Phytomedicine (IF=11.3，TOP)｜白芍總苷抑制頭頸鱗癌：靶向SLC7A5阻斷亮氨酸攝取，進(jìn)而壓制mTOR信號(hào)通路！(李清林/賈興—浙江省立同德)

2026年7月11日，浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬浙江省立同德醫(yī)院李清林團(tuán)隊(duì)、浙江省腫瘤醫(yī)院賈興團(tuán)隊(duì)等，在Phytomedicine （中科院1區(qū)，TOP期刊，IF=11.3）在線發(fā)表題為“Total Glucosides of Paeony modulates leucine metabolism by inhibiting SLC7A5, antagonizing mTOR signaling to suppress head and neck squamous cell carcinoma”的研究論文。該文于2026年1月21日投稿，2026年7月6日修回，2026年7月9日接收。

頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（HNSCC）具有復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和治療耐受等臨床難題。該研究聚焦天然藥物活性提取物白芍總苷（TGP），系統(tǒng)評(píng)估其對(duì)HNSCC細(xì)胞增殖、遷移、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和凋亡的影響，并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、WGCNA、LASSO機(jī)器學(xué)習(xí)、單細(xì)胞RNA測(cè)序、分子對(duì)接、HPLC成分驗(yàn)證、異種移植瘤和同系小鼠模型，解析其潛在抗腫瘤機(jī)制。

研究發(fā)現(xiàn)，TGP可下調(diào)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SLC7A5，減少細(xì)胞內(nèi)亮氨酸攝取，進(jìn)一步降低亮氨酸代謝產(chǎn)物α-酮異己酸（KIC）水平，并抑制mTOR/ULK1/S6K信號(hào)通路，從而限制HNSCC細(xì)胞增殖和遷移。SLC7A5過(guò)表達(dá)或mTOR激活劑MHY1485可削弱TGP的抑制作用，而SLC7A5敲低則可模擬TGP的抗腫瘤表型。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)還提示，TGP在抑制腫瘤生長(zhǎng)的同時(shí)可改善免疫抑制性腫瘤微環(huán)境。需要注意的是，該研究主要基于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和小鼠模型，不能直接等同于人體臨床療效。

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【摘 要】

背景：頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）是全球重要健康挑戰(zhàn)之一，其特點(diǎn)包括患者生存率較低、轉(zhuǎn)移發(fā)生頻繁。傳統(tǒng)治療常受到全身毒性和耐藥性的限制，因此，白芍總苷（Total Glucosides of Paeony，TGP）等天然生物活性提取物被認(rèn)為具有潛在治療價(jià)值。氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SLC7A5已被證明可通過(guò)促進(jìn)亮氨酸攝取并激活mTOR信號(hào)通路來(lái)驅(qū)動(dòng)腫瘤增殖，但TGP與HNSCC中SLC7A5/mTOR軸之間的具體關(guān)系尚未完全闡明。

目的：本研究旨在評(píng)價(jià)TGP對(duì)HNSCC的抑制作用，并探討其潛在分子機(jī)制。

方法：研究采用人源HNSCC細(xì)胞系CAL27、FADU和小鼠HNSCC細(xì)胞系SCC7，通過(guò)多維表型實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)TGP的抗腫瘤作用，其中包括Western blot檢測(cè)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）標(biāo)志物。研究進(jìn)一步結(jié)合加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）、最小絕對(duì)收縮和選擇算子（least absolute shrinkage and selection operator，LASSO）以及單細(xì)胞RNA測(cè)序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）篩選核心靶點(diǎn)，并通過(guò)分子對(duì)接進(jìn)行結(jié)構(gòu)模擬，再利用患者組織芯片進(jìn)行驗(yàn)證。體內(nèi)研究則在多個(gè)細(xì)胞來(lái)源異種移植瘤和同系小鼠模型中評(píng)價(jià)劑量-反應(yīng)關(guān)系及救援實(shí)驗(yàn)，并結(jié)合下游代謝檢測(cè)和免疫表型流式分析。

結(jié)果：TGP可劑量依賴(lài)性抑制HNSCC細(xì)胞增殖、遷移和EMT進(jìn)程，同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，TGP在三種細(xì)胞來(lái)源模型中均可限制腫瘤體積和重量，且未觀察到明顯系統(tǒng)性細(xì)胞毒性。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)合WGCNA和LASSO分析確定SLC7A5是TGP作用于HNSCC的重要靶點(diǎn)。機(jī)制上，TGP抑制SLC7A5及其下游亮氨酸代謝酶BCAT1、BCKDHA和BCKDHB的表達(dá)，從而降低代謝物α-酮異己酸（α-ketoisocaproate，KIC）水平，并關(guān)閉mTOR信號(hào)級(jí)聯(lián)。SLC7A5敲低可復(fù)制TGP產(chǎn)生的治療表型，而SLC7A5過(guò)表達(dá)或mTOR激動(dòng)劑MHY1485可有效削弱這些效應(yīng)。此外，TGP還可在體內(nèi)重塑免疫抑制性腫瘤微環(huán)境。

結(jié)論：TGP通過(guò)靶向SLC7A5降低亮氨酸攝取，從而抑制mTOR信號(hào)軸活性，進(jìn)而抑制HNSCC增殖。

01

研究背景及科學(xué)問(wèn)題

頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（HNSCC）主要發(fā)生于頭頸部黏膜上皮組織，例如口腔、咽部和喉部，是全球常見(jiàn)惡性腫瘤之一。近年來(lái)，HNSCC治療策略已逐漸從傳統(tǒng)手術(shù)聯(lián)合放化療，轉(zhuǎn)向包含靶向治療、免疫檢查點(diǎn)抑制劑和細(xì)胞治療在內(nèi)的綜合治療模式。然而，患者總體生存改善仍不理想。局部晚期HNSCC患者5年生存率仍約為50%，且超過(guò)半數(shù)患者在接受根治性同步放化療后出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，給臨床治療帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)。

當(dāng)前HNSCC治療仍面臨多重限制。首先，放療和化療對(duì)正常組織的損傷限制了治療劑量強(qiáng)度，導(dǎo)致療效不足。其次，以PD-1抑制劑為代表的免疫檢查點(diǎn)阻斷療法雖然帶來(lái)一定希望，但在鉑耐藥復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移性HNSCC中的應(yīng)答率仍然較低。第三，即使將抗EGFR單克隆抗體等靶向治療納入標(biāo)準(zhǔn)治療方案，患者獲得的生存獲益仍有限，且最終不可避免出現(xiàn)耐藥。因此，探索替代或輔助治療策略具有重要意義。

天然植物來(lái)源生物活性成分因具有多靶點(diǎn)、多通路調(diào)控能力以及相對(duì)較好的安全性，正成為越來(lái)越受關(guān)注的研究方向。白芍總苷（TGP）是從芍藥Paeonia lactiflora Pall.干燥根中提取的活性成分復(fù)合物，主要由單萜苷類(lèi)成分組成，包括芍藥苷、白芍內(nèi)酯苷、氧化芍藥苷和苯甲酰芍藥苷等，其中芍藥苷約占60%—90%。現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，TGP具有多種生物活性，包括抑制自身免疫反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫平衡和抑制腫瘤細(xì)胞增殖等。然而，TGP在HNSCC中的研究仍較少。作者認(rèn)為，TGP在HNSCC治療中可能通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境和抑制腫瘤增殖發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步明確。

溶質(zhì)載體家族7成員5（solute carrier family 7 member 5，SLC7A5），又稱(chēng)L型氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（L-type amino acid transporter 1，LAT1），是一種定位于細(xì)胞膜的大型中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。SLC7A5是必需氨基酸進(jìn)入細(xì)胞的重要通路，可介導(dǎo)亮氨酸、谷氨酰胺和芳香族氨基酸等物質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。在腫瘤微環(huán)境中，SLC7A5常出現(xiàn)異常高表達(dá)，并已在乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌和膽囊癌等多種惡性腫瘤中被檢測(cè)到高水平表達(dá)。

既往研究表明，SLC7A5高表達(dá)可顯著增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞攝取必需氨基酸的能力，為腫瘤快速生長(zhǎng)和增殖提供營(yíng)養(yǎng)基礎(chǔ)。腫瘤細(xì)胞高度依賴(lài)SLC7A5介導(dǎo)的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)，即使在營(yíng)養(yǎng)受限的腫瘤微環(huán)境中，也能夠獲取必需氨基酸，維持惡性生長(zhǎng)和增殖活性，從而獲得獨(dú)特的生存優(yōu)勢(shì)。

亮氨酸是一種關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)信號(hào)分子，可通過(guò)SLC7A5進(jìn)入細(xì)胞。亮氨酸與感受蛋白Sestrin2結(jié)合后，可激活哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體1（mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1）信號(hào)通路。mTORC1是調(diào)控細(xì)胞合成代謝的重要通路，可通過(guò)兩條途徑促進(jìn)蛋白質(zhì)合成：一是通過(guò)磷酸化使真核翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1（4E-BP1）失活，二是通過(guò)磷酸化激活核糖體蛋白S6激酶1（S6K1）。mTORC1參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)合成、細(xì)胞增殖和血管生成，最終推動(dòng)腫瘤細(xì)胞異常增殖。SLC7A5過(guò)表達(dá)的腫瘤細(xì)胞通常具有更強(qiáng)的亮氨酸攝取能力，過(guò)量亮氨酸進(jìn)一步激活mTOR信號(hào)通路，加速細(xì)胞周期進(jìn)展并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞惡性增殖。

本研究系統(tǒng)考察TGP對(duì)HNSCC的抑制作用及其潛在機(jī)制。研究結(jié)果提示，TGP可通過(guò)下調(diào)SLC7A5表達(dá)，降低細(xì)胞內(nèi)亮氨酸水平，從而抑制mTOR信號(hào)通路并發(fā)揮抗HNSCC作用。

02

重要發(fā)現(xiàn)及亮點(diǎn)

TGP抑制HNSCC細(xì)胞增殖、遷移和EMT，并誘導(dǎo)凋亡

研究首先檢測(cè)TGP對(duì)HNSCC細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示，TGP在不同HNSCC細(xì)胞系中的半數(shù)抑制濃度（IC??）分別為：CAL27細(xì)胞1659 μg/mL、FADU細(xì)胞1145 μg/mL、SCC7細(xì)胞802.9 μg/mL。基于這些結(jié)果，研究設(shè)置不同的低劑量和高劑量TGP處理濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示，TGP可劑量依賴(lài)性抑制HNSCC細(xì)胞增殖。EdU染色進(jìn)一步表明，隨著TGP濃度升高，代表增殖細(xì)胞的綠色熒光信號(hào)逐漸減弱。克隆形成實(shí)驗(yàn)也顯示，TGP顯著降低HNSCC細(xì)胞形成克隆的能力，說(shuō)明其可有效抑制細(xì)胞增殖。

隨后，研究采用Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)評(píng)估TGP對(duì)HNSCC細(xì)胞遷移能力的影響。結(jié)果顯示，TGP處理48小時(shí)后，遷移細(xì)胞數(shù)量顯著減少，并呈濃度依賴(lài)趨勢(shì)。劃痕實(shí)驗(yàn)也支持這一結(jié)果。在分子水平上，TGP降低間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin的蛋白表達(dá)，提示TGP可抑制EMT過(guò)程。此外，Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)顯示，TGP處理可誘導(dǎo)明顯細(xì)胞凋亡。為排除非特異性培養(yǎng)環(huán)境因素干擾，研究還檢測(cè)了含不同濃度TGP培養(yǎng)基的pH值和滲透壓，發(fā)現(xiàn)TGP未顯著改變培養(yǎng)基pH和滲透壓。

圖1：TGP抑制HNSCC細(xì)胞增殖、遷移，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。（A）CAL27、FADU和SCC7細(xì)胞經(jīng)溶劑對(duì)照（Control）、低劑量TGP（TGP-low）和高劑量TGP（TGP-high）處理后，通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖曲線。（B）EdU摻入實(shí)驗(yàn)代表性圖像，顯示不同處理?xiàng)l件下的增殖細(xì)胞；綠色表示EdU，藍(lán)色表示Hoechst。（C）克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示HNSCC細(xì)胞的克隆存活能力。（D）Transwell遷移實(shí)驗(yàn)顯示TGP處理后細(xì)胞遷移減少。（E）Western blot分析EMT標(biāo)志物N-Cadherin和Vimentin，β-ACTIN作為上樣內(nèi)參。（F）HNSCC細(xì)胞經(jīng)Annexin V-FITC/PI染色后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)凋亡分析，并對(duì)凋亡率進(jìn)行定量。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

SLC7A5被確定為T(mén)GP抑制HNSCC的重要靶點(diǎn)

為探索TGP抑制HNSCC的潛在機(jī)制，研究對(duì)TGP或PBS處理48小時(shí)后的HNSCC細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。通過(guò)DESeq2標(biāo)準(zhǔn)化差異表達(dá)分析，比較不同處理組之間的基因表達(dá)變化。研究將高劑量TGP相對(duì)對(duì)照組下調(diào)基因、低劑量TGP相對(duì)對(duì)照組下調(diào)基因，以及高劑量TGP相對(duì)低劑量TGP進(jìn)一步下調(diào)基因取交集，最終獲得77個(gè)TGP相關(guān)基因。

為識(shí)別與HNSCC直接相關(guān)的基因，研究下載TCGA-HNSC轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，其中包括520個(gè)腫瘤樣本和44個(gè)正常樣本，并采用WGCNA構(gòu)建基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。分析顯示，綠色模塊包含609個(gè)基因，與腫瘤表型具有最高絕對(duì)相關(guān)系數(shù)，因此被定義為HNSCC腫瘤相關(guān)關(guān)鍵模塊。KEGG富集分析顯示，該模塊基因與代謝通路、PI3K-AKT通路、MAPK信號(hào)通路和mTOR通路相關(guān)。

隨后，研究對(duì)綠色模塊中的基因進(jìn)行LASSO機(jī)器學(xué)習(xí)回歸篩選，最終識(shí)別出33個(gè)候選基因。進(jìn)一步通過(guò)Cox回歸分析建立由10個(gè)基因構(gòu)成的預(yù)后特征，包括PTK7、GNA12、VDR、SLC7A5、EXTL3、COL4A5、KLF7、FADS3、RRAGD和SEMA4D。該風(fēng)險(xiǎn)模型可區(qū)分高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)患者，高風(fēng)險(xiǎn)組死亡率更高、生存時(shí)間更短。模型在1年、3年、5年和10年總體生存預(yù)測(cè)中的AUC分別為0.64、0.69、0.59和0.73。

最后，將LASSO篩選基因與TGP相關(guān)基因交叉分析，獲得兩個(gè)關(guān)鍵基因：SLC7A5和SLC3A2。SLC7A5是重要氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可與SLC3A2通過(guò)二硫鍵形成異二聚體，維持其細(xì)胞膜定位并執(zhí)行氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)功能。在TCGA-HNSC數(shù)據(jù)庫(kù)中，SLC7A5在腫瘤組織中高表達(dá)。生存分析顯示，SLC7A5高表達(dá)患者生存時(shí)間顯著短于低表達(dá)患者。GSE37991、GSE30784、GSE23558和GSE107591四個(gè)外部數(shù)據(jù)集也一致驗(yàn)證了SLC7A5在HNSCC腫瘤組織中較正常組織顯著升高。

組織芯片免疫組化進(jìn)一步證實(shí)，SLC7A5蛋白在HNSCC腫瘤組織中較配對(duì)癌旁正常組織明顯上調(diào)。根據(jù)KI-67和SLC7A5染色強(qiáng)度對(duì)HNSCC標(biāo)本進(jìn)行分層后，研究觀察到二者表達(dá)存在一致趨勢(shì)：SLC7A5低表達(dá)組織中KI-67陽(yáng)性較少，而SLC7A5高表達(dá)組織中KI-67陽(yáng)性增殖細(xì)胞明顯增多。這提示SLC7A5高表達(dá)與HNSCC腫瘤細(xì)胞高增殖狀態(tài)密切相關(guān)。

圖2：SLC7A5是TGP抑制HNSCC的重要靶點(diǎn)。（A）實(shí)驗(yàn)流程圖。（B）差異表達(dá)基因火山圖。（C）77個(gè)TGP相關(guān)基因的篩選過(guò)程。（D）WGCNA分析。（E）KEGG分析。（F）LASSO回歸分析。（G）LASSO篩選基因與TGP相關(guān)基因集（TRGS）的交叉分析。（H）TCGA-HNSC數(shù)據(jù)庫(kù)中SLC7A5表達(dá)分析。（I）TCGA-HNSC數(shù)據(jù)庫(kù)中SLC7A5的生存分析。（J）GSE37991、GSE30784、GSE23558和GSE107591數(shù)據(jù)庫(kù)中SLC7A5表達(dá)分析。

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組揭示HNSCC中SLC7A5的細(xì)胞類(lèi)型特異性上調(diào)

雖然bulk轉(zhuǎn)錄組已證實(shí)SLC7A5在HNSCC中的總體上調(diào)及預(yù)后意義，但整體測(cè)序平均效應(yīng)可能掩蓋腫瘤內(nèi)部異質(zhì)性和不同細(xì)胞類(lèi)型中的分布差異。為在單細(xì)胞水平解析SLC7A5表達(dá)結(jié)構(gòu)，研究分析了GSE181919單細(xì)胞RNA測(cè)序數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集包含HNSCC病灶及正常對(duì)照組織中大量單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組信息。

無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)和UMAP可視化將腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞分為12類(lèi)細(xì)胞譜系，包括B細(xì)胞、漿細(xì)胞、CD4+ T細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞、增殖性T細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、脂質(zhì)相關(guān)巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞。各細(xì)胞類(lèi)型身份通過(guò)經(jīng)典譜系標(biāo)志物表達(dá)得到驗(yàn)證。與正常組織相比，腫瘤組織中的細(xì)胞組成發(fā)生明顯重塑，其中上皮細(xì)胞等細(xì)胞群比例發(fā)生變化。

SLC7A5表達(dá)具有明顯異質(zhì)性。整體來(lái)看，SLC7A5在多種基質(zhì)細(xì)胞中基線表達(dá)較低，但在T細(xì)胞亞群中相對(duì)富集，尤其是在CD4+和CD8+ T細(xì)胞中更明顯。進(jìn)一步比較正常與癌組織顯示，SLC7A5在惡性來(lái)源上皮細(xì)胞和腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D8+ T細(xì)胞中選擇性且顯著上調(diào)。

研究還將癌組織中的惡性上皮細(xì)胞分為SLC7A5高表達(dá)和低表達(dá)亞群進(jìn)行富集分析。結(jié)果顯示，SLC7A5高表達(dá)亞群富集G2M檢查點(diǎn)、EMT、血管生成、缺氧和膽固醇穩(wěn)態(tài)等高增殖和侵襲性腫瘤特征，同時(shí)伴隨部分代謝處理通路抑制。KEGG分析進(jìn)一步顯示，上調(diào)基因富集于細(xì)胞周期、黏著斑和癌癥蛋白聚糖等通路。GO細(xì)胞組分分析顯示，SLC7A5高表達(dá)與細(xì)胞-基質(zhì)連接、黏著斑、紡錘體和染色體區(qū)域等結(jié)構(gòu)相關(guān)過(guò)程增強(qiáng)有關(guān)，提示其與腫瘤細(xì)胞有絲分裂和結(jié)構(gòu)重塑密切相關(guān)。

圖3：?jiǎn)渭?xì)胞RNA測(cè)序分析揭示人HNSCC組織中SLC7A5表達(dá)具有細(xì)胞類(lèi)型特異性。（A）UMAP圖顯示數(shù)據(jù)集中所有細(xì)胞的細(xì)胞類(lèi)型注釋。（B）熱圖顯示已鑒定細(xì)胞類(lèi)型中標(biāo)志基因表達(dá)情況。（C）UMAP圖比較正常組織（NL）和癌組織（CA）之間的細(xì)胞類(lèi)型分布。（D）柱狀圖顯示NL組和CA組中各細(xì)胞類(lèi)型的相對(duì)比例。（E）UMAP圖顯示SLC7A5表達(dá)細(xì)胞的分布。（F）小提琴圖顯示不同細(xì)胞類(lèi)型中SLC7A5表達(dá)水平。（G）UMAP圖顯示NL和CA組織中SLC7A5表達(dá)情況。（H）小提琴圖比較NL組和CA組中上皮細(xì)胞（左）及CD8+ T細(xì)胞（右）的SLC7A5表達(dá)。

TGP在體內(nèi)外下調(diào)SLC7A5并抑制亮氨酸代謝

Western blot和qRT-PCR結(jié)果顯示，TGP可劑量依賴(lài)性降低CAL27、FADU和SCC7細(xì)胞中SLC7A5蛋白和mRNA表達(dá)。鑒于SLC7A5是大型中性氨基酸，尤其是亮氨酸攝取的主要功能轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，研究進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)亮氨酸含量。結(jié)果顯示，TGP顯著耗竭細(xì)胞內(nèi)亮氨酸池，說(shuō)明TGP介導(dǎo)的SLC7A5抑制確實(shí)會(huì)削弱HNSCC細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)攝取。

為了判斷SLC7A5抑制導(dǎo)致的亮氨酸攝取下降是否會(huì)影響下游代謝處理，研究檢測(cè)支鏈氨基酸（branched-chain amino acid，BCAA）分解代謝級(jí)聯(lián)關(guān)鍵組分。TGP顯著降低支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶1（BCAT1）以及支鏈α-酮酸脫氫酶復(fù)合物核心亞基BCKDHA和BCKDHB的蛋白表達(dá)。與此一致，亮氨酸經(jīng)BCAT1轉(zhuǎn)氨生成的直接下游代謝物KIC在TGP處理后呈劑量依賴(lài)性降低。

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方面，研究建立CAL27和FADU來(lái)源異種移植瘤模型。腫瘤照片、生長(zhǎng)曲線和腫瘤重量均顯示，TGP可在兩種模型中劑量依賴(lài)性抑制腫瘤生長(zhǎng)。Ki-67和SLC7A5免疫組化進(jìn)一步證實(shí)，TGP可抑制腫瘤組織增殖并降低SLC7A5表達(dá)。腫瘤組織Western blot也驗(yàn)證了TGP對(duì)SLC7A5蛋白表達(dá)的抑制作用。腫瘤組織亮氨酸水平熱圖顯示，TGP在體內(nèi)同樣明顯降低亮氨酸積累。

研究還采用人SLC7A5高分辨率冷凍電鏡結(jié)構(gòu)（PDB: 8XPU）進(jìn)行虛擬篩選和分子對(duì)接，以闡明TGP活性成分與SLC7A5之間的直接結(jié)合關(guān)系。基于既往質(zhì)譜和SwissADME分析確定的21種TGP藥物樣成分，結(jié)果顯示三種主要單萜苷類(lèi)成分——苯甲酰芍藥苷、芍藥苷和白芍內(nèi)酯苷——與SLC7A5表現(xiàn)出較強(qiáng)結(jié)合潛力，結(jié)合能分別為?12.234 kcal/mol、?11.036 kcal/mol和?10.832 kcal/mol。三維對(duì)接模型和二維相互作用圖顯示，這些成分可穩(wěn)定結(jié)合SLC7A5功能性底物結(jié)合口袋，并與PHE-252、ALA-253、TYR-254、ASN-404、ILE-63、GLY-65和SER-66等關(guān)鍵氨基酸殘基形成氫鍵和疏水作用。

為驗(yàn)證計(jì)算預(yù)測(cè)并確認(rèn)TGP化學(xué)組成，研究進(jìn)一步開(kāi)展HPLC分析。TGP在230 nm下呈現(xiàn)多峰特征色譜圖。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間比較，研究確認(rèn)TGP樣品中存在分子對(duì)接排名靠前的三種成分：芍藥苷、苯甲酰芍藥苷和白芍內(nèi)酯苷。這不僅驗(yàn)證了TGP樣品的化學(xué)組成和質(zhì)量，也從實(shí)驗(yàn)層面證實(shí)預(yù)測(cè)的活性成分確實(shí)存在于該草藥混合物中。

在免疫完整環(huán)境中，研究進(jìn)一步建立SCC7同系皮下腫瘤模型。與CAL27和FADU異種移植瘤結(jié)果一致，TGP顯著降低腫瘤體積和重量。流式細(xì)胞術(shù)顯示，TGP顯著降低區(qū)域淋巴結(jié)和原發(fā)腫瘤組織中SLC7A5平均熒光強(qiáng)度。腫瘤微環(huán)境免疫表型分析顯示，TGP可將免疫抑制性生態(tài)位重塑為更活躍的抗腫瘤表型，表現(xiàn)為功能性CD4+和CD8+ T細(xì)胞、M1巨噬細(xì)胞（CD11b+F4/80+CD86+）浸潤(rùn)增加，同時(shí)促腫瘤Treg細(xì)胞（CD4+CD25+FOXP3+）和M2巨噬細(xì)胞（CD11b+F4/80+CD206+）減少。腹股溝淋巴結(jié)中效應(yīng)CD4+和CD8+ T細(xì)胞也擴(kuò)增，而Treg比例下降。主要器官H&E染色未觀察到明顯組織學(xué)損傷，支持TGP在該實(shí)驗(yàn)條件下具有較好的體內(nèi)安全性。

圖4：TGP在HNSCC異種移植瘤模型中抑制腫瘤生長(zhǎng)、下調(diào)SLC7A5表達(dá)并降低亮氨酸水平。（A）CAL27、FADU和SCC7細(xì)胞經(jīng)溶劑對(duì)照（Control）、低劑量TGP（TGP-low）或高劑量TGP（TGP-high）處理后，SLC7A5蛋白表達(dá)的Western blot分析，β-ACTIN作為上樣內(nèi)參。（B—C）在相同處理?xiàng)l件下，三種細(xì)胞系中SLC7A5 mRNA表達(dá)的qRT-PCR定量分析。（D）TGP處理后，CAL27、FADU和SCC7細(xì)胞培養(yǎng)上清中亮氨酸濃度。（E、H）CAL27（E）和FADU（H）異種移植瘤小鼠經(jīng)溶劑、TGP 20 mg/kg或TGP 40 mg/kg處理后，剝離腫瘤的代表性圖像。（F、I）CAL27（F）和FADU（I）異種移植瘤模型中，腫瘤體積隨時(shí)間變化的生長(zhǎng)曲線。（G、J）CAL27（G）和FADU（J）異種移植瘤實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)測(cè)得的腫瘤重量。（K、L）CAL27（K）和FADU（L）腫瘤組織中Ki-67（增殖標(biāo)志物）和SLC7A5免疫組織化學(xué)染色。（M）CAL27和FADU異種移植瘤組織中SLC7A5蛋白表達(dá)的Western blot分析。（N）熱圖顯示CAL27、FADU和SCC7異種移植瘤組織在不同處理?xiàng)l件下的亮氨酸濃度。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

圖5：白芍總苷（TGP）及其標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC化學(xué)譜圖。（A）TGP在230 nm下的HPLC色譜圖，顯示該草藥混合物的特征化學(xué)譜圖。圖中標(biāo)注了對(duì)應(yīng)三種已鑒定植物化學(xué)成分的峰。（B—D）標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖：（B）芍藥苷（保留時(shí)間RT=7.74 min）；（C）苯甲酰芍藥苷（RT=11.77 min）；（D）白芍內(nèi)酯苷（RT=7.55 min）。TGP混合物與標(biāo)準(zhǔn)品之間的保留時(shí)間匹配確認(rèn)了這些植物化學(xué)成分的身份。色譜條件：C18柱，20 min內(nèi)5%—98% B梯度洗脫，230 nm檢測(cè)，進(jìn)樣體積10 μL。

SLC7A5過(guò)表達(dá)可逆轉(zhuǎn)TGP對(duì)HNSCC的抑制作用

為驗(yàn)證TGP是否通過(guò)下調(diào)SLC7A5抑制HNSCC，研究開(kāi)展SLC7A5過(guò)表達(dá)補(bǔ)償實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞分為四組：G1為Control組，轉(zhuǎn)染1 μg/mL對(duì)照質(zhì)粒；G2為T(mén)GP組，轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒后接受TGP處理48小時(shí)；G3為OE-SLC7A5組，轉(zhuǎn)染1 μg/mL SLC7A5過(guò)表達(dá)質(zhì)粒；G4為OE-SLC7A5+TGP組，轉(zhuǎn)染SLC7A5過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后再接受TGP處理48小時(shí)。

mRNA和蛋白結(jié)果顯示，G3組較G1組顯著上調(diào)SLC7A5表達(dá)；G4組較G2組也顯著提高SLC7A5表達(dá)，提示SLC7A5表達(dá)獲得部分恢復(fù)。功能實(shí)驗(yàn)顯示，G3組較G1組顯著增強(qiáng)HNSCC細(xì)胞增殖、克隆形成和遷移能力；而G4組較G2組也明顯恢復(fù)這些生物學(xué)特性。SLC7A5過(guò)表達(dá)還顯著增加細(xì)胞內(nèi)亮氨酸含量，G4組較TGP單獨(dú)處理組亮氨酸水平明顯回升。

由于細(xì)胞內(nèi)亮氨酸是激活mTOR信號(hào)軸的重要上游觸發(fā)因素，研究進(jìn)一步檢測(cè)mTOR/ULK1通路。結(jié)果顯示，TGP誘導(dǎo)的mTOR/ULK1通路抑制在SLC7A5過(guò)表達(dá)后明顯被重新激活，表現(xiàn)為p-mTOR、p-ULK1和p-S6K磷酸化水平恢復(fù)。TGP對(duì)EMT過(guò)程的阻斷也在SLC7A5上調(diào)后被逆轉(zhuǎn)。上述結(jié)果表明，SLC7A5異位過(guò)表達(dá)可抵消TGP對(duì)HNSCC細(xì)胞的內(nèi)在抑制效應(yīng)。

體內(nèi)驗(yàn)證方面，TGP在CAL27、FADU和SCC7模型中均可劑量依賴(lài)性抑制腫瘤組織中mTOR、ULK1和S6K磷酸化。隨后，研究在FADU異種移植瘤模型中進(jìn)行體內(nèi)救援實(shí)驗(yàn)。腫瘤形態(tài)、腫瘤體積曲線和終點(diǎn)腫瘤重量均顯示，SLC7A5過(guò)表達(dá)顯著削弱TGP的治療效應(yīng)，使腫瘤生長(zhǎng)明顯恢復(fù)。免疫組化顯示，與TGP單獨(dú)處理相比，OE+TGP組SLC7A5免疫反應(yīng)和Ki-67增殖指數(shù)均明顯恢復(fù)。腫瘤組織Western blot也證實(shí)，SLC7A5過(guò)表達(dá)可恢復(fù)被TGP壓低的p-mTOR、p-ULK1和p-S6K水平。這些結(jié)果說(shuō)明，TGP在體內(nèi)的抗腫瘤活性依賴(lài)其對(duì)SLC7A5/mTOR信號(hào)軸的干擾。

圖6：SLC7A5過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)TGP對(duì)HNSCC的抑制作用。（A）四個(gè)實(shí)驗(yàn)組示意圖：G1，Control；G2，TGP處理；G3，SLC7A5過(guò)表達(dá)（OE-SLC7A5）；G4，SLC7A5過(guò)表達(dá)聯(lián)合TGP處理（OE-SLC7A5+TGP）。（B）CAL27、FADU和SCC7細(xì)胞中SLC7A5蛋白表達(dá)的代表性Western blot圖像（左）及相應(yīng)定量分析（右）。GAPDH作為上樣內(nèi)參。（C）CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)四種處理?xiàng)l件下HNSCC細(xì)胞增殖曲線。（D）克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示HNSCC細(xì)胞克隆存活能力。（E）Transwell遷移實(shí)驗(yàn)顯示HNSCC細(xì)胞遷移能力。（F）不同處理?xiàng)l件下CAL27、FADU和SCC7細(xì)胞培養(yǎng)上清中的亮氨酸濃度。（G）mTOR/ULK1通路關(guān)鍵蛋白p-mTOR、mTOR、p-ULK1、ULK1、p-S6K和S6K的代表性Western blot圖像，GAPDH作為上樣內(nèi)參。（H）熱圖顯示mTOR/ULK1通路中磷酸化蛋白/總蛋白比值的定量分析。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

圖7：SLC7A5過(guò)表達(dá)在HNSCC異種移植瘤模型中挽救TGP的抗腫瘤效應(yīng)。（A）CAL27、FADU和SCC7細(xì)胞經(jīng)溶劑對(duì)照（Control）、TGP 20 mg/kg或TGP 40 mg/kg處理后，mTOR通路相關(guān)蛋白p-mTOR、mTOR、p-ULK1、ULK1、p-S6K和S6K的代表性Western blot圖像。GAPDH作為上樣內(nèi)參。（B）四組小鼠剝離腫瘤的代表性圖像：Control、TGP、OE-SLC7A5和OE-SLC7A5+TGP（OE+TGP）。（C）四個(gè)處理組中腫瘤體積隨時(shí)間變化的生長(zhǎng)曲線。（D）實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)測(cè)得的腫瘤重量。（E）四組腫瘤組織中SLC7A5和Ki-67免疫組織化學(xué)染色。（F）四組腫瘤組織中mTOR通路相關(guān)蛋白的Western blot分析。GAPDH作為上樣內(nèi)參。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

SLC7A5敲低可模擬TGP的抗腫瘤效應(yīng)

為進(jìn)一步確認(rèn)TGP通過(guò)下調(diào)SLC7A5發(fā)揮抑制作用，研究使用小干擾RNA（siRNA）敲低SLC7A5，觀察該操作是否能模擬TGP的抗腫瘤效應(yīng)。細(xì)胞分為三組：G1組轉(zhuǎn)染50 nM陰性對(duì)照siRNA；G2組轉(zhuǎn)染50 nM陰性對(duì)照siRNA后接受TGP處理48小時(shí)；G3組轉(zhuǎn)染50 nM SLC7A5-siRNA。

與G1組相比，G2和G3組SLC7A5表達(dá)均顯著下調(diào)。SLC7A5沉默顯著抑制細(xì)胞增殖、克隆形成和遷移，其表型變化與TGP處理高度一致。SLC7A5敲低還導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)亮氨酸含量顯著下降。Western blot顯示，SLC7A5敲低顯著抑制mTOR、ULK1和S6K磷酸化，從而使mTOR/ULK1信號(hào)通路失活，這與TGP產(chǎn)生的抑制作用高度一致。此外，SLC7A5敲低也降低EMT標(biāo)志物蛋白水平，其抑制作用與TGP處理相當(dāng)。進(jìn)一步研究顯示，SLC7A5過(guò)表達(dá)會(huì)降低HNSCC細(xì)胞對(duì)TGP的敏感性，而SLC7A5敲低會(huì)增強(qiáng)TGP敏感性，提示SLC7A5是決定TGP反應(yīng)的重要因素。

圖8：SLC7A5敲低模擬TGP的抗腫瘤效應(yīng)，并抑制HNSCC細(xì)胞中的mTOR通路。（A）三個(gè)實(shí)驗(yàn)組示意圖：G1，Control；G2，TGP處理；G3，SLC7A5敲低（si-SLC7A5）。（B）CAL27、FADU和SCC7細(xì)胞中SLC7A5蛋白表達(dá)的代表性Western blot圖像（左）及相應(yīng)定量分析（右）。β-ACTIN作為上樣內(nèi)參。（C）CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)三種處理?xiàng)l件下HNSCC細(xì)胞增殖曲線。（D）克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示HNSCC細(xì)胞克隆存活能力。（E）Transwell遷移實(shí)驗(yàn)顯示HNSCC細(xì)胞遷移能力。（F）不同處理?xiàng)l件下CAL27、FADU和SCC7細(xì)胞培養(yǎng)上清中的亮氨酸濃度。（G）mTOR/ULK1通路關(guān)鍵蛋白p-mTOR、mTOR、p-ULK1、ULK1、p-S6K和S6K的代表性Western blot圖像，GAPDH作為上樣內(nèi)參。（H）熱圖顯示mTOR/ULK1通路中磷酸化蛋白/總蛋白比值的定量分析。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

TGP抑制HNSCC依賴(lài)mTOR信號(hào)軸調(diào)控

考慮到mTOR通路在細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)中的關(guān)鍵作用，研究推測(cè)TGP介導(dǎo)的HNSCC抑制依賴(lài)該信號(hào)軸。為驗(yàn)證因果關(guān)系，研究使用特異性mTOR激動(dòng)劑MHY1485進(jìn)行藥理學(xué)擾動(dòng)實(shí)驗(yàn)。

結(jié)果顯示，MHY1485重新激活mTOR通路后，可顯著削弱TGP對(duì)細(xì)胞增殖、克隆形成和遷移能力的抑制。Western blot也證實(shí)，MHY1485可恢復(fù)被TGP抑制的p-mTOR、p-ULK1和p-S6K磷酸化水平。相反，使用特異性mTOR抑制劑雷帕霉素可復(fù)制TGP產(chǎn)生的腫瘤抑制效應(yīng)，進(jìn)一步支持mTOR軸在HNSCC進(jìn)展中具有重要作用。

圖9：MHY1485激活mTOR信號(hào)可逆轉(zhuǎn)TGP在HNSCC細(xì)胞中的抗增殖和抗克隆形成作用。（A）CAL27、FADU和SCC7細(xì)胞經(jīng)溶劑對(duì)照（Control）、TGP單獨(dú)處理或TGP聯(lián)合mTOR激活劑MHY1485處理后，通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖曲線。（B）克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示相同處理?xiàng)l件下細(xì)胞克隆存活能力。（C）Transwell遷移實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞遷移能力。（D）mTOR通路相關(guān)蛋白p-mTOR、mTOR、p-ULK1、ULK1、p-S6K和S6K的代表性Western blot分析。GAPDH作為上樣內(nèi)參。（E）熱圖顯示mTOR通路中磷酸化蛋白/總蛋白比值的定量分析。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

TGP通過(guò)SLC7A5選擇性限制亮氨酸供應(yīng)，而非造成非特異性氨基酸剝奪

為系統(tǒng)界定TGP抑制作用的底物特異性，研究分別補(bǔ)充SLC7A5主要轉(zhuǎn)運(yùn)底物亮氨酸，以及非目標(biāo)大型氨基酸精氨酸，進(jìn)行雙向營(yíng)養(yǎng)救援實(shí)驗(yàn)。48小時(shí)和96小時(shí)CCK-8細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)顯示，單獨(dú)補(bǔ)充亮氨酸或精氨酸均可促進(jìn)基礎(chǔ)生長(zhǎng)；但在TGP壓力下，二者表現(xiàn)出明顯不同的結(jié)果。外源亮氨酸可部分緩沖和補(bǔ)償TGP的細(xì)胞毒性，使細(xì)胞活力維持在較高水平；相反，精氨酸無(wú)法減輕TGP毒性，Arginine+TGP組仍表現(xiàn)出明顯細(xì)胞死亡。

Transwell遷移實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)這種底物選擇性：外源亮氨酸可部分恢復(fù)TGP介導(dǎo)的遷移抑制，而精氨酸完全不能挽救TGP的抗遷移作用。分子水平上，亮氨酸補(bǔ)充在TGP作用下仍可部分維持p-mTOR、p-ULK1和p-S6K磷酸化水平，提示其可能通過(guò)與SLC7A5轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程相關(guān)的競(jìng)爭(zhēng)性底物補(bǔ)償機(jī)制發(fā)揮作用。相反，TGP可完全壓制精氨酸驅(qū)動(dòng)的通路激活，未見(jiàn)代謝補(bǔ)償跡象。

綜合來(lái)看，TGP并非通過(guò)非特異性氨基酸剝奪抑制HNSCC，而是通過(guò)阻斷SLC7A5介導(dǎo)的亮氨酸輸入，選擇性削弱腫瘤細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和mTOR通路激活。

圖10：TGP通過(guò)抑制SLC7A5降低細(xì)胞內(nèi)亮氨酸可利用性，引發(fā)支鏈氨基酸分解代謝酶代償性下調(diào)，并抑制HNSCC細(xì)胞中的mTOR信號(hào)。（A）Western blot分析CAL27、FADU和SCC7細(xì)胞經(jīng)不同濃度TGP（低劑量/高劑量）處理后，支鏈氨基酸分解代謝關(guān)鍵酶BCAT1、BCKDHA和BCKDHB的表達(dá)，β-ACTIN作為上樣內(nèi)參。（B）TGP處理后，細(xì)胞內(nèi)α-酮異己酸（KIC）水平定量；KIC是亮氨酸分解代謝的關(guān)鍵代謝物。（C、D）HNSCC細(xì)胞經(jīng)溶劑、亮氨酸單獨(dú)處理、亮氨酸聯(lián)合TGP處理、精氨酸單獨(dú)處理或精氨酸聯(lián)合TGP處理后，在48小時(shí)（C）和96小時(shí)（D）檢測(cè)細(xì)胞活力。（E）Transwell遷移實(shí)驗(yàn)顯示相同處理?xiàng)l件下細(xì)胞遷移能力。（F）Western blot分析細(xì)胞經(jīng)溶劑、TGP單獨(dú)處理、亮氨酸聯(lián)合TGP處理或精氨酸聯(lián)合TGP處理后，mTOR通路相關(guān)蛋白p-mTOR、mTOR、p-ULK1、ULK1、p-S6K和S6K的表達(dá)。β-ACTIN作為上樣內(nèi)參。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

【貢獻(xiàn)】★★★★★

本研究證實(shí)，TGP可通過(guò)靶向SLC7A5-亮氨酸-mTOR信號(hào)軸抑制HNSCC。具體而言，TGP下調(diào)SLC7A5表達(dá)，減少亮氨酸攝取，降低亮氨酸下游代謝物KIC水平，并抑制mTOR、ULK1和S6K磷酸化，從而限制HNSCC細(xì)胞增殖、克隆形成、遷移和EMT進(jìn)程，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，TGP可抑制CAL27、FADU和SCC7模型中的腫瘤生長(zhǎng)，并降低腫瘤組織SLC7A5表達(dá)和亮氨酸積累，同時(shí)在免疫完整小鼠模型中改善免疫抑制性腫瘤微環(huán)境。SLC7A5過(guò)表達(dá)和mTOR激活可削弱TGP的抗腫瘤效應(yīng)，而SLC7A5敲低和mTOR抑制可模擬TGP作用，進(jìn)一步支持SLC7A5-亮氨酸-mTOR軸是TGP發(fā)揮作用的關(guān)鍵通路。

該研究不僅拓展了天然產(chǎn)物調(diào)控腫瘤代謝重編程的機(jī)制認(rèn)識(shí)，也為將TGP開(kāi)發(fā)為HNSCC潛在低毒治療候選藥物提供了臨床前證據(jù)。不過(guò)，研究仍存在局限：尚未使用患者來(lái)源異種移植瘤（PDX）模型驗(yàn)證個(gè)體化腫瘤異質(zhì)性；TGP下調(diào)SLC7A5的上游分子機(jī)制仍未闡明；未來(lái)還需進(jìn)一步評(píng)估TGP與HNSCC標(biāo)準(zhǔn)治療方案聯(lián)用時(shí)是否具有協(xié)同潛力。

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