Br J Pharmacol (2區, IF=7.7)｜不靠酶活性也能抗脂肪肝：SPHK2穩定ATGL，促進甘油三酯水解！(蘭天—哈爾濱醫科大學)

2026年2月，哈爾濱醫科大學藥學院、寒地心血管病全國重點實驗室蘭天團隊，聯合廣東藥科大學、中山大學附屬第一醫院、哈爾濱醫科大學附屬腫瘤醫院、中國科學院上海藥物研究所等單位，在British Journal of Pharmacology（中科院2區，2024 Impact Factor=7.7）在線發表題為“Noncanonical function of sphingosine kinase 2 (SPHK2) sustains hepatic triglyceride homeostasis”的研究論文。該文于2025年10月19日投稿，2026年2月10日修回，2026年2月12日接收。

代謝功能障礙相關脂肪性肝病（MASLD）的核心病理特征之一是肝臟脂質穩態紊亂和甘油三酯（TG）過度積累。既往研究多關注鞘氨醇激酶2（SPHK2）依賴其酶活性產生鞘氨醇-1-磷酸（S1P）后對脂質代謝的調節作用，而本研究進一步提出：SPHK2 還可通過非經典、非酶活性依賴的方式維持肝臟 TG 穩態。

研究發現，在 MASLD 患者和高脂飲食誘導的 MASLD 小鼠脂肪變性肝臟中，肝細胞 SPHK2 表達顯著降低。肝細胞特異性敲除 Sphk2 會加重高脂飲食誘導的肝脂肪變性、肝臟和血清 TG 升高、脂滴沉積及肝損傷；相反，肝細胞特異性過表達 SPHK2 可改善高脂飲食誘導的肝脂肪變性，并增強與 TG 分解代謝相關的蛋白和通路。

機制上，SPHK2 可與脂肪甘油三酯脂肪酶 ATGL 結合，抑制 E3 泛素連接酶 COP1 介導的 ATGL 泛素化和蛋白酶體降解，從而穩定 ATGL 蛋白、促進 TG 水解并減輕肝臟脂質積累。進一步研究顯示，KLF10 是導致脂肪變性肝細胞中 SPHK2 下調的轉錄抑制因子；同時，過表達催化失活形式的 SPHK2G212E 仍可減輕飲食誘導小鼠的肝脂肪變性，說明 SPHK2 的肝臟保護作用并不完全依賴其酶活性。

該研究揭示了 SPHK2 調控肝臟甘油三酯穩態的新機制，即通過非酶學功能穩定 ATGL、促進 TG 水解，從而緩解 MASLD 相關肝脂肪變性。這一發現不僅拓展了對 SPHK2 生物學功能的認識，也提示 SPHK2 及其非酶學功能可能成為 MASLD 干預的新方向。

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【摘要】

背景與目的：由脂質穩態紊亂引起的肝脂肪變性，是代謝功能障礙相關脂肪性肝病（metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease，MASLD）發生發展的重要環節。鞘氨醇激酶 2（sphingosine kinase 2，SPHK2）是鞘脂分解代謝中的關鍵調節因子，參與肝臟脂質積累。近年來，SPHK2 的非酶學調控作用受到越來越多關注。本研究旨在闡明 SPHK2 在不依賴其酶活性的情況下，介導肝脂肪變性的非經典機制。

實驗方法：研究者通過分析 MASLD 小鼠肝細胞單細胞轉錄組數據，確認 SPHK2 參與肝脂肪變性進展。隨后，研究者利用肝細胞特異性過表達或敲除 Sphk2 的小鼠，開展 SPHK2 功能獲得與功能缺失實驗。研究還結合多組學分析和免疫沉淀-質譜技術，進一步解析 SPHK2 在脂肪變性肝臟中的作用及分子機制。同時，研究者使用 8 型腺相關病毒（adeno-associated virus 8，AAV8）載體，在小鼠體內過表達催化失活形式的 SPHK2。

關鍵結果：在 MASLD 患者和小鼠的脂肪變性肝臟中，肝細胞 SPHK2 顯著下調。肝細胞特異性敲除 Sphk2 會通過抑制脂肪甘油三酯脂肪酶/含 patatin 樣磷脂酶結構域蛋白 2、三酰甘油脂肪酶（adipose triglyceride lipase/patatin like domain 2, triacylglycerol lipase，ATGL）介導的甘油三酯水解，促進飲食誘導的肝脂肪變性；相反，肝細胞中過表達 SPHK2 可通過穩定 ATGL，減輕高脂飲食（high-fat diet，HFD）誘導的肝脂肪變性。機制上，SPHK2 可與 ATGL 結合，抑制組成型光形態建成蛋白 1 同源物（constitutive photomorphogenesis protein 1 homolog，COP1）介導的 ATGL 泛素化。此外，研究還發現 Kruppel 樣因子 10（Kruppel-like factor 10，KLF10）是導致肝細胞中 SPHK2 下調的轉錄抑制因子。過表達 SPHK2 的非催化功能可預防飲食誘導小鼠的肝脂肪變性。

結論與意義：SPHK2 可不依賴其酶活性，通過抑制 ATGL 泛素化并促進甘油三酯水解，減輕肝脂肪變性，提示其在 MASLD 干預中具有潛在治療價值。

01

研究背景及科學問題

代謝功能障礙相關脂肪性肝病（MASLD）及其嚴重亞型代謝功能障礙相關脂肪性肝炎（metabolic dysfunction-associated steatohepatitis，MASH），已成為全球慢性肝病的主要原因。如果缺乏有效干預，MASLD 患者可能進一步進展為肝硬化和肝細胞癌。盡管 MASLD 具有重要臨床意義，但驅動其進展的分子通路仍未被完全闡明。

肝臟脂質過度積累是 MASLD 的典型特征。這種脂質異常沉積不僅與進展性肝病相關，也與肥胖、2 型糖尿病和心血管疾病密切聯系。當肝臟攝入的基礎碳水化合物和脂肪酸超過其代謝能力時，異位脂肪沉積便可能發生。盡管過去幾十年臨床和實驗研究不斷增加，開發 MASLD 的有效治療干預手段仍然具有挑戰性。Resmetirom（MGL-3196）被設計用于改善肝臟脂肪代謝并減少脂毒性損傷，其 2 期和 3 期臨床試驗結果顯示，resmetirom 治療可在 MASLD 中帶來顯著改善，包括 MASH 緩解和肝纖維化降低。這些發現提示，調控肝臟脂肪代謝可能是 MASLD 治療的重要策略。

在 MASLD 的發病過程中，肝內甘油三酯（triglyceride，TG）過度積累導致的脂毒性是主要特征。過量 TG 積累會使肝細胞更易受到后續損傷，從而加重肝損害。盡管誘發肝脂肪變性的因素很多，脂解功能障礙被認為是推動 MASLD 進展的重要因素。脂肪甘油三酯脂肪酶/含 patatin 樣磷脂酶結構域蛋白 2、三酰甘油脂肪酶（ATGL）能夠在脂滴中催化 TG 裂解為二酰甘油。肝細胞 ATGL 缺乏會加重小鼠肝脂肪變性進展，而 ATGL 過表達可增強脂肪酸動員和 β-氧化，從而改善脂質積累。近期研究還發現，ATGL 在 PNPLA3（I148M）介導的肝脂肪變性中發揮關鍵作用。這些結果表明，ATGL 可能是 MASLD 的潛在治療靶點。

鞘氨醇激酶 2（SPHK2）是鞘脂代謝中的關鍵酶。肝臟 SPHK2 缺乏可通過鞘氨醇-1-磷酸（sphingosine-1-phosphate，S1P）/S1P1-5 受體軸加重胰島素抵抗和糖耐量受損。調節 SPHK2 表達也被認為可能用于脂質紊亂干預。已有研究顯示，在酒精性肝病小鼠中，SPHK2 缺乏會加重肝損傷和脂肪變性。此外，SPHK2 還被報道可通過影響極低密度脂蛋白（very low density lipoprotein，VLDL）分泌或破壞氧化還原平衡來調節肝脂肪變性。值得注意的是，這些調控作用均依賴 SPHK2 的酶活性。

近期，作者團隊還發現，SPHK2 可在不依賴其激酶活性的情況下，調節造血干細胞擴增和哺乳動物心臟再生。然而，SPHK2 是否通過調控 ATGL 介導的 TG 水解來影響肝脂肪變性，以及這一過程是否依賴其酶活性，目前仍不清楚。

已有認識包括：肝脂肪變性是 MASLD 的重要病因之一；SPHK2 催化產生的 S1P 已被證明可維持肝臟 VLDL 分泌和氧化還原平衡。本研究進一步補充了兩個關鍵點：SPHK2 可不依賴其酶活性，保護機體免受飲食誘導的肝脂肪變性；SPHK2 通過抑制 COP1 介導的 ATGL 泛素化和降解，促進 TG 水解。從臨床意義上看，SPHK2 可能成為 MASLD 治療的潛在靶點，而 SPHK2 的非酶學功能也拓寬了 MASLD 相關 SPHK2 抑制劑的篩選范圍。

在本研究中，作者證明 SPHK2 對肝脂肪變性具有負向調控作用。肝細胞特異性 Sphk2 敲除可促進 HFD 誘導的肝脂肪變性，而肝細胞特異性 SPHK2 過表達可抵抗 HFD 誘導的肝脂肪變性。SPHK2 可不依賴其酶活性，競爭性結合 ATGL，并抑制 COP1 介導的泛素化，從而加速 TG 水解并改善肝臟脂質積累。本研究揭示了 SPHK2 減輕肝脂肪變性的一種新的酶活性非依賴機制，也提示 SPHK2 在 MASLD 治療中的潛在應用價值。

02

重要發現及亮點

SPHK2在脂肪變性肝臟中顯著降低

為探究 SPHK2 在肝臟中的潛在作用，研究者首先分析了公開的小鼠肝臟單細胞轉錄組數據集 GSE166504，發現 Sphk2 主要表達于肝細胞，而非非實質細胞。這提示 SPHK2 可能參與肝臟中的多種關鍵生物學過程。

為進一步考察肝臟 SPHK2 在脂肪變性肝臟中的潛在作用，研究者分析了另一個 RNA-seq 數據集 GSE182365，該數據集來源于正常飼料或高脂飲食喂養小鼠的肝細胞。分析共識別出 4 個肝細胞簇，其中 Sphk2 在 Cluster 2 中顯著富集，并在 HFD 小鼠中明顯下調。此外，Cluster 2 富集了與脂質代謝相關的信號通路。

組織學和免疫熒光染色顯示，脂肪變性肝組織樣本中 SPHK2 表達降低。與此一致，在 MASLD 患者和 HFD 小鼠肝臟中，Sphk2 的蛋白和 mRNA 水平均顯著下降。為進一步明確 SPHK2 表達為何在脂肪變性肝臟中降低，研究者分離原代肝細胞，并用棕櫚酸處理以模擬肝臟脂毒性。結果顯示，棕櫚酸可時間依賴性降低 SPHK2 蛋白豐度；不同劑量棕櫚酸處理肝細胞后，SPHK2 表達也呈劑量依賴性下降。這些結果提示，在代謝應激狀態下，肝細胞中的 SPHK2 會被下調。

圖1：肝臟鞘氨醇激酶 2（SPHK2）在代謝功能障礙相關脂肪性肝病（MASLD）患者和小鼠中顯著下調。（a）UMAP 圖展示來自 NCBI 數據庫 GSE166504 的小鼠肝臟單細胞轉錄組圖譜中的不同細胞簇。（b）氣泡圖顯示 GEO 數據集 GSE166504 中所有細胞簇內 Sphk2 的相對表達。（c）UMAP 圖顯示 GEO 數據集 GSE182365 中小鼠肝細胞的不同細胞簇。（d）將各細胞簇中的 Sphk2 表達水平映射到 UMAP 圖中。（e）氣泡圖顯示不同細胞簇中 Sphk2 的相對表達。（f）對 GSE182365 中 Cluster 2 進行 GO 富集分析。（g）非 MASLD 和 MASLD 患者肝組織樣本的 H&E 染色，以及 SPHK2 與 Alb 的雙重免疫熒光染色。比例尺為 50 或 100 μm。（h）非 MASLD 和 MASLD 個體肝臟中 SPHK2 蛋白水平的免疫印跡分析。（i）高脂飲食（HFD）小鼠肝臟中 SPHK2 蛋白水平的免疫印跡分析。（j）MASLD 和非 MASLD 個體肝臟中 SPHK2 mRNA 水平。數據以均值 ± 標準誤（mean ± SEM）表示，n = 5。*P < 0.05。（k）HFD 小鼠肝臟中 Sphk2 mRNA 水平。數據以均值 ± 標準誤（mean ± SEM）表示，n = 7。*P < 0.05。n 代表獨立樣本數量。

肝細胞Sphk2缺失加重HFD誘導的肝脂肪變性

為了明確 SPHK2 是否調節肝臟脂質積累，研究者利用 Cre-LoxP 系統構建了肝細胞特異性 Sphk2 敲除小鼠（Sphk2-HKO）。結果顯示，Sphk2-HKO 小鼠肝臟中 Sphk2 的蛋白豐度和 mRNA 水平均顯著降低，且其原代肝細胞中幾乎檢測不到 SPHK2 翻譯產物。進一步觀察發現，Sphk2 缺失顯著加重棕櫚酸誘導的肝細胞脂質積累，并增加細胞內總 TG 含量。這提示 Sphk2 缺失可促進肝細胞脂質積累。

隨后，為進一步評估 SPHK2 是否參與肝脂肪變性，研究者分別給予 Sphk2-Flox 和 Sphk2-HKO 小鼠對照飲食（control diet，CD）或 HFD，持續 20 周。HFD 對 Sphk2-Flox 和 Sphk2-HKO 小鼠體重沒有明顯影響。然而，與 Sphk2-Flox 小鼠相比，Sphk2-HKO 小鼠出現更嚴重的肝脂肪變性和肝損傷，具體表現為肝臟重量增加、肝臟和血清 TG 水平升高、肝臟脂滴增多、氣球樣變性更明顯，以及血清丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）和天冬氨酸氨基轉移酶（AST）水平升高。Sphk2-HKO 小鼠還表現出更嚴重的糖耐量受損和胰島素抵抗。

為進一步探索肝細胞特異性敲除 Sphk2 如何促進肝脂肪變性，研究者進行了 RNA-seq 分析。無監督主成分分析（principal component analysis，PCA）顯示，HFD 喂養的 Sphk2-Flox 和 Sphk2-HKO 小鼠肝臟轉錄組明顯分為兩個不同組。GO 和 KEGG 分析顯示，與脂肪酸代謝和脂質代謝過程相關的基因在 Sphk2 缺失后顯著富集并下調。這提示 Sphk2 缺乏可能通過加重脂質代謝紊亂，促進 HFD 誘導的肝脂肪變性。

為進一步解析 SPHK2 調控脂質代謝的機制，研究者對 HFD 喂養的 Sphk2-Flox 和 Sphk2-HKO 小鼠肝臟樣本進行了脂質代謝組學分析。結果顯示，肝細胞特異性敲除 Sphk2 可顯著改變肝臟脂質代謝物。在這些代謝物中，Sphk2-HKO 小鼠肝臟中的 TG 水平顯著升高，而二酰甘油（diacylglycerol，DG）水平明顯降低。這些結果提示，肝細胞特異性敲除 Sphk2 可能損害 TG 分解代謝，從而促進肝脂肪變性發生。

圖2：肝細胞特異性 SPHK2 缺乏加重高脂飲食（HFD）誘導的甘油三酯積累。（a）實驗設計示意圖。8 周齡 Sphk2-Flox 和 Sphk2-HKO 小鼠接受 CD 或 HFD 喂養 20 周，以誘導代謝功能障礙相關脂肪性肝病（MASLD）。（b）檢測 Sphk2-Flox 和 Sphk2-HKO 小鼠的肝臟與體重比。（c）Sphk2-Flox 和 Sphk2-HKO 小鼠肝臟及血清甘油三酯（TG）水平。數據以均值 ± 標準誤（mean ± SEM）表示，n = 7。*P < 0.05。（d）HFD 喂養的 Sphk2-Flox 和 Sphk2-HKO 小鼠肝臟切片 H&E 染色。比例尺為 50 μm。（e）HFD 喂養的 Sphk2-Flox 和 Sphk2-HKO 小鼠肝臟切片油紅 O 染色及定量分析。比例尺為 50 μm。數據以均值 ± 標準誤（mean ± SEM）表示，n = 6–7。*P < 0.05。（f）HFD 喂養的 Sphk2-Flox 和 Sphk2-HKO 小鼠肝臟切片透射電子顯微鏡分析。比例尺為 3 μm。（g）Sphk2-Flox 和 Sphk2-HKO 小鼠血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）和 AST 活性。數據以均值 ± 標準誤（mean ± SEM）表示，n = 7。*P < 0.05。（h）肝臟脂質代謝組學流程圖。（i）HFD 喂養的 Sphk2-Flox 和 Sphk2-HKO 小鼠肝臟脂質代謝組學 PCA 分析。（j、k）HFD 喂養的 Sphk2-Flox 和 Sphk2-HKO 小鼠肝臟中差異脂質水平的火山圖（j）和柱狀圖（k）。（l）Sphk2-Flox 和 Sphk2-HKO 小鼠肝臟中的二酰甘油（DG）含量。數據以均值 ± 標準誤（mean ± SEM）表示，n = 7。*P < 0.05。n 代表獨立樣本數量。

肝細胞SPHK2過表達抑制HFD誘導的肝脂肪變性

前述結果顯示，肝細胞 Sphk2 缺失可促進 HFD 誘導的肝脂肪變性。接下來，研究者進一步考察肝臟 SPHK2 過表達是否能夠改善 HFD 誘導的肝脂肪變性。研究者通過將 Alb-Cre 小鼠與 STOP-Sphk2 小鼠雜交，構建肝細胞特異性 SPHK2 敲入小鼠（Sphk2-HKI），并以同窩 Loxp 小鼠作為對照。

結果顯示，Sphk2-HKI 小鼠肝臟中 Sphk2 的蛋白豐度和 mRNA 水平均顯著升高，其原代肝細胞中 SPHK2 蛋白豐度也明顯增加。在體外實驗中，SPHK2 過表達顯著降低棕櫚酸誘導的脂質積累和細胞總 TG 含量。普通飲食條件下，Loxp 和 Sphk2-HKI 小鼠之間沒有顯著差異。隨后，研究者給予 Loxp 和 Sphk2-HKI 小鼠 HFD 喂養 20 周。HFD 對兩組小鼠體重無明顯影響，但 Sphk2-HKI 小鼠對 HFD 誘導的肝脂肪變性表現出抵抗作用，表現為肝臟重量比降低、肝臟和血清 TG 水平下降、肝臟脂滴減少，以及血清 ALT 和 AST 活性降低。此外，肝臟 SPHK2 過表達還顯著緩解 HFD 誘導的糖耐量受損和胰島素抵抗。這些結果表明，肝臟 SPHK2 過表達可改善 HFD 誘導的肝脂肪變性。

研究者進一步分析 SPHK2 過表達對 HFD 誘導肝脂肪變性的保護作用是否與 TG 分解代謝改善有關。蛋白質組學結果顯示，在 HFD 喂養的 Sphk2-HKI 小鼠肝臟中，SPHK2 過表達可激活與脂質分解代謝和 TG 穩態相關的蛋白及通路。這提示 TG 分解代謝增強可能有助于減輕 Sphk2-HKI 小鼠的 HFD 誘導肝脂肪變性。

此外，為評估肝臟 SPHK2 過表達是否影響基礎能量代謝，研究者檢測了 HFD 喂養的 Loxp 和 Sphk2-HKI 小鼠的能量消耗和活動水平。結果顯示，Sphk2-HKI 小鼠在明暗周期中的能量消耗無顯著變化，24 小時監測期間活動水平也與 Loxp 小鼠無顯著差異。綜合代謝籠實驗顯示，肝臟 SPHK2 過表達并未改變氧氣消耗量（VO?）或二氧化碳產生量（VCO?）。這些結果提示，SPHK2 減輕肝脂肪變性的作用不依賴全身能量代謝改變。

圖3：肝細胞特異性 SPHK2 過表達改善高脂飲食（HFD）誘導的甘油三酯代謝紊亂。實驗設計示意圖。（a）8 周齡 Loxp 和 Sphk2-HKI 小鼠經 20 周 HFD 喂養誘導代謝功能障礙相關脂肪性肝病（MASLD）。（b）檢測 Loxp 和 Sphk2-HKI 小鼠的肝臟與體重比。（c）Loxp 和 Sphk2-HKI 小鼠肝臟及血清甘油三酯（TG）水平。（d）HFD 喂養的 Loxp 和 Sphk2-HKI 小鼠肝臟切片 H&E 染色。比例尺為 50 μm。（e）HFD 喂養的 Loxp 和 Sphk2-HKI 小鼠肝臟切片油紅 O 染色及定量分析。比例尺為 50 μm。（f）Loxp 和 Sphk2-HKI 小鼠血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）和 AST 活性。數據以均值 ± 標準誤（mean ± SEM）表示，n = 7。*P < 0.05。（g）肝臟蛋白質組學分析流程圖。（h）差異表達蛋白譜的火山圖，其中紅色表示上調蛋白，藍色表示下調蛋白。（i）GSEA 顯示基于蛋白質組學數據，甘油三酯代謝相關通路發生富集。（j）熱圖顯示與脂質代謝相關的顯著改變蛋白。n 代表獨立樣本數量。

SPHK2不依賴酶活性穩定ATGL并改善肝細胞脂質積累

為進一步研究 SPHK2 影響 TG 降解的機制，研究者對小鼠原代肝細胞的共免疫沉淀-質譜數據進行分析，結果提示 SPHK2 可能與 ATGL（基因名 PNPLA2）相互作用。隨后研究發現，SPHK2 可在原代肝細胞和 293T 細胞中與 ATGL 共免疫沉淀。值得注意的是，ATGL 過表達能夠有效逆轉 Sphk2 缺乏導致的細胞脂質積累和 TG 水平升高，提示 ATGL 表達下降是 Sphk2-HKO 小鼠肝臟脂質積累的關鍵因素。

既往研究顯示，SPHK2 介導的 S1P 生成可緩解 MASLD。SPHK2（G212E）突變體已被證明無法生成 S1P。為明確 SPHK2 是否通過 S1P 依賴性通路調控 ATGL 表達，研究者構建了 Flag-Sphk2G212E 突變質粒，并確認其 S1P 生成能力。結果顯示，轉染 Sphk2WT 和 Sphk2G212E 均可提高 ATGL 蛋白豐度，提示 SPHK2 對 ATGL 的調控不依賴 S1P。

此外，無論在 CD 還是 HFD 條件下，Sphk2-HKO 小鼠肝臟中的 ATGL 蛋白豐度均顯著下降，但其 mRNA 水平未發生變化。相反，肝臟中過表達 SPHK2 可上調 ATGL 蛋白豐度，但不影響其 mRNA 水平。這提示 SPHK2 可能參與調控 ATGL 降解。為驗證這一假設，研究者分離 Sphk2-Flox 和 Sphk2-HKO 小鼠原代肝細胞，并使用蛋白合成抑制劑環己酰亞胺（cycloheximide，CHX）處理。結果顯示，肝細胞 Sphk2 缺失顯著縮短 ATGL 蛋白半衰期，而 SPHK2-WT 或 SPHK2-G212E 過表達均可明顯阻止 ATGL 降解。上述結果表明，SPHK2 可部分以酶活性非依賴方式抑制 ATGL 降解，從而減輕肝臟脂質積累。

圖4：SPHK2 增強 ATGL 蛋白穩定性，并以不依賴其酶活性的方式減少脂質沉積。（a）在小鼠原代肝細胞中發現 SPHK2 相互作用蛋白的示意圖。（b）質譜（MS）分析中由 SPHK2 拉下的 ATGL 二級峰圖。（c–f）Co-IP 實驗證明外源性 ATGL 與 SPHK2 在小鼠原代肝細胞和 293T 細胞中存在相互作用。（g）在感染 Myc-ATGL 的 Sphk2-HKO 和 Sphk2-Flox 小鼠原代肝細胞中，經棕櫚酸（PA）誘導后進行油紅 O 染色及定量分析。比例尺為 20 μm。（h）PA 處理后，從 Sphk2-Flox 和 Sphk2-HKO 小鼠分離并感染 Myc-ATGL 的肝細胞中甘油三酯（TG）濃度。數據以均值 ± 標準誤（mean ± SEM）表示，n = 5。*P < 0.05。（i）轉染 Flag-Sphk2WT 或 Flag-Sphk2G212E 質粒的 AML12 細胞中 Flag 蛋白水平的免疫印跡分析。（j）探索性數據：采用 LC/MS 檢測轉染 Flag-Sphk2WT 或 Flag-Sphk2G212E 的 AML12 肝細胞中的 S1P 濃度（n = 4）。當 n < 5 時，未進行統計學分析，結果應視為初步結果。（k）轉染 Flag-Sphk2WT 或 Flag-Sphk2G212E 質粒的 PA 誘導 AML12 細胞中 SPHK2 和 ATGL 蛋白水平的免疫印跡分析。（l）CD 或 HFD 喂養的 Sphk2-Flox 和 Sphk2-HKO 小鼠肝臟 ATGL 蛋白水平。（m）CD 或 HFD 喂養的 Loxp 和 Sphk2-HKI 小鼠肝臟 ATGL 蛋白水平。（n）Sphk2-Flox 和 Sphk2-HKO 小鼠肝臟中 Pnpla2 mRNA 水平。（o）Loxp 和 Sphk2-HKI 小鼠肝臟中 Pnpla2 mRNA 水平。數據以均值 ± 標準誤（mean ± SEM）表示，n = 7。*P < 0.05。（p）肝細胞在指定時間內用環己酰亞胺（CHX）培養后，ATGL 蛋白表達情況。n 代表獨立樣本數量。

SPHK2通過H335位點競爭性結合ATGL并抑制COP1介導的泛素化

為深入研究 SPHK2 調控 ATGL 蛋白穩定性的具體機制，研究者分離 Sphk2-Flox 和 Sphk2-HKO 小鼠肝細胞，并分別使用溶酶體抑制劑氯喹（chloroquine）或蛋白酶體抑制劑 MG-132 處理。MG-132 可顯著提高 Sphk2-HKO 肝細胞中的 ATGL 蛋白豐度，而氯喹無法恢復 Sphk2 缺乏導致的 ATGL 下調，提示 ATGL 主要經蛋白酶體途徑降解。與此一致，在棕櫚酸暴露的肝細胞中，Sphk2 缺乏增強了 ATGL 泛素化。

E3 泛素連接酶 COP1 已被證明可與 ATGL 相互作用，導致 ATGL 多聚泛素化和蛋白酶體降解。研究者在 293T 細胞中共同轉染 Myc-Atgl 和 Flag-Cop1，確認二者存在相互作用。進一步實驗顯示，在棕櫚酸培養的肝細胞中，Cop1 siRNA 可挽救 Sphk2 缺失造成的 ATGL 下調。Cop1 敲低和 SPHK2 過表達均可降低 Sphk2-HKO 肝細胞中 ATGL 的泛素化和降解；同時，Cop1 敲低還可逆轉 Sphk2 缺乏導致的 ATGL 泛素化和降解。此外，Cop1 敲低能夠恢復 Sphk2 缺失引起的細胞脂質積累和總 TG 含量升高。這些結果說明，SPHK2 可通過抑制 COP1 誘導的 ATGL 泛素化來減少脂質沉積。

為了從結構層面理解 SPHK2-ATGL 相互作用，研究者對 SPHK2 和 ATGL 進行了分子對接模擬。SPHK2 和 ATGL 模型通過結合 N 端同源建模與 C 端從頭建模構建，并經過 AMBER12/EHT 能量最小化和 Ramachandran 圖驗證。研究者利用 ClusPro 進行定向對接模擬，識別出 SPHK2 與 ATGL 之間兩個不同的相互作用界面（IF1 和 IF2）。在 IF1 界面中，ATGL 的纈氨酸（V361）氮原子與 SPHK2 的組氨酸（H335）咪唑基之間形成氫鍵；IF2 界面則由兩種蛋白的 N 端結構域構成。模擬中低骨架波動顯示系統達到平衡狀態，說明結構系統穩定。

由于 SPHK2 的 H335 可直接結合 ATGL 的 V361，研究者構建了 Myc-Sphk2H335A 突變質粒。該突變顯著降低 SPHK2 對 ATGL 的結合能力。SPHK2H335A 過表達無法抵消棕櫚酸處理的 Sphk2 缺失肝細胞中 ATGL 的下調。與此一致，SPHK2 過表達可逆轉 COP1 過表達介導的 ATGL 降解，而 SPHK2H335A 突變體無法產生這一逆轉作用。此外，SPHK2H335A 突變體也無法緩解棕櫚酸誘導的脂質積累。總體而言，這些結果表明，SPHK2 通過其 H335 位點與 ATGL 相互作用，從而阻止 E3 泛素連接酶 COP1 與 ATGL 結合，最終抑制 ATGL 的泛素化介導降解。

研究者還進一步探究了 SPHK2 的亞細胞定位是否影響 ATGL 介導的脂質積累。與 MASLD 患者肝臟中細胞質 SPHK2 顯著減少的結果類似，棕櫚酸誘導后細胞質中 SPHK2 蛋白豐度也下降。這提示細胞質 SPHK2 下調可能參與肝臟脂質積累。為進一步明確 SPHK2 亞細胞定位在 ATGL 介導脂質積累中的具體作用，研究者構建并驗證了兩種空間定位突變體：核排除型（NLS）突變和胞質排除型（NES）突變。與 SPHK2（NESmut）相比，SPHK2（NLSmut）可顯著降低棕櫚酸誘導的 ATGL 降解，并減少相應的脂質積累。這些結果提示，細胞質 SPHK2 可通過抑制 ATGL 降解來減輕肝脂肪變性。

圖5：SPHK2 通過 H335 位點與 ATGL 相互作用，并抑制 COP1 介導的泛素化。（a）MG-132（10 μM）或氯喹（Chlor，10 μM）處理原代肝細胞后，ATGL 蛋白水平的免疫印跡分析。（b）在 PA 誘導的原代肝細胞中進行泛素化實驗，以檢測內源性 ATGL 的泛素化介導降解。（c、d）在 293T 細胞中進行 Co-IP 實驗，以研究 ATGL 與 COP1 的相互作用。（e）在 Cop1 沉默條件下，棕櫚酸培養的 Sphk2 缺失肝細胞中 ATGL 蛋白水平。（f）在 COP1 缺失條件下，PA 處理的 Sphk2 缺失肝細胞中 ATGL 的泛素化實驗。（g）Sphk2 缺失肝細胞感染 scramble RNA（SCR）或 siCop1 后，經棕櫚酸（PA）處理并進行油紅 O 染色及定量分析。比例尺為 20 μm。（h）檢測感染 SCR 或 siCOP1 的 Sphk2 缺失肝細胞中甘油三酯（TG）含量。數據以均值 ± 標準誤（mean ± SEM）表示，n = 5。*P < 0.05。（i）對接形成的 ATGL（青色）與 SPHK2（橙色）復合物。ATGL 與 SPHK2 相互作用的兩個界面分別稱為 IF1 和 IF2。氫鍵相互作用用紅色表示，鹽橋用藍色表示。（j）ATGL 與 SPHK2 復合物的系統柔性分析。采用均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）評估 ATGL-SPHK2 復合物的柔性。RMSD 用于量化模擬過程中系統生成結構相對于晶體結構隨時間發生的偏離。當 RMSD 波動趨于平穩時，說明系統達到穩定狀態。（k）Co-IP 實驗顯示，在轉染 Myc-Atgl、His-Sphk2WT 或 His-Sphk2H335A 質粒的肝細胞中，ATGL 與 SPHK2 的相互作用。His-Sphk2H335A 表示 SPHK2 第 335 位組氨酸（H335）發生突變。（l）Sphk2 缺失肝細胞轉染空載體、His-Sphk2WT 或 His-Sphk2H335A 后，經 PA 處理時 ATGL 和 SPHK2 蛋白水平的免疫印跡分析。（m）肝細胞轉染相應質粒并經 PA 處理后，ATGL 蛋白水平的免疫印跡分析。（n）Sphk2 缺失肝細胞經 PA 處理后，ATGL 的泛素化水平。（o）Sphk2 缺失肝細胞轉染空載體、His-Sphk2WT 或 His-Sphk2H335A 后，經 PA 處理并進行油紅 O 染色及定量分析。比例尺為 20 μm。（p）Sphk2 缺失肝細胞轉染空載體、His-Sphk2WT 或 His-Sphk2H335A 后，經 PA 處理時的 TG 含量。數據以均值 ± 標準誤（mean ± SEM）表示，n = 5。*P < 0.05。n 代表獨立樣本數量。

KLF10調控肝臟Sphk2轉錄

前述結果已經顯示，脂肪變性肝臟中 Sphk2 基因表達顯著下調，但其背后的分子機制仍不清楚。研究者基于 JASPAR 數據庫預測 Sphk2 的潛在轉錄因子，并將 GSE182365 數據集中 Cluster 2 的差異基因表達數據與 JASPAR 預測的潛在轉錄因子進行整合，最終識別出 KLF10 可能是 Sphk2 的上游轉錄抑制因子。

進一步分析 MASLD 和病態肥胖患者肝臟樣本數據集 GSE61260 發現，Klf10 與 Sphk2 表達呈負相關。與此一致，HFD 和棕櫚酸誘導均可顯著提高 KLF10 的 mRNA 水平和蛋白豐度。敲低 Klf10 可顯著抑制棕櫚酸誘導的 SPHK2 和 ATGL 上調。不過，敲低 Klf10 僅顯著增加 Sphk2 mRNA 水平，而 Atgl 基因 Pnpla2 的 mRNA 水平無顯著變化。

利用 JASPAR 數據庫，研究者在 Sphk2 啟動子區域中確定了 3 個潛在 KLF10 結合位點。進一步的熒光素酶報告實驗結合一系列 Sphk2 啟動子截短構建體顯示，-500 到 0 區域對調控 Sphk2 表達至關重要，提示該區域可能包含關鍵結合位點。此外，敲低 Klf10 可緩解棕櫚酸誘導的脂質積累，但在 Sphk2 缺失肝細胞中這一作用消失，提示 KLF10 通過轉錄調控抑制 Sphk2 基因表達。

圖6：Kruppel 樣因子 10（KLF10）抑制肝臟中鞘氨醇激酶 2 基因（Sphk2）的轉錄。（a）Cluster 2 差異基因（黃色）與 JASPAR 預測的 Sphk2 轉錄因子（藍色）之間重疊基因的維恩圖分析。（b）氣泡圖顯示不同細胞簇中 Klf10 的相對表達。（c）利用 GEO 數據集 GSE61260 分析代謝功能障礙相關脂肪性肝病（MASLD）患者肝組織中 Sphk2 與 Klf10 之間的 Spearman 相關性。（d）高脂飲食（HFD）小鼠肝臟中 Klf10 mRNA 水平。數據以均值 ± 標準誤（mean ± SEM）表示，n = 6–7。*P < 0.05。（e）棕櫚酸（PA）誘導的原代肝細胞中 Klf10 mRNA 水平。數據以均值 ± 標準誤（mean ± SEM）表示，n = 5。*P < 0.05。（f）HFD 小鼠肝臟中 KLF10 蛋白水平的免疫印跡分析。（g）PA 誘導的原代肝細胞中 KLF10 蛋白水平的免疫印跡分析。（h、i）轉染 SCR 或 siKlf10 的 PA 誘導原代肝細胞中 Klf10、Sphk2 以及脂肪甘油三酯脂肪酶/含 patatin 樣磷脂酶結構域蛋白 2、三酰甘油脂肪酶（Pnpla2）的相對蛋白水平（h）和 mRNA 水平（i）。數據以均值 ± 標準誤（mean ± SEM）表示，n = 5。*P < 0.05。（j、k）基于 JASPAR 預測的 Sphk2 啟動子中 KLF10 結合位點。（l）將一系列截短的 Sphk2 啟動子構建體轉染入肝細胞，并進行 PA 處理。隨后檢測相對熒光素酶活性。當 n < 5 時，未進行統計學分析，結果應視為初步結果。（m、n）轉染 SCR、siKlf10 或 siSphk2 的 PA 誘導 AML12 細胞中油紅 O 染色和甘油三酯（TG）含量。比例尺為 20 μm。數據以均值 ± 標準誤（mean ± SEM）表示，n = 5。*P < 0.05。n 代表獨立樣本數量。

SPHK2G212E在脂肪變性肝臟中的潛在干預價值

為了確定 SPHK2 減輕肝脂肪變性是否不依賴其酶活性，研究者使用表達 SPHK2 突變體的腺相關病毒 AAV8-Sphk2G212E 處理小鼠，并以 AAV8-GFP 作為對照病毒。結果顯示，AAV8-Sphk2G212E 可在肝臟中成功過表達 SPHK2。隨后，注射 AAV8-Sphk2G212E 或 AAV8-GFP 的小鼠接受 CD 或 HFD 喂養 20 周。

結果顯示，AAV8-Sphk2G212E 處理可顯著降低小鼠肝臟重量比，并改善胰島素抵抗。此外，接受 AAV8-Sphk2G212E 處理的小鼠肝臟和血清 TG 水平更低，肝臟脂滴更少，血清 ALT 和 AST 水平也降低。總體而言，這些發現提示，SPHK2 可作為一種肝臟保護蛋白，在不依賴其催化活性的情況下減輕肝脂肪變性。

圖7：AAV8-Sphk2G212E 減輕高脂飲食（HFD）誘導小鼠的肝脂肪變性和脂質沉積。（a）注射 AAV8-Sphk2G212E 和 AAV8-GFP 的小鼠肝臟中鞘氨醇激酶 2（SPHK2）蛋白水平的免疫印跡分析。（b）實驗設計示意圖。注射 AAV8-Sphk2G212E 或 AAV8-GFP 的 C57BL/6J 小鼠接受 HFD 喂養 20 周。（c）感染 AAV8-Sphk2G212E 和 AAV8-GFP 小鼠的肝臟與體重比。（d、e）在感染 AAV8-Sphk2G212E 和 AAV8-GFP 的小鼠中進行腹腔葡萄糖耐量試驗（IGTT）和胰島素耐量試驗（ITT）。（f）感染 AAV8-Sphk2G212E 和 AAV8-GFP 小鼠的肝臟及血清甘油三酯（TG）水平。數據以均值 ± 標準誤（mean ± SEM）表示，n = 7。*P < 0.05。（g）HFD 喂養的 AAV8-Sphk2G212E 和 AAV8-GFP 感染小鼠肝臟切片 H&E 染色。比例尺為 50 μm。（h）HFD 喂養的 AAV8-Sphk2G212E 和 AAV8-GFP 感染小鼠中油紅 O 染色及定量分析。比例尺為 50 μm。數據以均值 ± 標準誤（mean ± SEM）表示，n = 6–7。*P < 0.05。（i）AAV8-Sphk2G212E 和 AAV8-GFP 感染小鼠血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）和 AST 活性。數據以均值 ± 標準誤（mean ± SEM）表示，n = 7。*P < 0.05。n 代表獨立樣本數量。

【Citation】:Yuan B, Ding X, Deng X, Wu T, Xu N, Wang Y, Yang Y, Wang W, Ren X, Cheng W, Li R, Zhao H, Guo J, Li J, Dong W, Zhang Y, Lan T. Noncanonical function of sphingosine kinase 2 (SPHK2) sustains hepatic triglyceride homeostasis.British Journal of Pharmacology.2026;1–21.

【貢獻】★★★★★

本研究闡明了一種新的機制：SPHK2 可在不依賴其酶活性的情況下，通過抑制 ATGL 泛素化，促進 TG 水解并減輕肝脂肪變性。SPHK2 可能成為代謝功能障礙相關脂肪性肝病（MASLD）治療的潛在靶點。

此外，本研究也為篩選面向 MASLD 治療的新型 SPHK2 抑制劑提供了另一種思路，即相關藥物篩選不僅可關注 SPHK2 的酶活性，也可關注其表觀遺傳調控效應。關于 SPHK2 在肝脂肪變性中的非酶學調控作用，本研究拓寬了 SPHK2 抑制劑的篩選范圍，并可能提高相關候選物開發的成功率。

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