北京
近日，南京農業大學動物醫學院林建、楊倩教授團隊在中科院一區國際 Top 期刊《Trends in Biotechnology》（IF=16.6）發表題為《Engineered Bacillus subtilis to deliver dsRNA via extracellular vesicles against the H9N2 avian influenza virus》的原創研究論文。該研究以枯草芽孢桿菌胞外囊泡（EV）為核心遞送載體，搭建集核酸自產、天然囊泡包載、口服長效給藥于一體的益生菌 RNAi 抗病毒平臺，從生產、儲運、田間應用全鏈條解決傳統獸用核酸藥物成本高、易降解、給藥繁瑣三大痛點，為 H9N2 禽流感等畜禽 RNA 病毒綠色防控提供全新可落地技術方案。
RNA 干擾（RNAi）憑借高特異性、無藥物殘留優勢，是畜禽減抗替抗核心技術路線，但長期存在兩大產業化卡脖子瓶頸：一是體外轉錄合成核酸原料昂貴，脂質、PEI 等人工納米載體大幅抬升制劑成本；二是裸露雙鏈 RNA 極易被消化道核酸酶降解，僅支持注射給藥，規模化養殖實操難度極大。微生物胞外囊泡 EV 是細菌自發分泌的雙層磷脂膜納米囊泡，天然具備核酸包裹、生物相容性好、腸道耐受等優勢，是突破遞送瓶頸的理想載體，本研究圍繞 EV 完成全套體系構建與體內外完整功能驗證。研究團隊對安全級枯草芽孢桿菌 168 進行基因編輯，引入雙向 Pylb 持續表達載體，構建 AAD 工程益生菌。該菌株發酵過程中可自主合成靶向 H9N2 病毒 NS1 免疫逃逸蛋白的 vsiRNA 富集 dsRNA，同步持續分泌胞外囊泡 EV，dsRNA 自動封裝于囊泡內部，實現 “活菌核酸工廠和天然納米遞送載體” 一體化，核酸生產成本降低 90% 以上。
圖1.工程化枯草芽孢桿菌AAD的囊泡提取驗證
胞外囊泡 EV 的磷脂雙層膜形成天然防護屏障，可隔絕消化道 RNase 降解，4℃儲存 7 天仍保持完整囊泡結構與核酸生物活性，省去人工載體包被工序，同等抗病毒效果下綜合用藥成本僅為傳統體外轉錄核酸制劑的 1/10。細胞示蹤試驗證實，Dil 熒光標記的 AAD-EVs 可在 1 小時內被 34% 雞巨噬細胞攝取，細胞內生成功能性 vsiRNA 總量是商用脂質轉染試劑的 48.9 倍；小 RNA 測序證明 EV 遞送可產生覆蓋全靶序列、18–25 nt 廣譜 vsiRNA，沉默覆蓋范圍與效率遠超傳統轉染體系。
圖2.工程化枯草芽孢桿菌AAD囊泡攝取效率和包裹dsRNA驗證
攻毒試驗證實，采用活菌拌料口服給藥后，枯草芽孢桿菌可在家禽腸道穩定定植7天，持續釋放載藥 EV，經腸道吸收擴散至肺、氣管、血液、心肝腎全身靶組織。EV 遞送可實現約 70% H9N2 病毒載量下降，顯著緩解病毒感染造成家禽減重、肺部病理損傷。機制層面，載藥 EV 同步激活宿主 RNAi 沉默通路與干擾素天然免疫通路，實現雙重防護。靶點序列提前剔除宿主同源片段，從根源規避脫靶風險。整套 EV 遞送平臺具備高度模塊化特性，僅替換囊泡包裹的病毒特異性 vsiRNA 序列，即可快速適配傳染性法氏囊病、豬藍耳病等各類畜禽 RNA 病毒防控，適配雞、鴨、生豬全品類規模化養殖場景。該技術規避注射操作，適配養殖場常規拌料飼喂流程，突破實驗室研究與田間落地之間的遞送壁壘。
圖 3 動物試驗評估重組菌AAD對禽流感H9N2亞型的保護效果
該論文第一作者為南京農業大學劉佳琛碩士，通訊作者為林建教授。研究過程中，楊倩教授為課題提供了重要指導，課題組的林建教授和崔曉靚老師以及生科院閆新教授、交叉研究院沈宏副教授均給予了寶貴建議。本系列研究先后依托國家自然科學基金、國家重點研發計劃、江蘇省優青基金、寧夏優青年基金、等多項課題資助，相關核心靶點與益生菌 EV 遞送技術已布局多項國家發明專利，形成完整知識產權保護體系。本研究建立的益生菌胞外囊泡 EV 遞送 RNAi 體系，打通獸用酸藥從實驗室走向養殖一線全鏈條，以微生物天然囊泡替代人工化學載體、發酵自產核酸替代高價體外轉錄原料、口服群體飼喂替代人工注射，構建低成本、高穩定、廣譜安全的畜禽綠色抗病毒新方案，為畜牧行業減抗限抗、保障畜禽產品食品安全提供全新技術支持。
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