PNAS｜鎖定病毒復(fù)制“開關(guān)”！浙江大學(xué)茹衡等團(tuán)隊(duì)揭示麻疹病毒聚合酶如何被調(diào)控與關(guān)閉，為藥物設(shè)計(jì)指路

非節(jié)段負(fù)鏈RNA病毒（nsNSVs）依賴一種多功能RNA依賴性RNA聚合酶（RdRP）復(fù)合體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。在麻疹病毒（MeV）中，非結(jié)構(gòu)蛋白C長(zhǎng)期以來被認(rèn)為參與調(diào)節(jié)RNA合并，但其確切作用仍不清楚 。

202 6 年 4 月 6 日， 浙江大學(xué)茹衡，湖北大學(xué)吳姍和華東師范大學(xué)張乾森共同 通訊在 PNAS 在線發(fā)表題為“Structural insights into measles virus RNA synthesis regulation and pan-paramyxoviral polymerase inhibition by ERDRP-0519”的研究論文。 該研究證明MeV C蛋白直接與RdRP復(fù)合體結(jié)合。利用冷凍電鏡技術(shù)， 作者 解析了MeV聚合酶在結(jié)合與未結(jié)合C蛋白狀態(tài)下的原子分辨率結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)C蛋白的結(jié)合穩(wěn)定了L蛋白的C端區(qū)域，并將復(fù)合體鎖定在具有復(fù)制能力的延伸狀態(tài)。

生化數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明，C蛋白促進(jìn)N蛋白的募集，通過在復(fù)制過程中促進(jìn)衣殼化來增強(qiáng)聚合酶的持續(xù)合成能力。此外， 作者 還解析了MeV和尼帕病毒（NiV）聚合酶與口服有效的麻疹病毒屬抑制劑ERDRP-0519結(jié)合的高分辨率結(jié)構(gòu)。出乎意料的是，該化合物占據(jù)的是RdRp結(jié)構(gòu)域內(nèi)的一個(gè)變構(gòu)口袋，而非先前預(yù)測(cè)的PRNTase結(jié)構(gòu)域，且與已知的保守耐藥位點(diǎn)重疊。這種結(jié)合誘導(dǎo)了聚合酶掌狀亞結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象變化，阻斷了RNA模板和核苷酸的結(jié)合，從而中止了RNA合并。這些發(fā)現(xiàn)揭示了副粘病毒聚合酶獨(dú)特的調(diào)節(jié)和抑制機(jī)制，并為合理設(shè)計(jì)針對(duì)MeV、NiV以及其他潛在臨床相關(guān)nsNSVs的廣譜抗病毒藥物提供了結(jié)構(gòu)框架。

非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒（nsNSVs）隸屬于單股負(fù)鏈病毒目，該目包含11個(gè)病毒科。其中，副黏病毒科、肺病毒科、絲狀病毒科、彈狀病毒科以及博爾納病毒科的成員已被廣泛研究。這些病毒在人類及其他哺乳動(dòng)物中引發(fā)廣泛的疾病譜，從輕微感染到嚴(yán)重且常致死的病癥，從而對(duì)公共衛(wèi)生和畜牧業(yè)構(gòu)成重大威脅。nsNSVs的基因組由線性、單鏈、負(fù)義的RNA組成，由核衣殼蛋白（NPs）包裹形成絲狀的核糖核蛋白（RNP）復(fù)合物，該復(fù)合物作為轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的模板。基因組長(zhǎng)度通常為11至19 kb，兩端分別為3′前導(dǎo)序列和5′尾隨序列，兩者均作為RNA合并的啟動(dòng)子。病毒基因按順序排列并串聯(lián)轉(zhuǎn)錄，每個(gè)基因的非翻譯區(qū)（UTRs）內(nèi)均包含順式作用的基因起始（GS）和基因終止（GE）信號(hào)，這些信號(hào)對(duì)于調(diào)節(jié)病毒RNA合并至關(guān)重要。

病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞并將病毒RNPs釋放至細(xì)胞質(zhì)后，nsNSV聚合酶在3′啟動(dòng)子處起始轉(zhuǎn)錄。在合并并釋放一段對(duì)應(yīng)于啟動(dòng)子近端前導(dǎo)區(qū)的短非編碼RNA后，聚合酶仍與模板結(jié)合，掃描第一個(gè)基因的GS信號(hào)。每個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生一個(gè)加帽并甲基化的單順反子mRNA，該mRNA持續(xù)延伸直至遇到GE信號(hào)，從而觸發(fā)多聚腺苷酸化和轉(zhuǎn)錄本的釋放。隨后，聚合酶恢復(fù)掃描并在下游下一個(gè)GS信號(hào)處重新起始轉(zhuǎn)錄。這種被稱為“終止-起始”機(jī)制的轉(zhuǎn)錄策略，導(dǎo)致mRNA豐度呈現(xiàn)位置梯度：靠近3′前導(dǎo)區(qū)的基因（例如NP）轉(zhuǎn)錄更頻繁，而靠近5′尾隨區(qū)的基因（例如L）則由于聚合酶在基因連接處的衰減，其產(chǎn)生水平顯著降低。

相比之下，復(fù)制同樣起始于病毒基因組的3′端，但聚合酶以高度持續(xù)性沿整個(gè)模板進(jìn)行，不響應(yīng)內(nèi)部的順式作用信號(hào)。這導(dǎo)致合并出全長(zhǎng)、未加帽且未多聚腺苷酸化的正義抗原基 因組，該抗原基因組作為產(chǎn)生子代基因組的忠實(shí)互補(bǔ)模板。NPs對(duì)新生病毒RNA的持續(xù)包裹對(duì)于高效復(fù)制至關(guān)重要，它促進(jìn)了功能性RNP的組裝，并保護(hù)病毒RNA免受宿主先天免疫識(shí)別。

MeV RdRP復(fù)合物的冷凍電鏡圖譜與模型概述 （圖片源自 PNAS ）

非分節(jié)段負(fù)鏈RNA病毒（nsNSVs）的病毒RNA合成由RNA依賴性RNA聚合酶（RdRP）復(fù)合體介導(dǎo)。該復(fù)合體在大多數(shù)nsNSVs中包含大蛋白（L）和輔助因子——磷蛋白（P），而在絲狀病毒中則為VP35。L蛋白具備轉(zhuǎn)錄和復(fù)制所需的所有酶活性，包括核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性、用于mRNA加帽的多聚核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶（PRNTase）活性，以及S-腺苷甲硫氨酸（SAM）依賴的N7-鳥苷和2′-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（MTase）活性。輔助因子P或VP35被認(rèn)為能將核蛋白（NP）維持在單體、無RNA結(jié)合的狀態(tài)（N0 P），并促進(jìn)其遞送至聚合酶復(fù)合體，從而確保新生RNA的高效衣殼化，并在復(fù)制過程中支持聚合酶的持續(xù)合成能力。盡管nsNSV RdRP復(fù)合體同時(shí)執(zhí)行轉(zhuǎn)錄和復(fù)制功能，但在這兩種機(jī)制不同的過程之間切換的分子機(jī)制及其調(diào)控仍不甚明了。

已有報(bào)道稱，幾種病毒編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白和宿主因子在這些過程的調(diào)控中發(fā)揮作用。在仙臺(tái)病毒（SeV）、麻疹病毒（MeV）、尼帕病毒（NiV）和人副流感病毒3型（HPIV3）等病毒中，L、P和N基因足以在微型基因組實(shí)驗(yàn)中支持報(bào)告基因的表達(dá)，這表明病毒mRNA的轉(zhuǎn)錄不依賴于額外的病毒因子。C蛋白是一種非結(jié)構(gòu)蛋白，由P mRNA上的一個(gè)替代起始位點(diǎn)翻譯產(chǎn)生，已知其通過拮抗宿主先天免疫信號(hào)通路而作為毒力因子發(fā)揮作用。在MeV、SeV和HPIV1感染過程中，缺乏C蛋白表達(dá)會(huì)強(qiáng)烈誘導(dǎo)產(chǎn)生未衣殼化的回補(bǔ)式缺陷干擾RNA（cbDI-RNAs），這些RNA能有效激活先天免疫應(yīng)答，從而可能限制病毒傳播。除了其免疫調(diào)節(jié)作用外，C蛋白還被認(rèn)為能在復(fù)制過程中增強(qiáng)病毒RNA聚合酶的持續(xù)合成能力；然而，它是否直接作用于聚合酶以及這一調(diào)控的確切機(jī)制尚不清楚。

GHP-88309是另一種通過HTS鑒定的非核苷類化合物，據(jù)報(bào)道能抑制多種副黏病毒（包括MeV、CDV和HPIV3）的聚合酶活性，并導(dǎo)致耐藥突變，這些突變定位在L蛋白中一個(gè)保守的空腔，該位點(diǎn)不同于ERDRP-0519的耐藥位點(diǎn)。這引發(fā)了疑問：GHP-88309是否通過不同的機(jī)制或通過調(diào)節(jié)聚合酶功能來發(fā)揮其抗病毒作用？

在本研究中，作者結(jié)合生化實(shí)驗(yàn)和冷凍電子顯微鏡（cryo-EM）技術(shù)，闡明了MeV RdRP復(fù)合體的結(jié)構(gòu)和調(diào)控機(jī)制。對(duì)apo聚合酶及其與病毒C蛋白復(fù)合體的高分辨率結(jié)構(gòu)解析顯示，C蛋白的結(jié)合穩(wěn)定了L蛋白的C端功能結(jié)構(gòu)域，并將酶鎖定在具有復(fù)制能力的延伸狀態(tài)；而生化數(shù)據(jù)表明，C蛋白優(yōu)先結(jié)合N蛋白以促進(jìn)高效的衣殼化和聚合酶的持續(xù)合成能力。作者進(jìn)一步解析了MeV和NiV聚合酶與小分子抑制劑ERDRP-0519結(jié)合的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示該抑制劑占據(jù)RdRp結(jié)構(gòu)域中一個(gè)保守的變構(gòu)口袋，而非預(yù)測(cè)的PRNTase位點(diǎn)，從而誘導(dǎo)活性位點(diǎn)發(fā)生構(gòu)象變化，阻斷模板和核苷酸的結(jié)合。這些發(fā)現(xiàn)揭示了副黏病毒聚合酶不同的調(diào)控和抑制機(jī)制，并為針對(duì)MeV、NiV及相關(guān)病原體的廣譜抗病毒藥物的合理設(shè)計(jì)提供了結(jié)構(gòu)框架。

原文鏈接：https://doi.org/10.1073/pnas.2522978123

來源： iNature

編輯：吃一口小貓