華中農業大學在讀博士生，一作發表《PNAS》

光合作用是地球生態系統能量流動與物質循環的核心，葉綠素作為光系統的核心色素，其合成過程受到多種脅迫。原卟啉（PPIX）是葉綠素與血紅素的共同前體分子，該物質具有強光敏性，受光激發后產生單線態氧（1O?），造成葉綠素合成關鍵酶損傷，進而抑制光合生物的正常生長。此前，華中農業大學端木德強團隊已證實，膽色素（血紅素的代謝產物）與GUN4 蛋白非共價結合，調控鎂螯合酶（MgCh）活性，并穩定其核心催化亞基 CHLH1，保障葉綠素正常合成。

近日，該團隊聯合美國加州大學戴維斯分校、德國洪堡大學、中國科學院遺傳與發育生物學研究所等國內外科研團隊，進一步揭示了GUN4-膽色素共價結合介導的光適應新機制，研究成果以“Covalent phytobilin adducts of GUN4 implicate a photoprotective mechanism in chlorophyll biosynthesis”為題發表在《PNAS》期刊上。該研究由華中農業大學端木德強教授團隊牽頭，聯合美國加州大學戴維斯分校（Nathan Rockwell）、德國洪堡大學（Bernhard Grimm）、中國科學院遺傳與發育生物學研究所（汪迎春，黃夏禾）相關團隊共同完成。端木德強教授與Nathan C. Rockwell研究員為論文共同通訊作者，在讀博士生王棪為論文第一作者。

鎂離子螯合酶MgCh是葉綠素合成途徑的第一個關鍵酶，由CHLH、CHLI、CHLD三個亞基組成，其中CHLH是結合底物PPIX的核心亞基，而GUN4是放氧型光合生物（藍細菌，真核微藻，植物）中普遍存在的MgCh的調控蛋白。血紅素經血紅素加氧酶（HMOX1）、鐵氧還蛋白依賴型膽色素還原酶（FDBR）依次催化，生成膽色素分子。本研究選用萊茵衣藻作為研究體系，該物種不含光敏色素（phytochrome）、藻膽蛋白（phycobiliprotein）等已知的膽色素受體或結合蛋白，是探究膽色素新型功能的理想材料。

圖1. 衣藻不同突變體中原卟啉 (PPIX) 的積累

研究團隊綜合運用遺傳學、生物化學、光譜學、質譜分析等多種技術開展系統研究。結果表明：gun4單突變體、hmox1單突變體及hmox1 gun4雙突變體細胞內均大量積累PPIX，其中雙突變體的PPIX含量達到野生型衣藻的187倍。過量積累的PPIX 在光照條件下生成單線態氧，導致CHLH1蛋白降解、葉綠素合成受阻，突變體在強光、近紫外光環境中的生長受到嚴重抑制。

科研人員進一步探究單線態氧的信號通路，發現敲除萊茵衣藻中單線態氧響應核心蛋白SAK1、SOR1后，可顯著緩解gun4、hmox1突變體的光敏感表型。這一結果證明，GUN4與膽色素可通過調控胞內單線態氧穩態，影響葉綠體-細胞核逆向信號通路。

圖2. 敲除 SAK1或SOR1可恢復gun4/hmox1突變體的生長

經過體內外實驗，研究團隊發現，在PPIX、紫外光與氧氣的共同作用下，GUN4與膽色素（PCB）形成共價加合物；而膽色素前體膽綠素（biliverdin, BV）無法介導該共價結合過程。同時證實，該現象并非萊茵衣藻獨有，在藍細菌、高等植物等光合生物的GUN4蛋白中均保守存在。

圖3. GUN-膽色素共價結合在藍細菌、微藻和植物中均保守

研究團隊利用定點突變技術，鎖定了GUN4蛋白中調控共價結合與生理功能的關鍵氨基酸位點。色氨酸Trp189是GUN4-PCB共價加合物形成的必需位點，該位點突變后，菌株無法合成共價加合物，在強光、紫外脅迫下GUN4與CHLH1蛋白大幅降解，光合生長缺陷表型最為顯著；Trp135、Trp200 主要負責維持GUN4與CHLH1的蛋白互作，同時調控共價加合物的形成效率。光譜分析結果顯示，PCB結合可保護GUN4的色氨酸殘基免受單線態氧的氧化損傷，同時GUN4也能抑制PCB發生光降解，二者形成相互防護的動態體系。

圖4. Trp135、Trp189、Trp200及 Asn219是維持GUN4功能的關鍵氨基酸

該研究還提出了四種模型。GUN4首先與PCB形成非共價復合物，并結合攜帶底物PPIX的CHLH1蛋白；CHLH1結合的PPIX在光下產生單線態氧，進而誘導PCB與GUN4發生共價結合。形成的GUN4-PCB共價加合物具備兩個核心功能。一方面，可直接發揮抗氧化、光保護作用，清除單線態氧毒性，阻止CHLH1持續光氧化降解，保障鎂螯合酶正常功能與葉綠素合成；另一方面，可作為特異性的葉綠體氧化脅迫信號，影響葉綠體-細胞核逆向信號傳遞，調控細胞對光氧化脅迫的應答。

圖5. GUN4-PCB的共價互作及單線態氧信號應答的工作模型

該研究解答了“多數真核藻類缺失藻膽蛋白、光敏色素等經典膽色素受體或結合蛋白，卻依然保留完整的膽色素合成通路”這一科學謎題，證實了膽色素和GUN4形成的共價加合物是實現光保護的核心分子，從進化層面解釋了膽色素合成通路在放氧型光合生物中普遍保守的原因。該成果建立了光合生物四吡咯代謝網絡與光氧化脅迫耐受的關聯，豐富了對四吡咯分子生物學功能的理解。

論文鏈接：

https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2533100123