較鈣電流及膜電容的躍變。施加50 μM 5-HT，鈣電流及膜電容均有增加（圖3B）。在ACSF條件下，電容躍變時間進程遵循指數函數，時間常數為80.8 ± 13.3 ms，最大值為40 fF（相當于400個囊泡）。而在施加5-HT條件下，時間常數顯著快于對照組（26.8 ± 1.7 ms），初始胞吐速率更大，表明囊泡融合能力增強。此外，鈣電流增強及釋放時間常數的加快可被PKA抑制劑H-89（10 μM）或KT5720（2 μM），而0.2% DMSO無顯著影響，提示PKA參與了此過程。

研究表明，cAMP濃度升高可能加強活性區內鈣通道與囊泡的偶聯。為驗證此可能，作者向末梢內注入高濃度EGTA（5 mM，而非0.5 mM）。高濃度EGTA在對照組及5-HT組中均能有效抑制膜電容躍變。他們發現EGTA抑制作用在5-HT存在時有所減弱，提示5-HT可能在一定程度上改變了鈣通道與囊泡的偶聯。

筆者注：高濃度EGTA在對照組和5-HT組均能有效抑制膜電容躍變（即囊泡釋放），但在5-HT存在時其抑制效果有所減弱。這一結果提示：5-HT可能確實增強了鈣通道與囊泡之間的偶聯關系——可能是通過PKA磷酸化作用，將鈣通道與囊泡在空間上拉得更近，或提高了囊泡鈣傳感器對鈣離子的敏感性，從而使部分鈣信號在EGTA“攔截”之前即已觸發釋放。

圖3 5-HT對鈣電流及遞質釋放的影響

5-HT主要增強苔蘚纖維末梢的P/Q型鈣電流

為詳細分析5-HT對突觸前鈣電流的影響，作者在后續實驗中將細胞外液中的2 mM Ca2?更換為2 mM Ba2?，以盡量減少鈣依賴性失活導致的鈣電流衰減（但Ca2?與Ba2?的門控動力學可能存在差異）。

圖4中，作者給予從-80 mV至+10 mV、時程5 ms的脈沖（圖4A-B），分別在對照和5-HT條件下測定Ba2?電流的電流-電壓關系（N=7）。圖4C匯總了峰值幅度的電流-電壓關系。圖4D顯示歸一化尾電流對指令電壓的作圖，他們對每個末梢的數據分別進行Boltzmann函數擬合。半數最大電壓在對照與5-HT條件之間存在差異（13.8 ± 0.8 mV vs. 9.4 ± 0.9 mV，P=0.018），但差異較小（約5 mV）。最大尾電流幅值在兩種條件下無顯著變化（P=0.866）。

隨后，作者探究了5-HT增強的鈣電流亞型。第一組實驗中，作者在對照和5-HT條件下均給予P/Q型鈣通道特異性阻斷劑ω-蜘蛛毒素IVA。結果顯示，殘留電流分數在對照和5-HT條件下相近（分別為35 ± 6%和36 ± 5%，N=6，P=0.875），提示5-HT主要增強P/Q型電流。

第二組實驗中，作者先施加ω-蜘蛛毒素IVA阻斷P/Q型電流，殘留電流為對照的24 ± 4%，與第一組結果相近。表明5-HT對P/Q型電流具有增強作用。由于ω-蜘蛛毒素IVA不易洗脫，P/Q型通道在洗脫毒素后仍處于抑制狀態，此條件下后續施加5-HT未能使殘留內向電流產生增強（圖4G），進一步證實5-HT主要增強P/Q型鈣電流。

那么，鈣電流的增強是否強化了突觸呢？

筆者注：P/Q型鈣通道是由Cav2.1亞基構成的高電壓門控鈣通道，主要定位于突觸前末梢，是觸發神經遞質釋放的核心鈣通道之一。在本研究中，作者通過使用P/Q型通道特異性阻斷劑ω-蜘蛛毒素IVA，證實5-HT的增強效應主要作用于P/Q型鈣電流而非其他鈣通道亞型，且該增強依賴于PKA信號通路，通過增強鈣內流來促進囊泡釋放，從而揭示了5-HT調控突觸傳遞的重要分子機制。

圖4 5-HT主要增強苔蘚纖維末梢的P/Q型鈣電流

苔蘚纖維末梢與CA3錐體細胞的同時記錄

最后，為評估突觸前鈣電流增強對突觸增強的貢獻，作者對苔蘚纖維突觸進行了突觸前和突觸后的同步記錄（圖5）。由于小鼠同步記錄在技術上具有較大挑戰性，該組實驗改用大鼠海馬腦片。

5-HT施加條件下，去極化期間內，突觸囊泡胞吐的初始相有所增加（圖3C）。為以更高分辨率觀察這一時程范圍，作者將苔蘚纖維末梢從-80 mV去極化至+10 mV、持續短暫時間（2至10 ms），同時將突觸后CA3錐體細胞鉗制于-60 mV。

他們發現，施加50 μM 5-HT同時增強了突觸前鈣電流和EPSC（圖5A）。由于單次實驗中難以立即達到精確的目標值，作者在對照和5-HT條件下分別施加了若干不同幅值或時程的電壓步階，并選取與對照值相近的數據進行離線分析（見SI附錄圖S3）。此外，作者還納入了5-HT應用過程中鈣電流幅度未發生變化而EPSC仍被增強的數據（N=2）。當鈣電流減小時，EPSC幅度隨之降低，但此條件下仍可觀察到EPSC的增強效應。

圖5 B和C分別展示了鈣內流（電流積分）和EPSC電荷量。二者均被顯著增強。當5-HT條件下鈣內流被人為降低時，EPSC幅值隨之減小（圖5 B和C，“調整后5-HT”組），但其與對照組的差異仍具有統計學意義。鈣電流和EPSC的峰值幅度分析得出相似結果（見SI附錄圖S2及表S13）。

綜上所述，突觸前鈣電流增強和釋放裝置的調控共同參與了突觸增強效應。

圖5 苔蘚纖維末梢與CA3錐體細胞的同時記錄

本文的局限性

本篇文章十分精彩，但并非完美無瑕：

1、突觸前增強機制方面，作者證實了5-HT對P/Q型鈣電流的增強作用并推測PKA參與其中，但PKA的具體磷酸化底物尚未被明確鑒定——鈣通道亞基本身或其輔助亞基是否直接被磷酸化，仍有待進一步探究。而關于鈣通道與囊泡偶聯的關系，高濃度EGTA實驗間接提示5-HT可能增強了偶聯效率，但該推論尚缺乏直接證據，如活性區內鈣通道與囊泡的空間位置變化或囊泡鈣傳感器敏感性變化等，均未被驗證。

2、研究結果的普適性有限，所有實驗均集中于海馬苔蘚纖維突觸——該突觸因終末較大便于記錄而屬于特殊類型，皮層中絕大多數興奮性突觸是否遵循相似規律尚不清楚，5-HT在其他突觸上是否同樣通過增強P/Q型鈣電流發揮作用有待驗證。

3、行為學及網絡層面的功能意義尚未涉及，本研究屬離體腦片水平的細胞生理學研究，雖深刻揭示了分子機制，但該機制在整體動物行為層面（如學習記憶、情緒調控或SSRI類抗抑郁效應）究竟發揮多大貢獻，尚缺乏在體驗證。

總結

神經調質在生理及病理生理條件下通過調節突觸強度發揮重要作用，然而其在哺乳動物突觸中的細胞機制尚不清楚。本研究通過對海馬苔蘚纖維末梢進行直接突觸前膜片鉗記錄，揭示了血清素——一種參與情緒、焦慮及精神疾病調控的神經調質——通過蛋白激酶A依賴性通路增強P/Q型鈣通道及遞質釋放。同步突觸前及突觸后記錄表明，鈣電流和釋放裝置的共同調控參與了遞質釋放的增強。

上述發現揭示，活動依賴性同突觸可塑性與異突觸神經調質之間在機制上既存在相似性又存在差異性，使苔蘚纖維突觸能夠在海馬環路中實現動態調控。

參考文獻

Miyano R, Onishi T, Tabuchi E, Hirose K, Sakaba T. Serotonin potentiates presynaptic calcium currents and transmitter release at cortical synapses. Proc Natl Acad Sci U S A. 2026 Apr 28;123(17):e2523559123. doi: 10.1073/pnas.2523559123. Epub 2026 Apr 24. PMID: 42030146; PMCID: PMC13123807.

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