諾獎(jiǎng)得主最新Science：結(jié)合結(jié)構(gòu)生物學(xué)與進(jìn)化規(guī)律，AI設(shè)計(jì)的最小RNA引導(dǎo)核酸酶

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過(guò)去十余年，CRISPR 技術(shù)不斷刷新人們對(duì)基因編輯的認(rèn)知。從 Cas9 到 Cas12，再到近年來(lái)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)的 Cas12f、Cas14 以及 TnpB 等更小型的 RNA 引導(dǎo)核酸酶，研究人員始終在尋找一種理想的基因編輯工具：它足夠小、足夠精準(zhǔn)，同時(shí)又能保持穩(wěn)定高效的切割能力。

目前應(yīng)用最廣泛的遞送方式之一——腺相關(guān)病毒（AAV）——能夠攜帶的遺傳信息十分有限。許多性能優(yōu)異的核酸酶由于體積過(guò)大，難以與向?qū)?RNA、調(diào)控元件等共同裝入同一個(gè)載體，這也成為限制基因治療發(fā)展的重要因素之一。

過(guò)去，解決這一問(wèn)題的方法主要依賴不斷發(fā)現(xiàn)新的天然蛋白。研究人員在不同微生物中篩選新的 CRISPR 系統(tǒng)，希望找到更小、更容易遞送的新成員。但這種方式很大程度上仍然依賴自然界已經(jīng)存在的答案。

2026 年 7 月 16 日，諾獎(jiǎng)得主Jennifer Doudna團(tuán)隊(duì)提出了一種全新的設(shè)計(jì)思路——Structure- and Evolution-guided Design（結(jié)構(gòu)與進(jìn)化引導(dǎo)設(shè)計(jì)）。他們結(jié)合蛋白質(zhì)進(jìn)化規(guī)律和三維結(jié)構(gòu)信息，對(duì) RNA 引導(dǎo)核酸酶進(jìn)行系統(tǒng)性重構(gòu)，最終設(shè)計(jì)出一系列體積更小、仍保持編輯能力的最小核酸酶。

相關(guān)研究?jī)?nèi)容以「Structure and evolution-guided design of minimal RNA-guided nucleases」為題，發(fā)表在《Science》。

論文鏈接：https://www.science.org/doi/10.1126/science.aed6123

為蛋白做一次減法

CRISPR 技術(shù)的發(fā)展，很長(zhǎng)一段時(shí)間都遵循著同一種模式。

自然界發(fā)現(xiàn)一種新的 RNA 引導(dǎo)核酸酶，研究人員解析它的工作機(jī)制，再嘗試將它應(yīng)用于基因編輯。Cas9、Cas12 乃至近年來(lái)廣受關(guān)注的 TnpB，都遵循著這樣的發(fā)展路線。這種策略取得了巨大成功，卻也存在天然局限。

自然界留下來(lái)的蛋白，是長(zhǎng)期進(jìn)化后的結(jié)果，并不一定完全符合人類應(yīng)用需求。有些蛋白切割效率很高，卻過(guò)于龐大；有些蛋白雖然體積很小，卻難以保持穩(wěn)定活性。如果始終依賴自然界不斷「提供」新的工具，人們能夠選擇的空間終究有限。

論文提出的 Structure- and Evolution-guided Design，建立在「如果已經(jīng)理解了這些核酸酶為什么能夠工作，是否可以直接依據(jù)這些規(guī)律，主動(dòng)設(shè)計(jì)出新的工具」的想法之上，研究目標(biāo)不再是尋找新的蛋白，而是尋找蛋白真正不可替代的部分，再圍繞這些核心結(jié)構(gòu)重新構(gòu)建整個(gè)系統(tǒng)。

圖 1：結(jié)合 ESM 反向折疊（ESM-IF1）模型的 RNA 引導(dǎo)核酸酶 TnpB 設(shè)計(jì)策略。

研究采用 ESM-IF1 逆折疊模型作為基礎(chǔ)骨架生成工具，針對(duì)純逆折疊無(wú)法精準(zhǔn)保留核酸結(jié)合功能位點(diǎn)的問(wèn)題，開發(fā)了基于進(jìn)化信息的殘基固定策略，在保留核心功能的前提下最大化序列多樣性。

但僅靠序列還不夠。研究團(tuán)隊(duì)在對(duì)大量 TnpB、IscB 和 Cas 相關(guān)序列進(jìn)行比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，真正高度保守的往往只是少數(shù)幾個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)，例如負(fù)責(zé) RNA 識(shí)別和催化的核心殘基，而其余區(qū)域則在不同家族中呈現(xiàn)明顯的長(zhǎng)度差異和序列漂移。

隨后，團(tuán)隊(duì)將 TnpB 拆分為 DNA 識(shí)別的 REC 葉、催化 + RNA 結(jié)合的 NUC 葉獨(dú)立設(shè)計(jì)，再兩兩組合測(cè)試，適配兩個(gè)結(jié)構(gòu)域不同的突變?nèi)萑潭取Ｍㄟ^(guò)調(diào)整約束閾值可精準(zhǔn)控制序列與野生型的分化程度，最終生成序列與天然 TnpB 處于獨(dú)立進(jìn)化分支，一致性僅 50%-60%。

圖 2：基于位置保守性和偶聯(lián)強(qiáng)度閾值篩選人工智能生成的 TnpB 變體的富集情況。

按圖構(gòu)建

完成進(jìn)化分析后，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步開始了對(duì) 1980 種 REC-NUC 組合進(jìn)行高通量功能驗(yàn)證。

在這些設(shè)計(jì)中，24% 的設(shè)計(jì)（466 種）具有可檢測(cè)的核酸酶活性，其中 8% 的變體活性超過(guò)野生型 ISDra2 TnpB；雙約束策略比單一保守性約束的活性變體數(shù)量顯著提升。

圖 3：AI 生成的 TnpB 在 HEK293T 細(xì)胞中的基因組編輯。

借助冷凍電鏡解析結(jié)果以及結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模型，研究人員逐步建立起這些功能區(qū)域之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，再依據(jù)前一步得到的進(jìn)化約束，對(duì)不同模塊進(jìn)行重新組合與精簡(jiǎn)，而不是簡(jiǎn)單刪除序列。

AI 生成的殘基在 RNA/DNA 界面形成了全新的靜電與氫鍵網(wǎng)絡(luò)，在不同構(gòu)象下均能穩(wěn)定核酸復(fù)合物；新引入的突變與進(jìn)化保留的核心功能位點(diǎn)互補(bǔ)，共同維持結(jié)合活性。

團(tuán)隊(duì)還解析到野生型 TnpB 中從未觀測(cè)到的 TAM 結(jié)合中間構(gòu)象，該瞬時(shí)態(tài)在 AI 設(shè)計(jì)變體中被穩(wěn)定；由 AI 生成的螺旋區(qū)段完整保留了天然 TnpB 的螺旋彎折構(gòu)象運(yùn)動(dòng)，而這一動(dòng)態(tài)變化是異源雙鏈形成、酶活激活的核心前提，證明逆折疊設(shè)計(jì)未破壞蛋白的功能必需構(gòu)象轉(zhuǎn)換。

圖 4：AI 生成的變體的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)揭示了新的 RNA-DNA 界面殘基和保守的構(gòu)象運(yùn)動(dòng)。

可設(shè)計(jì)空間的拓展

過(guò)去，CRISPR 領(lǐng)域的重要突破往往來(lái)自自然界的新發(fā)現(xiàn)。科學(xué)家不斷尋找新的微生物，希望找到體積更小、性能更好的天然核酸酶，再圍繞這些天然蛋白開展后續(xù)優(yōu)化。

而 Structure- and Evolution-guided Design 提出了另一種可能。研究人員通過(guò)分析長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中哪些結(jié)構(gòu)始終被保留、哪些區(qū)域可以不斷演化，再結(jié)合蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)理解各個(gè)功能模塊之間的關(guān)系，開始主動(dòng)設(shè)計(jì)新的 RNA 引導(dǎo)核酸酶。

這是首次人工設(shè)計(jì)出具備全新核酸接觸位點(diǎn)、高活性的非天然 TnpB 核酸酶，為后續(xù)開發(fā)更小、更精準(zhǔn)、活性更優(yōu)的編輯工具提供了新路徑。