許錦波團隊率先跑通低通量de novo，11大靶點上實現90%成功率！

在最新公開的一份技術報告中，AI 蛋白質設計平臺公司分子之心宣布，他們構建的從頭納米抗體設計平臺 MMDesign，在真實治療靶點上跑通了一條此前幾乎無人交卷的路線：在每個靶點僅實驗測試 14–50 個候選分子的前提下，MMDesign 就在 11 個治療相關靶點中的 10 個上成功找到特異性結合物，靶點級成功率約 90.9%，最佳測得親和力達到皮摩爾（pM）級別。對一個長期被認為「沒有高通量就很難有收獲」的領域來說，這意味著低通量、跨多靶點的實用級 de novo 納米抗體發現，第一次被跑成了一條完整可復用的流程。

更重要的是，這樣的成績并不是靠「選簡單靶點刷數據」實現的。報告顯示，MMDesign 在被公認為低通量場景下極難命中的淺層三聚體細胞因子 TNFα 上，實現了 14 選 7（50%）的命中率；在部分 GPCR 等被視為抗體設計「深水區」的高難度靶點上，同樣獲得了高表達、低聚集且特異性良好的候選。多數命中分子不僅親和力達到納摩爾甚至皮摩爾級別，還在 CHO 表達、SEC 單體比例和非特異性結合等可開發性指標上表現穩健——這意味著這些分子不僅「能綁得緊」，而且從一開始就帶著成藥性走進實驗室。

支撐這一整套工作流的，是分子之心自研的全原子結構預測模型 MMFold。在抗體–抗原結構預測的權威基準 FoldBench 上，MMFold 的 Top?1 成功率達到 68.6%，顯著高于當前公開的 AlphaFold 3 等主流系統，Top?5 成功率進一步提升至 75.6%。更準確、覆蓋面更廣的結構預測能力，讓 MMDesign 在「從頭生成 + 多輪過濾」的過程中擁有更可靠的結構信號，能夠在數萬級候選空間中，用幾十次實驗篩出過去往往需要高通量平臺才能找到的高質量結合物。

這份技術報告由許錦波團隊完成。許錦波是 AI 蛋白質結構預測領域最早的開拓者之一，早在 2016 年提出的 RaptorX?Contact 方法，就率先證明深度學習可以顯著提升蛋白質結構預測精度，被業界視為 AlphaFold 等系統的重要方法學前驅，多家媒體稱他為「AI 預測蛋白質結構第一人」。如今，他帶領分子之心試圖把這套從 0 到 1 的基礎研究成果，延伸到抗體和納米抗體的從頭設計與工程化應用。

綜合這些結果，一個信號變得清晰：de novo 納米抗體發現正在從「海量盲篩」的探索性范式，走向「可編程分子工程 + 低通量驗證」的工程化范式。MMDesign 展示的是，在當下可用的 AI 和實驗條件下，如何在保持跨靶點、含難靶的高命中率的同時，把實驗負擔壓縮到「幾十次驗證」的量級。接下來，本文將按照技術報告原結構，對 MMDesign 的設計理念、算法實現和實驗結果進行系統呈現。

摘要

傳統的抗體發現依賴于動物免疫或大規模文庫篩選，需要對數百萬至數十億候選物進行實驗驗證，且在表位特異性和分子性質方面的可編程性有限。生成式建模的最新進展已展示了從頭設計抗體設計的可能性，但在治療相關靶標上以低實驗通量實現實驗上實用的生物制劑發現仍然具有挑戰性。

本文介紹了 MMDesign，一個 AI 生物藥從頭設計平臺，結合了生成式序列 - 結構優化與多層計算過濾。僅從靶標蛋白和指定的表位殘基出發，MMDesign 通過 MMFold（一種專有的抗體 - 抗原結構預測模型）的信心景觀優化以及蛋白質語言模型，生成數萬個納米抗體候選物。過濾階段結合了結構可靠性、序列自然性和基于物理的界面評估，將候選物池壓縮至每個靶標僅數十個可進行實驗測試的設計。我們在 11 個治療相關靶標上系統評估了 MMDesign，涵蓋細胞因子、免疫檢查點、受體、病毒蛋白和表面抗原。每個靶標僅測試 14-50 個候選物，即可在 11 個靶標中的 10 個（90.9%）上獲得確認的結合物，最佳測量親和力范圍從皮摩爾到納摩爾水平，證明了在實驗可處理規模上的廣泛靶標級成功。值得注意的是，MMDesign 在 TNFα 上實現了 50% 的命中率，TNFα 是一種淺層三聚體細胞因子靶標，此前已被證明對低通量 de novo VHH 發現活動具有困難性。

這些結果共同表明，生物制劑發現可能正從大規模隨機篩選轉向可編程分子工程，其中計算生成和優先級排序大幅減少了實驗負擔，同時實現了快速的表位靶向治療性結合物發現。

圖形摘要

圖 1：排名最高的 VHH 結合物（青色）與十個成功靶標（白色）的復合物預測結構。

1 引言

治療性抗體發現仍然由大規模隨機篩選主導，包括動物免疫和展示文庫篩選，通常需要對數百萬至數十億變體進行實驗 interrogation。盡管這些方法已產生許多成功的治療藥物，但它們在表位特異性和治療性質方面的控制有限，并帶來巨大的實驗和時間成本。因此，計算生物制劑工程的一個核心挑戰是抗體發現能否從隨機篩選轉向可編程分子生成和優化。

生成式建模的最新進展改變了 de novo 蛋白結合物設計的格局，RFdiffusion [1]、BindCraft [2] 和 AlphaProteo [3] 等系統證明了可以直接從靶標結構計算生成高親和力結合物。然而，將這些進展擴展到抗體已被證明難度極高，因為抗體 - 抗原識別由構象柔性的 CDR 環和高度異質的結合界面主導。盡管如此，Chai-2 [4]、Germinal [5]、BoltzGen [6] 和 GeoFlow-V3 [7] 等近期系統已開始展示 de novo 抗體和納米抗體發現的概念驗證。

盡管取得了這些進展，實用的低通量抗體發現仍未解決。大多數當前系統在不同靶標間的成功率不一致，需要大量的實驗探索，或尚未在困難的治療性抗原上證明穩健的性能。特別是，很少有研究在報告廣泛靶標級成功的同時，每個靶標僅實驗測試數十個候選物。

本文介紹了 MMDesign，一個幻覺引導的 de novo VHH 發現平臺，旨在以實驗可處理的規模運行。僅從靶標蛋白和指定的表位殘基出發，MMDesign 結合了序列和結構共生成與多層計算過濾，每個靶標僅產生數十個實驗候選物。在 11 個治療相關靶標上系統評估了 MMDesign，涵蓋細胞因子、免疫檢查點、受體、病毒蛋白和表面抗原。每個靶標僅實驗測試 14-50 個候選物，即可在 11 個靶標中的 10 個（90.9%）上獲得確認的結合物，最佳測量親和力范圍從皮摩爾到納摩爾水平。值得注意的是，MMDesign 在 TNFα 上實現了 50% 的命中率，TNFα 是一種三聚體細胞因子靶標，此前已被證明對低通量 de novo VHH 發現工作極具挑戰 [4, 6]。這些結果共同表明，生成式納米抗體發現正開始從概念驗證演示轉向實用的治療性發現模式。

2 結果

2.1 跨治療多樣性靶標的實用 De Novo VHH 發現

為評估生成式納米抗體發現是否能在實驗實用規模上運行，我們在系統評估 MMDesign 的同時，每個活動僅實驗測試 14-50 個候選分子。

基準 panel 的靶標多樣性和結構復雜性。本研究評估的靶標 panel 涵蓋了廣泛的治療相關蛋白類別，代表了近期 de novo 抗體或納米抗體設計系統報告的最具結構和生物學多樣性的基準集之一。十一個靶標包括細胞因子（TNFα、IL-2、IL-3、IL-20）、免疫檢查點（PD-1、PD-L1）、受體胞外域（InsulinR、PDGFR、IL-7Rα）、病毒蛋白（BHRF1）和表面抗原（CD7），共同覆蓋免疫學、腫瘤學、代謝和傳染病應用。與許多主要關注有限演示抗原集的近期生成式抗體設計研究不同，MMDesign panel 更接近真實治療性生物制劑發現中遇到的多樣性。

重要的是，基準多樣性超越了生物類別，包括界面幾何和結合難度的顯著變化。TNFα 代表了一個特別具有挑戰性的案例，因為它形成了一個同源三聚體細胞因子復合物，具有淺層且溶劑暴露的結合表面，這一靶標類別在歷史上被證明對低通量生成式結合物設計具有困難性。InsulinR、PDGFR 和 IL-7Rα 等受體靶標通過其大型柔性胞外域和異質表面拓撲引入了額外的復雜性。這些靶標共同跨越了多個結合模式，包括淺層暴露的溝槽、柔性受體界面、檢查點相互作用表面和病毒表位。因此，MMDesign 基準不僅評估平臺是否能生成結合物，還評估其是否能跨結構不同且治療性現實的抗原類別進行泛化。

候選 VHH 通過幻覺引導的序列 - 結構優化生成，隨后進行多層計算過濾，結合了結構可靠性分析、序列自然性評估和基于物理的界面評分。

在 11 個活動中，10 個靶標（90.9%）獲得了確認的特異性結合物。每個靶標的實驗測試僅涉及數十個候選物，但產生了 2.3% 至 86.7% 的每靶標命中率（表 1）。最佳測量親和力范圍從皮摩爾到微摩爾水平，多個活動產生了低至中納摩爾范圍內的結合物。在所有成功的活動中，預測的復合物結構表明設計的 CDR 殘基與用戶指定的表位熱點殘基之間存在直接接觸。

在所有靶標中，PD-L1 實現了最高的命中率，30 個測試候選物中有 26 個被確認為特異性結合物，最佳測量 K_D 為 7.2 nM。其他活動在多種抗原類別上產生了多個確認的結合物，包括 InsulinR（5/25，最佳 K_D 25 nM）、BHRF1（5/35，最佳 K_D 282 nM）、IL-2（5/50，最佳 K_D 138 nM）和 IL-3（2/25，最佳 K_D 約 200 nM）。PDGFR、IL-7Rα、IL-20 和 PD-1 也分別鑒定出單個確認的結合物。只有一個靶標 CD7 在當前管線配置下未產生確認的結合物。

表 1：所有 11 個靶標活動的實驗驗證結果

這些結果共同表明，MMDesign 能夠在每個靶標僅實驗測試數十個候選物的情況下實現廣泛的靶標級成功，表明生成式 VHH 發現可能越來越多地在實驗可處理的規模上運行。

對設計復合物的結構分析表明這些結合物是真正新穎的：11 個靶標中的 9 個在 PDB 中沒有已知的 VHH 復合物，并且這些設計占據了此前未被表征的結合姿態空間（附錄 C）。同時，對于存在驗證參考的靶標，盡管 CDR 完全是 de novo 的，設計仍收斂于相同的功能表位 —— 包括恢復自然的 PD-1:PD-L1 抑制性界面。

2.2 MMDesign 在困難的 TNFα 靶標上實現 50% 命中率

TNFα 是一種同源三聚體細胞因子，其淺層且溶劑暴露的結合表面在歷史上被證明對低通量 de novo VHH 發現方法具有困難性 [4, 6]。文獻中報道的先前生成式納米抗體活動在類似的有限實驗通量設置下未能針對該靶標產生確認的結合物。

為在該挑戰性系統上評估 MMDesign，通過幻覺引導生成管線優化了所有三個 CDR 環，并選擇了 14 個候選物進行實驗表征。七個設計（50%）通過 BLI 表現出清晰且特異性的靶標結合。先導分子實現了 51 pM 的表觀 K_D，注意到該值反映了與三聚體 TNFα 分析物相關的親合力增強。

TNFα 活動特別引人注目，因為它在極其有限的實驗探索下展示了實質性的富集。計算管線成功地將數萬生成的候選物縮小到少量實驗可處理的集合，富集了真正的結合物。這些結果表明，AI 引導的生成式發現可能越來越多地觸及歷史上抵抗低通量發現工作流的困難治療性幾何結構。

選定靶標的代表性預測結構和 BLI 傳感圖如圖 2 所示。

圖 2：計算優先級排序的 VHH 候選物的實驗驗證。對于每個靶標，顯示了預測的 VHH - 抗原復合物結構（左）和多濃度 BLI 傳感圖及 1:1 全局擬合（右）。

2.3 設計的 VHH 展現出良好的初步可開發性特征

除結合活性外，許多設計的 VHH 展現出令人鼓舞的初步可開發性相關性質。各活動的表達量表明，許多候選物可以作為 VHH-Fc 構建體在 CHO 細胞中穩健表達（圖 3）。尺寸排阻色譜進一步顯示，許多純化的候選物主要保持單體狀態，聚集特征有限（圖 4）。

為評估初步特異性特征，對一部分設計的 VHH 進行了針對人血清白蛋白（HSA）的脫靶結合評估，HSA 是血漿中最豐富的蛋白質，也是治療性抗體開發中非特異性相互作用的常見來源。在所有測試的候選物中，針對 HSA 的 BLI 響應在微摩爾濃度下保持最小，沒有可測量的強非特異性結合證據（圖 5）。針對胰島素和 dsDNA 的額外多反應性 ELISA 實驗同樣表明了低水平的廣泛非特異性反應性。

盡管這些實驗不構成全面的治療性可開發性評估，但它們表明 MMDesign 能夠生成實驗可處理的類抗體分子，而不僅僅是孤立的結合序列。這些觀察表明，未來的生成式生物制劑系統可能同時優化結合活性、特異性、表達、穩定性和下游治療性可開發性特征。

圖 3：所有靶標活動中 VHH-Fc 構建體的表達量（mg/L）。每個數據點代表一個在 10 mL 規模的 CHO 中表達的設計候選物。

圖 4：代表性 VHH-Fc 候選物的 SEC-HPLC 色譜圖。主峰表示單體 VHH-Fc 物種；如有次要峰，則對應聚集體或降解產物。

圖 5：七個設計的 VHH 候選物在 1-2 μM 濃度下針對 HSA 的 BLI 傳感圖。虛線標記從結合到解離的過渡。藍色：實驗響應；黑色：1:1 動力學擬合。

2.4 多層計算過濾富集實驗命中發現

對計算過濾管線的 post-hoc 分析揭示，沒有任何單一指標足以跨靶標穩健地識別最高質量的結合物。特別是，ipTM 和 pLDDT 等結構預測信心指標與確認結合物中實驗測量親和力之間的相關性有限，與先前的觀察一致，即信心指標可能主要作為結合兼容性的粗略二元指標，而非定量親和力預測因子。

相反，多層過濾標準的分層整合始終比任何單獨指標產生更強的富集。過濾級聯包含四個主要組成部分：(i) 結構信心評估，(ii) 跨隨機種子和預測模型的可重復性分析，(iii) 基于蛋白質語言模型的序列自然性評估，和 (iv) 基于內部統計物理的界面評分。通過所有過濾階段的設計相對于使用任何單一標準選擇的候選物，在實驗確認的結合物方面實現了實質性的富集。

這些觀察表明，實用 AI 原生生物制劑發現中的核心挑戰不僅僅是生成候選序列，而是充分富集真正的結合物以最小化實驗負擔。在這一背景下，多目標計算優先級排序似乎在啟用實驗實用的低通量發現工作流中發揮著關鍵作用。

2.5 MMFold 在抗體 - 抗原復合物預測中實現高精度

由于幻覺引導優化依賴于抗體抗原復合物結構預測的質量，我們在 FoldBench [8] 抗體 - 抗原基準數據集上評估了 MMFold。MMFold 是一種受 AlphaFold3 架構 [9] 啟發并使用增強的抗體 - 抗原建模能力訓練的專有全原子結構預測模型。MMFold 在 2021 年 9 月 30 日之前發布的蛋白質數據庫 [10] 條目上進行了訓練。

在 172 個抗體 - 抗原界面上，MMFold 的 Top-1 預測實現了 68.6% 的整體 DockQ [11] 可接受或更好的成功率，而 AlphaFold3 在相同基準上為 47.9%。在中等和高質量 DockQ 閾值方面也觀察到了改進。擴展到 Top-5 預測時，MMFold 進一步將可接受或更好的性能提高到 75.6%（圖 6）。MMFold 的準確性也隨采樣預測數量的增加而良好擴展。例如，當使用數百個種子時，MMFold 可能在 Top-5 預測中實現約 50% 的高分辨率成功率。

幾個最近發布的結構預測模型未包含在此比較中。Boltz-2 [12] 被排除，因為其更近的訓練截止時間與 FoldBench 發布窗口的部分重疊，這排除了在該基準上的無泄漏評估；值得注意的是，作者自己報告「Boltz-2 顯示了對 Boltz-1 的改進，但仍落后于 AlphaFold3。」Protenix-v2 [13] 報告 Top-1 預測的 DockQ 可接受或更好成功率為 65%，但該數字是在 FoldBench 抗體 - 抗原基準的 103 個 PDB ID（160 個界面）子集上獲得的，而非此處使用的完整 113 個 PDB ID（172 個界面）集。因此，它與圖 6 中的結果不直接可比，未包含在內。

圖 6：基于 DockQ 分類的 MMFold 與領先結構預測模型的性能比較。堆疊條形圖展示了高（黃色）、中（青色）和可接受（粉色）質量閾值下的累積成功率（%）。MMFold 在 Top-1 和 Top-5 成功率的所有質量等級上均顯著高于基線，包括 AlphaFold3、Boltz-1、Chai-1、HelixFold3、Protenix-v1 [14] 和 ESMFold2 [15]。標有星號（Protenix-v1 * 和 ESMFold2*）的值在 FoldBench 抗體 - 抗原基準上從 ESMFold2 論文 [15] 報告和推斷；ESMFold2 結果對應其 20-loop 推理設置。所有其他模型在單一一致協議下進行了評估。

代表性案例研究展示了相對于 AlphaFold3 在多個抗體 - 抗原復合物中 substantially 改進的界面建模，包括 MMFold 準確恢復基線系統建模不佳的結合幾何結構的示例（圖 7）。詳細的基準程序和額外的基準分析見補充信息。

圖 7：說明抗體 - 抗原蛋白復合物預測準確性的案例研究。實驗真實結構（左列）以實體灰色顯示。在預測面板中（中：AlphaFold3；右：MMFold），預測模型按亞基著色 —— 抗原為紅色 —— 并疊加在半透明真實結構上以可視化結構偏差。

盡管當前研究未直接建立結構預測準確性與實驗發現成功之間的因果關系，但這些結果表明，改進的抗體 - 抗原結構建模可能為下游生成式生物制劑優化工作流提供更高質量的信心景觀。

3 討論

生成式建模的最新進展已確立了 de novo 抗體和納米抗體生成的可能性。本文呈現的結果表明，該領域可能正開始從概念驗證演示轉向實驗實用的發現工作流。在 11 個治療相關靶標上，MMDesign 在僅實驗測試每個活動 14-50 個候選物的情況下，在 10 個靶標上產生了確認的結合物，涵蓋細胞因子、免疫檢查點、受體、病毒蛋白和表面抗原。這些發現表明，生成式 VHH 發現越來越多地以實驗可處理的規模運行，而非依賴大規模的隨機篩選活動。

實用 AI 原生生物制劑發現的一個決定性特征可能最終是在保持廣泛靶標級成功的同時大幅壓縮實驗篩選負擔的能力。傳統的抗體發現工作流，包括動物免疫和展示文庫篩選，通常需要探索數百萬至數十億變體，并對表位特異性提供有限的控制。相比之下，MMDesign 僅從靶標蛋白和用戶指定的表位殘基出發，計算生成數萬個候選 VHH，并通過分層計算富集將此空間縮小到僅數十個實驗設計。

更廣泛地說，這些結果表明生物制劑發現可能從隨機實驗篩選轉向可編程分子工程。

設計結合物的序列新穎性

任何生成式設計平臺的一個關鍵考慮是其輸出序列是否代表真正新穎的分子，還是僅僅重復已知的抗體。MMDesign 生成核心是一個通用全原子結構預測模型，未專門針對抗體 - 抗原復合物進行微調；基于幻覺的優化探索模型的信心景觀，而不參考任何抗體序列數據庫。因此，生成過程不能 —— 從構造上 —— 復制或衍生來自現有結合物的序列，無論是存儲在公共數據庫還是披露在專利申請中的序列。CDR 相似性分析（附錄 A）和與 SAbDab 的結構比較（附錄 B）確認，設計的序列與已知抗體實質性不同，框架區域保留了規范的 VHH 支架幾何結構（每個區域的 Cα-RMSD 始終低于 0.7 ?），而 CDR 環 —— 特別是 CDR3—— 采用了在實驗數據庫中很大程度上不存在的構象。與已知 PDB 復合物的結合姿態比較（附錄 C）提供了結構新穎性的進一步證據：11 個靶標中的 9 個在 PDB 中沒有納米抗體復合物，因此設計的 VHH 占據了此前未被表征的結構空間。在存在驗證參考的情況下，盡管 CDR 完全是 de novo 的，設計獨立地收斂于相同的功能表位 ——TNFα 設計恢復了 5M2J 表位（質心距離 1.03 ?），PD-1 設計落在自然 PD-1:PD-L1 界面上（質心距離 0.79 ?，24 個接觸中的 14 個共享），與競爭性抑制機制一致。

TNFα 活動的意義

TNFα 活動在此背景下特別引人注目。TNFα 是一種同源三聚體細胞因子，具有相對淺層且溶劑暴露的結合表面，這在歷史上被證明對低通量 de novo VHH 發現工作具有挑戰性。在本研究中，僅實驗測試 14 個候選物就產生了 7 個確認的結合物，對應 50% 的命中率，先導分子在親合力增強的三聚體設置中達到 51 pM 的表觀 K_D。盡管需要進一步的表征來評估這一結果的普適性，但它表明幻覺引導生成可能開始觸及歷史上抵抗計算低通量發現方法的困難抗原幾何結構。

可開發性特征

當前研究的另一個值得注意的方面是許多設計的 VHH 展現出超越靶標結合 alone 的良好初步可開發性相關性質。在各活動中，許多候選物在 CHO 細胞中實現了穩健的重組表達，通過 SEC-HPLC 保持主要為單體狀態，并在 BLI 檢測中顯示出針對 HSA 的最小可檢測交叉反應性。盡管這些測量不構成全面的可開發性評估，但它們表明生成式發現系統可能越來越能夠產生實驗可處理的類抗體分子，而不僅僅是孤立的結合序列。更廣泛地說，這些觀察提出了未來生成式抗體平臺可能不僅優化結合活性，而且同時優化表達、穩定性、特異性和下游治療性可開發性的可能性。

生成與過濾的整合

當前研究還突出了在統一工作流中整合生成和計算過濾的潛在重要性。Post-hoc 分析表明，沒有任何單一指標 —— 包括 ipTM 或 pLDDT 等結構預測信心指標 —— 足以跨靶標穩健地識別最高質量的結合物。相反，結構可重復性分析、序列自然性評估、表位接觸驗證和基于物理的界面評估的分層組合始終比任何單獨標準提供更強的富集。這些觀察表明，實用的生成式抗體發現可能不僅取決于生成能力本身，還取決于能夠將大型計算候選空間過濾為實驗可操作的集合的有效多目標優先級排序策略。

局限性與未來方向

仍存在幾個局限性。首先，盡管在多種靶標上展示了確認的結合，但親和力在各活動間仍然可變，許多成功的結合物聚集在納摩爾范圍內，而非始終實現亞納摩爾效力。提高跨不同抗原類別的親和力一致性仍然是未來模型開發的主要目標。其次，當前研究主要依賴于預測的復合物結構和結合檢測；設計抗體 - 抗原界面的實驗結構驗證對于建立生成結合幾何結構的準確性和理解成功設計 underlying 的機制將非常重要。第三，雖然初步表達和特異性測量令人鼓舞，全面的治療性可開發性評估 —— 包括長期穩定性、聚集抗性、免疫原性和體內藥代動力學分析 —— 超出了本工作的范圍。

幾個方向正在積極開發中。抗體 - 抗原結構建模和生成式優化的持續改進可能使平臺能夠解決日益困難的靶標類別，包括多特異性生物制劑、GPCR 和其他膜蛋白。超越 de novo 結合物生成，初步內部結果表明 MMDesign 可能可擴展到更高級的抗體工程設置，包括上下文或 pH 依賴性結合優化。同時，擴展設計 - 實驗反饋循環可能逐步將抗體發現轉變為自我改進的閉環優化過程，其中實驗結果持續改進生成和過濾性能。最后，納入更廣泛的可開發性感知目標可能允許未來系統不僅優化結合，而且從分子生成的最早階段就優化可制造性和治療適用性。

綜上所述，這些結果表明 de novo 納米抗體生成可能越來越多地從探索性研究模式演變為實用的治療性發現模式。如果生成、過濾和實驗反饋的持續改進能夠得以保持，計算引導的抗體發現可能最終從大規模隨機篩選轉向可編程分子工程。

可用性

MMDesign 平臺可用于與制藥和生物技術合作伙伴的協作靶標活動。MMFold 作為 MoleculeOS 的功能在 mos.moleculemind.com 上可用。

貢獻者

MoleculeMind AI 與生物制劑工程團隊。

實驗驗證由 MoleculeMind 生物制劑和轉化團隊完成。

* 通訊作者：Jinbo Xu, jinboxu@moleculemind.com

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附錄

A 設計 VHH 序列針對已知抗體數據庫的 CDR 相似性分析

• A.1 方法

為評估設計序列相對于已知抗體序列的新穎性，我們對 338 個 VHH 序列進行了 CDR 相似性分析，涵蓋 11 個靶標系統，并額外檢查了每個系統中親和力最高的 VHH 候選物。

設計序列首先針對本地 PDB 蛋白質序列數據庫（1,043,893 條蛋白質鏈）使用 blastp（BLAST+ v2.15.0，E 值 < 10??，每個查詢前 5 個命中）進行搜索。對于來自同一 PDB 條目的命中，僅保留一致性最高的鏈。然后使用 ANARCI 通過 IMGT 方案對查詢和命中序列進行編號。通過基于 IMGT 編號對齊位置并記錄錯配、插入和刪除，統計 CDR1（IMGT 27-38）、CDR2（IMGT 56-65）和 CDR3（IMGT 105-117）內的殘基級差異。對于每個設計序列，選擇整體序列一致性最高的 PDB 命中作為比較參考。

為進一步評估超越結構表征蛋白的新穎性，使用 blastp（E 值 < 10??，前 20 個命中）將來自 11 個靶標系統中 10 個（不包括 CD7，未鑒定出實驗確認的結合物）的最高親和力 VHH 候選物額外針對 NCBI 非冗余蛋白質數據庫（nr，約 2.5 億條序列）進行搜索。選擇一致性最高的條目，并使用相同的基于 IMGT 的方法計算 CDR 突變。手動審查前幾個命中，以確定數據庫中是否存在靶向相同抗原的已知 VHH 或納米抗體。

為評估針對更廣泛的自然觀察抗體庫空間的序列新穎性，使用 jackhmmer（HMMER 3.3，1 次迭代，E<10??，每個查詢最多 9,999 個命中）將所有 338 個設計 VHH 序列額外針對觀察抗體空間（OAS）重鏈數據庫進行搜索。OAS 是一個源自高通量 B 細胞受體測序研究的抗體序列精選存儲庫。由于 VHH 域在結構上等價于重鏈可變區，僅使用重鏈子數據庫進行此比較；排除輕鏈條目。設計序列與每個 OAS 命中之間的一致性計算為對齊位置（不包括相對于查詢的插入）與查詢殘基匹配的比例。然后對每個靶標系統內所有設計序列的每序列統計進行匯總。

• A.2 結果

所有設計序列的 CDR 突變統計匯總于表 2，每個系統的最高親和力 VHH 候選物見表 3（CD7 從表 3 和表 4 中排除，因為未鑒定出具有實驗確認結合親和力的 VHH 候選物）。

針對最高親和力 VHH 候選物每個系統的 NCBI nr 搜索結果（不包括 CD7）見表 4。

PD-L1 結合物在 PDB 中顯示出與已知結構的最高同源性（抗 PD-L1 VHH，PDB：7czd），序列一致性為 92.2%，僅 9 個 CDR 突變。對于其余 10 個系統，最高命中一致性低于 81%，最高親和力候選物的 CDR 總突變數為 7 至 31，與表 2 中的群體水平統計一致。在所有系統中，CDR3 始終攜帶最大數量的突變，與其作為抗原結合多樣性主要決定因素的角色一致。

搜索更廣泛的 NCBI nr 數據庫確認了 11 個靶標中的 6 個（IL-2、IL-3、IL-20、PDGFR、BHRF1 和 InsulinR）在公共序列數據庫中沒有先前報道的 VHH 或納米抗體，表明這些靶標的設計候選物不是先前披露序列的直接衍生物。

為在區域層面量化新穎性，將每個設計序列與 E 值最低（即檢索到的 9,999 條序列中最接近的序列匹配）的 OAS 重鏈命中進行比對，并分別計算每個 IMGT 編號 CDR 和 FR 區域的突變。區域水平統計見表 5（每個系統的所有設計序列）和表 6（每個系統的最高親和力候選物，不包括 CD7）。

表 2：所有設計序列與其最佳 PDB 命中的 CDR 突變統計（IMGT 編號）

表 3：每個系統最高親和力 VHH 候選物與其最佳 PDB 命中的 CDR 突變數（IMGT 編號）

表 4：每個系統最高親和力 VHH 候選物與其在 NCBI nr 中最近匹配的 CDR 突變數（IMGT 編號）

表 5：所有設計 VHH 序列與其最佳 OAS 重鏈命中的 CDR 和 FR 突變統計（IMGT 編號）

表 6：每個系統最高親和力 VHH 候選物與其最佳 OAS 重鏈命中的 CDR 和 FR 突變數（IMGT 編號）

B 實驗驗證 VHH 設計與 SAbDab 的結構相似性

將 MMFold 預測的 VHH 結構（11 個靶標系統的 363 個設計）與 3,313 個 SAbDab 實驗抗體結構使用成對 Cα-RMSD 進行比較。對于每個設計，執行全局 Needleman-Wunsch 序列比對，然后在所有對齊的 Cα 原子上進行單次 Kabsch 剛體疊加。然后在固定疊加下（不重新對齊）計算每個區域的 RMSD（IMGT 方案：FR1-FR4，CDR1-CDR3）。通過最小整體 RMSD 識別每個設計的最近 SAbDab 鄰居。

實驗驗證的 VHH 序列（確認的結合物和其他濕實驗表征的候選物）通過精確序列同一性與 MMFold 預測記錄匹配。表 7 顯示了每個實驗驗證 VHH 的整體和每個區域的 RMSD 及其最近的 SAbDab 結構。表 8 給出了每個系統內所有設計的系統水平平均值，作為群體參考。框架區域（FR1-FR4）在所有系統中始終低于 0.7 ?，確認了規范的 VHH 支架幾何結構。CDR3 主導結構新穎性：PDGFR、InsulinR 和 IL-3 中高于 3 ? 的值表明在實驗數據庫中很大程度上不存在的環構象，而 TNFα、PD-L1 和 PD-1（<2 ?）與已知抗體環緊密對齊。實驗驗證的設計在大多數情況下與其系統平均值匹配或優于其系統平均值；PD-L1 是例外（0.61 vs. 平均值 0.48 ?），因為整個 PD-L1 系統已經收斂于 SAbDab 附近。

這些分析表明 MMDesign 不會恢復先前已知的納米抗體序列或已知結合物的簡單變體。相反，該平臺生成 VHH 樣但序列發散的 CDR 架構，包括靶向沒有公共抗體、結構或專利數據庫中接近已知對應物的靶標特異性結合物。

表 7：每個實驗驗證 VHH 設計與其最近 SAbDab 鄰居的每個區域 RMSD（?）

表 8：每個系統內所有設計的平均每個區域 RMSD（?），每個設計均針對其最近的 SAbDab 鄰居進行評估。

C 設計 VHH 的結構新穎性：與已知 PDB 復合物的結合姿態比較

VHH 序列是針對 11 個靶標 de novo 設計的，其中 9 個靶標在 PDB 中沒有現有的 VHH 復合物結構（BHRF1、CD7、IL-2、IL-20、IL-3、IL-7Rα、InsulinR、PD-1、PDGFR）；只有 PD-L1 和 TNFα 有已知的 VHH 復合物可供比較。本分析提供定量的結合姿態比較，以證明：(1) 對于缺乏 VHH 參考的靶標，設計的 VHH 占據此前未被表征的結構空間，同時靶向功能相關的表位；(2) 對于有已知 VHH 結構的靶標，設計的 VHH 盡管 CDR 序列完全是 de novo 的，但顯示與參考 VHH 相同的結合模式，確認了設計的有效性。

• C.1 方法

參考結構檢索 對于每個靶標，使用靶標蛋白序列通過序列相似性搜索（同一性閾值 80%）從 RCSB PDB 檢索已知復合物結構，并與 SAbDab 數據庫交叉注釋，將條目分類為 VHH 復合物、IgG/Fab 復合物或天然蛋白 - 蛋白復合物。

步驟 1：抗原鏈識別 參考結構中的每條蛋白質鏈使用局部成對比對（Biopython PairwiseAligner，局部模式）與靶標序列對齊；歸一化到查詢長度的比對分數用作同一性度量，得分最高的鏈被指定為抗原鏈（排除同一性 < 0.4 的結構）。局部比對正確處理查詢序列是較長 PDB 鏈子域的情況（例如全長受體的胞外域）。

步驟 2：抗原鏈疊加 每個參考結構的抗原鏈疊加到設計復合物的鏈 A（靶標蛋白）上：

1. 對兩個抗原鏈執行全局成對比對；提取無間隙匹配位置產生的 Cα 原子對（至少要求 10 對）。

2. 通過奇異值分解（SVD）計算最小化 Cα RMSD 的最優旋轉矩陣 R 和平移向量 t。

3. 將變換（R, t）應用于參考結構的所有原子，保留復合物中所有鏈的相對幾何結構。

疊加后，參考結合物鏈在設計坐標系中的位置代表其相對于靶標的真實結合姿態。

步驟 3：界面殘基識別 使用 5 ? 重原子距離截斷定義界面殘基：如果殘基的任何重原子位于對側鏈任何重原子的 5 ? 范圍內，則將該殘基分類為界面殘基。這產生兩組：E_design（設計 VHH 接觸的靶標殘基，根據設計結構編號）和 E_ref（參考結合物接觸的靶標殘基，根據參考結構編號）。

步驟 4：結合姿態指標

(2) 接近向量角度。對于每個結合物，接近向量定義為從表位質心指向結合物質心的單位向量：

(3) Jaccard 相似性。表位殘基重疊通過 Jaccard 指數量化。由于殘基編號方案在設計結構和參考結構之間經常不同（觀察到最多 + 35 的偏移），直接比較殘基編號產生系統性假陰性。因此 E_design 和 E_ref 中的殘基在計算前先映射到源自兩個抗原鏈序列比對比對列：

J ∈ [0, 1]；較高的值表示兩個結合物接觸的靶標殘基重疊更大。

• C.2 結果

表 9：所有靶標的結合姿態指標（僅有效比較）

• C.3 關鍵發現

1. 九個靶標在 PDB 中沒有已知的 VHH 復合物結構。BHRF1、CD7、IL-2、IL-20、IL-3、IL-7Rα、InsulinR、PD-1 和 PDGFR 在公共結構數據庫中沒有已沉積的納米抗體復合物，表明這些靶標的設計 VHH 結合模式無法直接與實驗 VHH 參考進行基準比較。

2. 設計的 PD-1 VHH 與天然 PD-1:PD-L1 相互作用界面實質性重疊。與 PD-1:PD-L1 共晶結構（3BIK）的比較產生 0.79 ? 的質心距離、19.5° 的接近角度和 0.56 的 Jaccard 重疊系數。殘基級分析進一步顯示 24 個 VHH 接觸殘基中的 14 個（58%）與天然 PD-L1 結合界面共享，與潛在競爭性抑制機制一致。這些結果共同表明 MMDesign 獨立收斂于功能相關的抑制性界面。

3. PD-L1 和 TNFα 設計確認了驗證功能表位處的序列新穎性。對于兩個有已知 VHH 參考的靶標，設計的 VHH 占據與現有 VHH 相同的功能表位（PD-L1：質心距離 0.7-2.3 ?；TNFα/5M2J：1.03 ?），同時具有與參考 VHH 無直接同源性的完全 de novo CDR 序列，展示了序列水平的新穎性。

設計的 TNFα VHH 與參考 TNFα VHH（5M2J）在 10 個對齊的 CDR 位置上有差異，包括兩個插入 / 刪除事件，表明抗原識別區域存在實質性分歧而非簡單地對現有結合物進行點替換。也就是說，MMDesign 能夠通過 de novo 生成的抗原識別序列獨立恢復治療性驗證的結合解決方案，盡管在模型訓練期間未接觸專利參考。

設計的 PD-L1 VHH 與參考（7CZD）在 9 個 CDR 位置上有差異。PD-L1 活動表明 MMDesign 能夠通過獨立生成的 VHH 序列可重復地恢復治療性驗證的表位幾何結構，支持設計過程的生物學現實性。

4. 幾個靶標顯示與可用 IgG/Fab 參考結構不同的結合模式。IL-2（接近角度 67°-80°）、IL-20（質心距離 14.7 ?）和 BHRF1（接近角度 123°）的設計 VHH 與 PDB 中可用的 IgG/Fab 復合物存在實質性分歧，表明這些設計從檢索到的參考抗體結構未代表的取向接合靶標。

D 方法

• D.1 設計概述

MMDesign 管線遵循「生成 - 然后 - 過濾」策略，包含四個階段：靶標準備、序列 - 結構生成、計算過濾和實驗表征。在生成階段，結構預測模型在幻覺范式 [16] 中運行，從指定的表位共同生成 VHH CDR 序列和全原子復合物結構，每個靶標產生數萬個候選物。在過濾階段，覆蓋序列可表達性、結構可靠性和基于物理的結合評分的多層計算過濾器逐步將候選物池減少到數十個用于濕實驗測試的設計。整體工作流如圖 8 所示。

• D.2 靶標準備

每個活動僅需抗原序列和一組表位熱點殘基位置。VHH 支架模板和 CDR 環長度可由用戶指定或自動分配。

• D.3 序列 - 結構生成

生成核心在幻覺范式中運行：給定抗原序列、熱點位置和 VHH 支架，CDR 序列通過結構預測模型和蛋白質語言模型的反向傳播優化自定義損失函數。這些損失編碼了包括表位接觸、界面質量、結構合理性和序列自然性在內的設計目標，引導序列朝向信心景觀中對應于高質量預測復合物的區域。框架區域在整個優化過程中保持不變。每個活動產生數萬個候選 VHH 序列。

• D.4 計算過濾

過濾級聯評估三個連續標準，每個標準針對不同的失敗模式：

結構可靠性。可靠性沿四個互補軸評估：(a) 單一結構預測器的信心指標（如 pLDDT、ipTM），(b) 跨同一模型的多個隨機種子的可重復性，(c) 兩個或更多獨立預測架構之間的一致性，和 (d) 表位接觸驗證：在預測的復合物結構中，檢查 CDR 殘基是否與指定的熱點位置直接接觸。在種子或模型擾動下產生分歧構象的設計被降低優先級。

可表達性。蛋白質語言模型評估序列自然性，表面性質過濾器去除具有升高聚集傾向的設計。

結合特異性。內部開發的基于物理的評分函數估計結合自由能，并評估預測的界面是否表現出與特異性分子識別一致的特征。

在所有三個層級之后，初始的數萬池被縮小到數十個用于濕實驗測試的設計。當通過所有過濾的候選物數量超過實驗預算時，使用相同的評分函數對最終選擇進行排名和優先級排序。

圖 8：MMDesign 生物制劑發現工作流。候選 VHH 序列和結構通過基于幻覺的優化生成（設計），通過多層計算過濾（過濾），通過 BLI 結合檢測驗證（實驗），并通過動力學分析表征（分析）。

• D.5 實驗表征

蛋白質表達與純化

將人 IgG1 的 CH2 和 CH3 序列融合到每個設計 VHH 的 C 末端。VHH-Fc 構建體在 CHO 系統中以 10 mL 規模表達 5 天；收集上清液并使用 Protein A 磁珠純化。通過還原條件下的 SDS-PAGE 和 SEC-HPLC 確認純度。

結合表征

使用 Gator Pivot 儀器通過生物層干涉法（BLI）進行多循環動力學檢測。

初級結合命中篩選

將攜帶 His 標簽的靶標蛋白和 HSA 分別固定在單獨的 NTA 生物傳感器上，將 VHH 作為分析物以單一高濃度（2,000 nM）施加。表現出靶標結合但不與 HSA 結合的候選物被分類為特異性結合物。檢測序列為：60 秒基線 1、120 秒上樣（靶標位移 0.5 nm）、120 秒基線 2、180 秒結合相、300 秒解離相、30 秒再生和中和。

K_D 測定

將初級篩選中的命中推進到定量親和力測量。通過人 IgG1 Fc 標簽將 VHH 固定在 HFCII 生物傳感器上，將靶標蛋白作為分析物以 2 倍稀釋的四至七點系列施加，實現精確的動力學擬合。檢測序列為：60 秒基線 1、120 秒上樣（靶標位移 1.5 nm）、120 秒基線 2、180 秒結合相、300 秒解離相、30 秒再生和中和。

通用條件

所有步驟在 25°C 下進行，使用 10 mM HEPES、150 mM NaCl、3 mM EDTA 和 0.05% 表面活性劑 P20（pH 7.4）作為運行緩沖液。包括陰性對照（僅緩沖液樣品）用于基線扣除。數據以 10 Hz 收集，并在所有濃度上全局擬合到 1:1 結合模型以獲得 K_D。

多反應性評估

為確認結合由特異性表位相互作用而非非特異性靜電相互作用介導，使用胰島素和 dsDNA 作為替代抗原進行多反應性 ELISA，以 3 μg/ml 在 4°C 過夜包被。用 2% BSA 封閉后，以兩個濃度（5 μg/ml 和 0.5 μg/ml）測試 VHH，在 37°C 孵育 1 小時。使用 HRP 偶聯抗人 IgG Fc 抗體（1:5000）、TMB 底物和 2 M H?SO?終止液進行檢測；在 450 nm 處讀取吸光度。

（以上內容摘自https://zenodo.org/records/20526590報告）