Nat Commun｜心衰炎癥新靶點(diǎn)：LTBP4缺失抑制NLRP3炎癥小體激活，減輕雄性小鼠心力衰竭！(孟丹/郭婕妤/李軍/戴宇翔—復(fù)旦大學(xué)中山醫(yī)院)

2026年5月15日，復(fù)旦大學(xué)中山醫(yī)院孟丹團(tuán)隊(duì)、郭婕妤團(tuán)隊(duì)、李軍團(tuán)隊(duì)、戴宇翔團(tuán)隊(duì)等，聯(lián)合復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院、復(fù)旦大學(xué)中山醫(yī)院上海市心血管病研究所、奧地利格拉茨醫(yī)科大學(xué)等單位，在Nature Communications（中科院1區(qū)，2024 Impact Factor=15.7）在線發(fā)表題為“LTBP4 deficiency inhibits NLRP3 inflammasome activation in cardiomyocytes and attenuates heart failure in male mice”的研究論文。該文于2025年1月27日投稿，2026年4月30日接收，2026年5月15日在線發(fā)表。

該研究聚焦心力衰竭（HF）中心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控機(jī)制。作者發(fā)現(xiàn)，潛在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β結(jié)合蛋白4（LTBP4）在射血分?jǐn)?shù)降低型心力衰竭（HFrEF）患者血漿和心肌細(xì)胞中顯著升高，在橫主動(dòng)脈縮窄術(shù)（TAC）誘導(dǎo)的雄性小鼠心力衰竭模型中也明顯上調(diào)。進(jìn)一步通過心肌細(xì)胞特異性Ltbp4敲除小鼠，研究證明LTBP4缺失可抑制NLRP3炎癥小體激活，改善TAC后心功能障礙并減輕心肌纖維化。

機(jī)制上，壓力超負(fù)荷可部分通過轉(zhuǎn)錄因子SP1上調(diào)LTBP4；AngⅡ刺激后，細(xì)胞內(nèi)LTBP4通過動(dòng)力蛋白被募集至微管組織中心（MTOC），進(jìn)一步促進(jìn)NLRP3向MTOC轉(zhuǎn)位，并增強(qiáng)NLRP3與NEK7的相互作用，從而驅(qū)動(dòng)NLRP3炎癥小體激活。此外，LTBP4還可上調(diào)NLRP3轉(zhuǎn)錄，并在HFrEF患者中與NLRP3和IL-1β水平呈正相關(guān)。該研究揭示了LTBP4-NLRP3-NEK7軸在心力衰竭炎癥反應(yīng)和病理性心臟重構(gòu)中的作用，為心力衰竭炎癥靶向干預(yù)提供了新的機(jī)制線索。

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【摘要】

潛在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β 結(jié)合蛋白 4（LTBP4）此前被報(bào)道與心力衰竭（HF）相關(guān)，但其在心力衰竭中的具體作用仍不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，LTBP4 在心力衰竭患者血漿和心肌細(xì)胞中表達(dá)升高，在橫主動(dòng)脈縮窄術(shù)（TAC）誘導(dǎo)的雄性小鼠心力衰竭模型中也呈現(xiàn)上調(diào)。

在 TAC 后，心肌細(xì)胞特異性 Ltbp4 缺失可減輕 NLRP3 炎癥小體激活、心功能障礙和心肌纖維化。機(jī)制上，壓力超負(fù)荷可部分通過轉(zhuǎn)錄因子 SP1 上調(diào) LTBP4。血管緊張素 II（Angiotensin II，AngII）通過動(dòng)力蛋白（dynein）促進(jìn)細(xì)胞內(nèi) LTBP4 募集至微管組織中心（MTOC）。隨后，LTBP4 促進(jìn)動(dòng)力蛋白介導(dǎo)的 NLRP3 向 MTOC 轉(zhuǎn)位，并增強(qiáng) NLRP3 與 NEK7 的相互作用，從而驅(qū)動(dòng) NLRP3 炎癥小體激活。此外，LTBP4 還上調(diào) NLRP3 的轉(zhuǎn)錄，并且在心力衰竭患者中與 NLRP3 和白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）呈正相關(guān)。

本研究表明，LTBP4 是調(diào)控心肌細(xì)胞中 NLRP3-NEK7 相互作用和 NLRP3 炎癥小體激活的重要因子，提示其可能成為心力衰竭治療的潛在靶點(diǎn)。

01

研究背景及科學(xué)問題

心力衰竭（HF）是多種心血管疾病發(fā)展的終末階段，其主要特征包括心腔內(nèi)壓力升高，以及心肌細(xì)胞因細(xì)胞死亡而減少。炎癥激活在心力衰竭進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。因此，理解心力衰竭中炎癥發(fā)生的分子機(jī)制，對(duì)于尋找潛在治療靶點(diǎn)、改善患者預(yù)后具有重要意義。在壓力超負(fù)荷狀態(tài)下，受到應(yīng)激但仍存活的心肌細(xì)胞會(huì)釋放信號(hào)，啟動(dòng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。不過，心力衰竭過程中，心肌細(xì)胞內(nèi)炎癥信號(hào)如何被精細(xì)調(diào)控，目前仍未完全明確。

NACHT、富亮氨酸重復(fù)序列（LRR）和含 pyrin 結(jié)構(gòu)域蛋白 3（NLRP3）炎癥小體是一種位于細(xì)胞質(zhì)中的蛋白復(fù)合體，可在外源性病原體入侵或內(nèi)源性細(xì)胞損傷刺激下組裝形成。促炎細(xì)胞因子、損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）或病原相關(guān)分子模式（PAMPs）可激活核因子 κB（NF-κB），促進(jìn) NLRP3 和前體白細(xì)胞介素-1β（pro-IL-1β）的轉(zhuǎn)錄。隨后，NLRP3、含 CARD 結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）和前體 caspase-1（pro-CASP1）共同組裝成 NLRP3 炎癥小體。這一組裝過程會(huì)促使 pro-CASP1 裂解為活化的 CASP1，進(jìn)而促進(jìn) IL-1β 和白細(xì)胞介素-18（IL-18）等炎癥因子的成熟和釋放。

值得注意的是，NLRP3 在微管組織中心（MTOC）與 NIMA 相關(guān)激酶 7（NEK7）結(jié)合，是 NLRP3 炎癥小體激活的關(guān)鍵步驟。NLRP3 向 MTOC 的轉(zhuǎn)位由動(dòng)力蛋白和組蛋白去乙酰化酶 6（HDAC6）共同介導(dǎo)。然而，NLRP3 如何感知刺激并啟動(dòng)炎癥小體組裝，其精確機(jī)制仍未完全闡明。

NLRP3 炎癥小體可在多種病理?xiàng)l件下被激活，并在疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。已有研究顯示，NLRP3 缺失可減輕壓力超負(fù)荷狀態(tài)下的心肌細(xì)胞焦亡，并維持心功能；選擇性 NLRP3 炎癥小體抑制劑也可阻止由造血或髓系細(xì)胞 Tet2 缺失導(dǎo)致的心力衰竭發(fā)生。除炎癥細(xì)胞外，心臟細(xì)胞內(nèi)的炎癥小體還可通過細(xì)胞間通訊啟動(dòng)局部炎癥。具體而言，左心室壓力超負(fù)荷可激活交感傳出神經(jīng)，促進(jìn)細(xì)胞外 ATP 分泌，進(jìn)一步刺激心肌細(xì)胞中的 P2X7 嘌呤能受體，并激活 NLRP3 炎癥小體。盡管如此，在心力衰竭中心肌細(xì)胞 NLRP3 炎癥小體被激活的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步明確。

潛在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β 結(jié)合蛋白 4（LTBP4）是 LTBP 家族成員，也是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分。LTBP4 主要包括兩種亞型：短亞型 LTBP4S 和長(zhǎng)亞型 LTBP4L，二者由不同啟動(dòng)子的使用產(chǎn)生。全身性敲除 Ltbp4，包括 Ltbp4s 和 Ltbp4l，會(huì)導(dǎo)致小鼠出生后死亡，而全身性敲除 Ltbp4s 的小鼠則可存活至成年。LTBP4 對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β1（TGF-β1）的正確折疊和分泌至關(guān)重要。此外，LTBP4 可通過與 fibulin-4 和 fibulin-5 結(jié)合，調(diào)控彈性蛋白在細(xì)胞外基質(zhì)微纖維上的沉積。冠狀動(dòng)脈疾病風(fēng)險(xiǎn)基因 ADAMTS7 可通過切割 LTBP4 影響心血管系統(tǒng)中的彈性纖維形成。還有研究提示，LTBP4 與 TNXB、TGFBR1 構(gòu)成的三基因組合，可能提高心肌梗死后心力衰竭的預(yù)測(cè)能力；LTBP4 rs10880 T/T 基因型也可顯著延緩接受激素治療的杜氏肌營養(yǎng)不良癥患者擴(kuò)張型心肌病的發(fā)生。然而，LTBP4 是否參與心力衰竭進(jìn)展，目前仍不清楚。

在本研究中，作者分析了射血分?jǐn)?shù)降低型心力衰竭（HFrEF）患者和健康個(gè)體左心室及血漿樣本中的 LTBP4 表達(dá)水平。同時(shí)，研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了他莫昔芬誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞特異性 Ltbp4 敲除小鼠，并利用橫主動(dòng)脈縮窄術(shù)（TAC）模型研究 Ltbp4 缺失對(duì)心力衰竭的影響。研究重點(diǎn)在于探索 LTBP4 在心力衰竭過程中對(duì)炎癥小體激活、心功能和纖維化的作用，并進(jìn)一步闡明其潛在分子機(jī)制。

02

重要發(fā)現(xiàn)及亮點(diǎn)

LTBP4 在心力衰竭患者和小鼠心肌細(xì)胞中表達(dá)升高，并可被 AngII 或 PE 誘導(dǎo)上調(diào)

為判斷 LTBP4 是否參與心力衰竭進(jìn)展，研究者首先檢測(cè)了 HFrEF 患者和健康對(duì)照心室組織中的 LTBP4 蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，與健康個(gè)體相比，HFrEF 患者心臟中的 LTBP4 蛋白水平顯著升高。隨后，研究者收集了 22 例 HFrEF 患者和 25 例健康對(duì)照的血漿樣本，并通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè) LTBP4 水平，結(jié)果同樣顯示 HFrEF 患者血漿 LTBP4 水平顯著升高。與此一致，在 TAC 誘導(dǎo)的心力衰竭小鼠左心室中，qRT-PCR 和 Western blot 檢測(cè)均顯示 LTBP4 的 mRNA 和蛋白水平均明顯高于對(duì)照小鼠。

進(jìn)一步地，研究者分析了人類特發(fā)性擴(kuò)張型心肌病患者和健康供者心臟的單核 RNA 測(cè)序（snRNA-seq）數(shù)據(jù)集。基于細(xì)胞特異性標(biāo)志物，研究者識(shí)別出心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、周細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T 細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等 12 類細(xì)胞。值得注意的是，心肌細(xì)胞 1 亞群與細(xì)胞凋亡過程和炎癥反應(yīng)相關(guān)。KEGG 和 GO 生物過程分析進(jìn)一步提示，心力衰竭組的心肌細(xì)胞 1 亞群與腎上腺素能信號(hào)、cGMP-PKG 信號(hào)通路、鈣超載以及活性氧（ROS）增加相關(guān)。同時(shí)，該心肌細(xì)胞亞群中的 LTBP4 表達(dá)也升高。

免疫熒光染色結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，HFrEF 患者心臟和 TAC 小鼠衰竭心臟中的心肌細(xì)胞 LTBP4 蛋白明顯上調(diào)；相比之下，TAC 小鼠心臟成纖維細(xì)胞中的 LTBP4 表達(dá)僅輕度升高，且差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨后，研究者用血管緊張素 II（AngII）和苯腎上腺素（PE）刺激新生大鼠心肌細(xì)胞（NRCMs）和新生大鼠心臟成纖維細(xì)胞（NRCFs），以模擬 TAC 誘導(dǎo)的心臟應(yīng)激狀態(tài)。結(jié)果顯示，AngII 或 PE 處理可使 NRCMs 中的 LTBP4 呈劑量依賴性增加，而 NRCFs 中未見顯著變化。總體來看，LTBP4 在 HFrEF 患者心肌細(xì)胞和血漿、TAC 誘導(dǎo)的心力衰竭小鼠心臟，以及 AngII 或 PE 刺激的 NRCMs 中均呈升高趨勢(shì)。

SP1 部分介導(dǎo)壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的 LTBP4 轉(zhuǎn)錄上調(diào)

為解釋 TAC 誘導(dǎo)的心力衰竭小鼠和 AngII 刺激的心肌細(xì)胞中 LTBP4 表達(dá)升高的機(jī)制，研究者利用 JASPAR 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了 motif 分析，發(fā)現(xiàn) LTBP4 啟動(dòng)子區(qū)域存在特異性蛋白 1（SP1）的結(jié)合 motif。隨后，研究者通過 SP1 特異性 siRNA 進(jìn)行敲低實(shí)驗(yàn)，以觀察 SP1 在 AngII 誘導(dǎo) LTBP4 表達(dá)中的作用。

結(jié)果顯示，AngII 刺激可同時(shí)上調(diào) LTBP4 和 SP1 表達(dá)，而敲低 SP1 可顯著減弱 AngII 誘導(dǎo)的 NRCMs 中 LTBP4 表達(dá)升高。TAC 誘導(dǎo)的心力衰竭小鼠中，SP1 蛋白水平也升高，其變化模式與 LTBP4 類似。為了進(jìn)一步確認(rèn) SP1 是否參與 TAC 誘導(dǎo)的小鼠心臟 LTBP4 升高，研究者使用特異性 SP1 抑制劑 Plicamycin。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SP1 抑制可減弱壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的小鼠心臟 LTBP4 升高。由此說明，心臟壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的 LTBP4 上調(diào)至少部分由 SP1 介導(dǎo)。

圖1：LTBP4 在心力衰竭患者和小鼠心肌細(xì)胞中表達(dá)升高，并在 AngⅡ 或 PE 誘導(dǎo)的 NRCMs 中表達(dá)升高。（A）Western blot 分析健康個(gè)體和心力衰竭（HF）患者左心室（LV）中 LTBP4 和 GAPDH 的蛋白表達(dá)，每組 n=6。（B）ELISA 檢測(cè)健康個(gè)體（n=25）和射血分?jǐn)?shù)降低型心力衰竭（HFrEF）患者（n=22）血漿 LTBP4 水平。（C）Western blot 分析假手術(shù)小鼠或橫主動(dòng)脈縮窄術(shù)（TAC）后 7、14 和 28 天小鼠左心室中 LTBP4、SP1 和 GAPDH 的蛋白表達(dá)，每組 n=6。（D）供者和 HFrEF 患者左心室心臟切片的免疫熒光染色（LTBP4、CTNT），每組 n=6。比例尺，30 μm。（E）假手術(shù)小鼠和 TAC 后 28 天小鼠左心室心臟切片的免疫熒光染色（LTBP4、CTNT），每組 n=6。比例尺，30 μm。（F）Western blot 分析經(jīng) 0、1、10、50 和 100 μM AngⅡ 處理的新生大鼠心肌細(xì)胞（NRCMs）中 LTBP4 和 TUBULIN 的蛋白表達(dá)，n=4 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。（G）Western blot 分析在有或無 AngⅡ（10 μM）條件下，轉(zhuǎn)染 Ctrl 或 Sp1 siRNA 的 NRCMs 中 LTBP4、SP1 和 TUBULIN 的蛋白表達(dá)，n=4 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。（H）在有或無 AngⅡ（10 μM）條件下，轉(zhuǎn)染 Ctrl 或 Sp1 siRNA 的 NRCMs 中 Ltbp4 和 Sp1 mRNA 表達(dá)通過 qPCR 檢測(cè)，n=4 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。（I）Western blot 分析在假手術(shù)或 TAC 手術(shù)后 7 天、接受或未接受 Plicamycin 處理的小鼠左心室中 LTBP4、SP1 和 GAPDH 的蛋白表達(dá)，每組 n=6。（A）采用雙側(cè) Welch 檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；（B）和（D–E）采用非配對(duì)雙側(cè) Student’s t 檢驗(yàn)；（C）和（F）采用單因素方差分析并進(jìn)行 Tukey 多重比較檢驗(yàn)；（G）、（H）和（I）采用雙因素方差分析并進(jìn)行 Tukey 多重比較檢驗(yàn)。n 表示生物學(xué)重復(fù)數(shù)。數(shù)據(jù)以均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。源數(shù)據(jù)見 Source Data 文件。

心肌細(xì)胞特異性 Ltbp4 缺失可緩解 TAC 小鼠心力衰竭

為了研究心肌細(xì)胞中 LTBP4 對(duì)心力衰竭進(jìn)展的影響，研究者構(gòu)建了心肌細(xì)胞特異性 Ltbp4 誘導(dǎo)性敲除小鼠（Ltbp4cko）。具體方法是將心肌細(xì)胞特異性表達(dá) Cre 重組酶的 Myh6-CreERT2 轉(zhuǎn)基因小鼠與 Ltbp4flox/flox（Ltbp4fl/fl）小鼠雜交。Ltbp4fl/fl 小鼠通過在 Ltbp4 基因第 2–4 外顯子兩側(cè)插入 loxP 位點(diǎn)構(gòu)建而成。為驗(yàn)證 Ltbp4 是否在心肌細(xì)胞中特異性刪除，研究者分離了 7 日齡 Ltbp4cko 小鼠及其 Ltbp4fl/fl 同窩對(duì)照小鼠的心室心肌細(xì)胞。免疫熒光染色和 Western blot 結(jié)果顯示，Ltbp4cko 小鼠心肌細(xì)胞中的 LTBP4 表達(dá)被特異性消除。基礎(chǔ)狀態(tài)下，Ltbp4cko 小鼠與 Ltbp4fl/fl 同窩對(duì)照小鼠在心功能和纖維化方面無顯著差異。

隨后，研究者在給予他莫昔芬后，對(duì) 10–12 周齡雄性 Ltbp4cko 小鼠和 Ltbp4fl/fl 同窩小鼠實(shí)施 TAC 手術(shù)以誘導(dǎo)心力衰竭。TAC 后 4 周，Ltbp4fl/fl 小鼠出現(xiàn)明顯心功能障礙，同時(shí)心力衰竭標(biāo)志物心房鈉尿肽（ANP）和腦鈉尿肽（BNP）表達(dá)升高，提示模型構(gòu)建成功。TAC 后 4 周取材的心臟組織中，免疫熒光和 Western blot 進(jìn)一步驗(yàn)證了 Ltbp4cko 小鼠心臟中 Ltbp4 的心肌細(xì)胞特異性缺失。ELISA 結(jié)果顯示，TAC 后 Ltbp4cko 小鼠血漿 LTBP4 水平顯著低于 Ltbp4fl/fl 小鼠。

心功能方面，與 TAC 后 Ltbp4fl/fl 小鼠相比，Ltbp4cko 小鼠左心室射血分?jǐn)?shù)（EF%）和短軸縮短率（FS%）顯著升高，左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）和左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）顯著降低，提示心功能得到改善。不過，TAC 后兩組小鼠的心重/體重比（HW/BW）和心重/脛骨長(zhǎng)度比（HW/TL）之間沒有顯著差異。

研究者隨后評(píng)估了 Ltbp4 缺失對(duì)心肌纖維化的影響。Masson 三色染色和天狼星紅染色顯示，TAC 后 4 周，Ltbp4cko 小鼠心臟纖維化程度顯著低于 Ltbp4fl/fl 同窩小鼠。與此一致，Ltbp4cko 小鼠中 Periostin（POSTN）表達(dá)下降。POSTN 是纖維化和心臟重構(gòu)的公認(rèn)標(biāo)志物。qRT-PCR 進(jìn)一步顯示，TAC 后 4 周，Ltbp4cko 小鼠左心室中 Col1a1 和 Col3a1 等纖維化標(biāo)志物表達(dá)顯著低于 Ltbp4fl/fl 同窩小鼠。

此外，研究者將 TAC 誘導(dǎo)的心力衰竭模型延長(zhǎng)至 6 周。TAC 后 6 周，Ltbp4fl/fl 小鼠 ANP 和 BNP 表達(dá)顯著升高；與 Ltbp4fl/fl 同窩小鼠相比，Ltbp4cko 小鼠心肌收縮功能明顯改善，心肌纖維化也顯著減輕。總體而言，這些結(jié)果說明，在心力衰竭進(jìn)展過程中，心肌細(xì)胞 LTBP4 缺失對(duì)心功能具有保護(hù)作用。

圖2：心肌細(xì)胞中 LTBP4 缺失可在 TAC 后 4 周小鼠模型中緩解心力衰竭。（A）從 Ltbp4fl/fl 和 Ltbp4cko 小鼠中分離的新生小鼠心肌細(xì)胞（NMCMs）的免疫熒光染色（LTBP4、CTNT），n=3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。比例尺，20 μm。（B）Ltbp4cko 和 Ltbp4fl/fl 小鼠 TAC 手術(shù)示意圖。Ltbp4cko 小鼠經(jīng)他莫昔芬處理，以在心肌細(xì)胞中條件性敲除 Ltbp4。10–12 周齡小鼠通過手術(shù)誘導(dǎo) TAC。TAC 手術(shù)后第 0、14 和 28 天進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢測(cè)。TAC 后 28 天收集心臟組織。（C）TAC 手術(shù)后 Ltbp4fl/fl 和 Ltbp4cko 小鼠左心室的免疫熒光染色（LTBP4、CTNT），每組 n=3。比例尺，60 μm。（D）ELISA 檢測(cè) TAC 手術(shù)后 Ltbp4fl/fl 和 Ltbp4cko 小鼠血漿 LTBP4 水平，每組 n=6。（E）超聲心動(dòng)圖顯示假手術(shù)或 TAC 手術(shù)后第 0、14 和 28 天 Ltbp4fl/fl 和 Ltbp4cko 小鼠的心功能指標(biāo)（EF% 和 FS%），每組 n=6。（F）Masson 染色（左）和統(tǒng)計(jì)結(jié)果（右）顯示假手術(shù)或 TAC 手術(shù)后 28 天 Ltbp4fl/fl 和 Ltbp4cko 小鼠心臟切片中的心肌纖維化情況，每組 n=6。比例尺，1 mm、120 μm。（G）天狼星紅染色（左）和統(tǒng)計(jì)結(jié)果（右）顯示假手術(shù)或 TAC 手術(shù)后 28 天 Ltbp4fl/fl 和 Ltbp4cko 小鼠心臟切片中的心肌纖維化情況，每組 n=6。比例尺，120 μm。（H）免疫熒光染色（POSTN）（左）和統(tǒng)計(jì)結(jié)果（右）顯示假手術(shù)或 TAC 手術(shù)后 28 天 Ltbp4fl/fl 和 Ltbp4cko 小鼠左心室心臟切片中的心肌纖維化情況，每組 n=6。比例尺，50 μm。（I）通過 qPCR 檢測(cè)假手術(shù)或 TAC 手術(shù)后 28 天 Ltbp4fl/fl 和 Ltbp4cko 小鼠左心室中 Col1a1、Col3a1 和 Ltbp4 的 mRNA 表達(dá)，每組 n=6。（D）采用非配對(duì)雙側(cè) Student’s t 檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；（E–I）采用雙因素方差分析并進(jìn)行 Tukey 多重比較檢驗(yàn)。n 表示生物學(xué)重復(fù)數(shù)。數(shù)據(jù)以均值 ± SD 表示。源數(shù)據(jù)見 Source Data 文件。圖2A 使用 BioRender 付費(fèi)訂閱制作，協(xié)議編號(hào)：HL29JPS98S。

心肌細(xì)胞中 LTBP4 缺失抑制衰竭心臟中的 NLRP3 炎癥小體信號(hào)通路

為闡明心肌細(xì)胞 LTBP4 缺失為何能夠保護(hù) TAC 誘導(dǎo)的心功能障礙，研究者對(duì) TAC 后 Ltbp4cko 和 Ltbp4fl/fl 小鼠心臟進(jìn)行了 RNA 測(cè)序。結(jié)果顯示，與 Ltbp4fl/fl-TAC 組相比，Ltbp4cko-TAC 組共有 376 個(gè)基因上調(diào)、488 個(gè)基因下調(diào)。GO 生物過程分析顯示，Ltbp4cko-TAC 組下調(diào)基因顯著富集于免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和 IL-1β 生成等過程。尤其是 NLRP3 炎癥小體信號(hào)通路相關(guān)基因，如 Nlrp3、Casp1、Il-1β 和 Il-18，在 Ltbp4cko 小鼠衰竭心臟中顯著低于 Ltbp4fl/fl 小鼠。

為驗(yàn)證這一結(jié)果，研究者進(jìn)一步檢測(cè)了有無 TAC 誘導(dǎo)心力衰竭條件下 Ltbp4cko 和 Ltbp4fl/fl 對(duì)照小鼠血漿 IL-1β 水平，以及左心室中 Casp1、Il-1β、Il-18 和 Nlrp3 的 mRNA 水平。在未接受 TAC 手術(shù)時(shí)，Ltbp4cko 小鼠與 Ltbp4fl/fl 同窩小鼠之間，血漿 IL-1β 水平和 NLRP3 炎癥小體相關(guān)基因 mRNA 表達(dá)均無顯著差異。TAC 后，ELISA 顯示 Ltbp4cko 小鼠血漿 IL-1β 水平顯著低于 Ltbp4fl/fl 小鼠；qRT-PCR 也顯示 Ltbp4cko 小鼠左心室中 Casp1、Il-1β、Il-18 和 Nlrp3 表達(dá)下降。

Western blot 結(jié)果顯示，TAC 后成年小鼠心臟中 NLRP3 和 Cleaved-CASP1（p20）蛋白水平升高，其變化趨勢(shì)與 LTBP4 類似。更重要的是，與 TAC 后 Ltbp4fl/fl 小鼠相比，Ltbp4cko 小鼠中 NLRP3、Cleaved-CASP1 以及纖維化標(biāo)志物 COL1A1、α-SMA 的升高均被顯著減弱。此外，CD45 免疫熒光染色提示，心肌細(xì)胞特異性 Ltbp4 缺失可顯著減少 TAC 后炎癥細(xì)胞浸潤。綜合來看，心肌細(xì)胞中 LTBP4 缺失可減輕 TAC 后 NLRP3 炎癥小體信號(hào)通路的激活。

為進(jìn)一步判斷 LTBP4 是否特異性影響心肌細(xì)胞而非心臟成纖維細(xì)胞中的 NLRP3 炎癥小體信號(hào)通路，研究者使用 AngII 或 PE 分別刺激 NRCMs 和 NRCFs。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在 NRCMs 中，NLRP3、Cleaved-CASP1 和 COL1A1 表達(dá)隨刺激濃度升高而上調(diào)，其模式與 LTBP4 類似；但在 NRCFs 中，AngII 或 PE 處理并未引起 NLRP3 和 Cleaved-CASP1 水平顯著變化。此外，與腺病毒對(duì)照 shRNA（Ad-shNC）相比，轉(zhuǎn)染 LTBP4 特異性 shRNA 腺病毒（Ad-shLtbp4）的 NRCMs 中，AngII 或 PE 誘導(dǎo)的 NLRP3 和 Cleaved-CASP1 升高明顯減弱。相反，在 NRCFs 中，無論基礎(chǔ)狀態(tài)還是 AngII 刺激條件下，沉默 LTBP4 均未影響 NLRP3 和 Cleaved-CASP1 水平。這些結(jié)果提示，LTBP4 沉默主要選擇性影響心肌細(xì)胞中的 NLRP3 炎癥小體信號(hào)通路。

圖3：心肌細(xì)胞中 LTBP4 缺失可抑制衰竭心臟和 NRCMs 中的 NLRP3 炎癥小體信號(hào)通路。（A）與 TAC 手術(shù)后 Ltbp4fl/fl 小鼠心臟相比，TAC 手術(shù)后 Ltbp4cko 小鼠心臟中共有 376 個(gè)基因上調(diào)（Up）、488 個(gè)基因下調(diào)（Down）（fold change>1.5）。RNA-seq 結(jié)果火山圖顯示 p 值和倍數(shù)變化。（B）TAC 后 Ltbp4cko 小鼠心臟相較于 Ltbp4fl/fl 小鼠心臟顯著下降基因的 GO 生物過程分析。（C）RNA-seq 熱圖顯示 Ltbp4fl/fl 和 Ltbp4cko 小鼠心臟中 Nlrp3、Casp1、Il-1β、Il-18、Col1a1、Col3a1 和 Ltbp4 的 RNA 表達(dá)。（D）ELISA 檢測(cè)假手術(shù)或 TAC 手術(shù)后 28 天 Ltbp4fl/fl 和 Ltbp4cko 小鼠血漿 IL-1β 水平，其中 Ltbp4fl/fl+Sham 和 Ltbp4cko+Sham 組 n=3，Ltbp4fl/fl+TAC 組 n=6，Ltbp4cko+TAC 組 n=5。（E）通過 qPCR 檢測(cè)假手術(shù)或 TAC 手術(shù)后 28 天 Ltbp4fl/fl 和 Ltbp4cko 小鼠左心室中 Casp1、Il-1β、Il-18 和 Nlrp3 的 mRNA 表達(dá)，每組 n=6。（F）Western blot 分析假手術(shù)或 TAC 手術(shù)后 28 天 Ltbp4fl/fl 和 Ltbp4cko 小鼠左心室中 NLRP3、Cleaved-CASP1、COL1A1、α-SMA、LTBP4 和 GAPDH 的蛋白表達(dá)，每組 n=6。（G）TAC 手術(shù)后 Ltbp4fl/fl 和 Ltbp4cko 小鼠左心室心臟切片的免疫熒光染色（CD45、DAPI），每組 n=6。比例尺，30 μm。（H）Western blot 分析在有或無 AngⅡ（10 μM）條件下，轉(zhuǎn)染 Ad-shNC 或 Ad-shLtbp4 的 NRCMs 中 NLRP3、CASP1、COL1A1、LTBP4 和 TUBULIN 的蛋白表達(dá)，n=4 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。（A–B）采用雙側(cè)超幾何檢驗(yàn)并進(jìn)行 Benjamini-Hochberg 校正；（D–F）和（H）采用雙因素方差分析并進(jìn)行 Tukey 多重比較檢驗(yàn)；（G）采用非配對(duì)雙側(cè) Student’s t 檢驗(yàn)。n 表示生物學(xué)重復(fù)數(shù)。數(shù)據(jù)以均值 ± SD 表示。源數(shù)據(jù)見 Source Data 文件。

LTBP4 激活心肌細(xì)胞中的 NLRP3 炎癥小體信號(hào)通路，并加重細(xì)胞死亡

研究者隨后使用過氧化氫（H?O?）這一已知的 NLRP3 炎癥小體激活誘因，進(jìn)一步觀察 LTBP4 對(duì) NLRP3 炎癥小體信號(hào)通路的影響。在大鼠心肌細(xì)胞系 H9C2 中，H?O? 處理后 NLRP3 和 Cleaved-CASP1 蛋白水平升高，而敲低 LTBP4 可減弱這種升高。相反，與腺病毒陰性對(duì)照（Ad-NC）相比，腺病毒介導(dǎo)的 LTBP4 過表達(dá)（Ad-LTBP4）可在 H?O? 處理?xiàng)l件下進(jìn)一步提高 NLRP3 和 Cleaved-CASP1 蛋白水平。

為了判斷 LTBP4 是否影響 NLRP3 蛋白穩(wěn)定性，研究者在 NRCMs 中進(jìn)行了環(huán)己酰亞胺（CHX）實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，LTBP4 過表達(dá)細(xì)胞與陰性對(duì)照細(xì)胞之間 NLRP3 蛋白半衰期無顯著差異，說明 LTBP4 并未明顯影響 NLRP3 蛋白穩(wěn)定性。qRT-PCR 進(jìn)一步證實(shí)，LTBP4 過表達(dá)可上調(diào) Nlrp3 mRNA 水平，提示 LTBP4 主要通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控而非蛋白穩(wěn)定性提高 NLRP3 水平。

鑒于 NLRP3 炎癥小體與細(xì)胞死亡密切相關(guān)，研究者采用 Calcein-AM 染色和乳酸脫氫酶（LDH）釋放檢測(cè)，分析 LTBP4 是否參與 NLRP3 介導(dǎo)的心肌細(xì)胞死亡。結(jié)果顯示，敲低 Ltbp4 可顯著減輕 H?O? 誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡；相反，LTBP4 過表達(dá)會(huì)加重 H?O? 處理的 NRCMs 細(xì)胞死亡。這些結(jié)果提示，LTBP4 可促進(jìn) H?O? 暴露心肌細(xì)胞中的 NLRP3 炎癥小體信號(hào)通路，并加重細(xì)胞死亡。

為了進(jìn)一步確認(rèn) NLRP3 是否為 LTBP4 的下游效應(yīng)因子，研究者使用特異性 NLRP3 抑制劑 MCC950 抑制其活性。Western blot 顯示，MCC950 可顯著降低 AngII 誘導(dǎo)的 NLRP3 激活，表現(xiàn)為 Cleaved-CASP1 水平下降；同時(shí)，MCC950 也可降低 AngII 刺激后 LTBP4 過表達(dá)引起的 NLRP3 和 Cleaved-CASP1 上調(diào)。此外，MCC950 還能顯著減輕 LTBP4 過表達(dá)所加重的 H?O? 介導(dǎo)細(xì)胞死亡。總體來看，NLRP3 是 LTBP4 參與炎癥通路和細(xì)胞死亡過程中的關(guān)鍵下游介質(zhì)。

圖4：LTBP4 激活 NLRP3 炎癥小體信號(hào)通路，并加重 H?O? 處理心肌細(xì)胞中的細(xì)胞死亡。（A）Western blot 分析在有或無 H?O?（200 μM）條件下，轉(zhuǎn)染 Ad-shNC 或 Ad-shLtbp4 的 H9C2 細(xì)胞中 NLRP3、CASP1、LTBP4 和 TUBULIN 的蛋白表達(dá)，n=6 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。（B）Western blot 分析在有或無 H?O?（200 μM）條件下，轉(zhuǎn)染 Ad-NC 或 Ad-LTBP4 的 H9C2 細(xì)胞中 NLRP3、CASP1、LTBP4 和 TUBULIN 的蛋白表達(dá)，n=6 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。（C）Calcein-AM 染色顯示在有或無 H?O?（300 μM）條件下，轉(zhuǎn)染 Ad-shNC 或 Ad-shLtbp4 的 NRCMs 中活細(xì)胞情況（綠色熒光），n=6 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。比例尺，40 μm。（D）通過檢測(cè)轉(zhuǎn)染 Ad-shNC 或 Ad-shLtbp4 的 NRCMs 細(xì)胞培養(yǎng)上清中釋放的 LDH，計(jì)算在有或無 H?O?（300 μM）條件下的細(xì)胞死亡百分比，n=6 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。（E）Calcein-AM 染色顯示在有或無 H?O?（300 μM）條件下，轉(zhuǎn)染 Ad-NC 或 Ad-LTBP4 的 NRCMs 中活細(xì)胞情況（綠色熒光），n=6 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。比例尺，40 μm。（F）通過檢測(cè)轉(zhuǎn)染 Ad-NC 或 Ad-LTBP4 的 NRCMs 細(xì)胞培養(yǎng)上清中釋放的 LDH，計(jì)算在有或無 H?O?（300 μM）條件下的細(xì)胞死亡百分比，n=6 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。（G）Western blot 分析在 H?O?（200 μM）存在條件下，轉(zhuǎn)染 Ad-NC 或 Ad-LTBP4、并接受或未接受 MCC950（10 μM）孵育的 NRCMs 中 NLRP3、CASP1、LTBP4 和 TUBULIN 的蛋白表達(dá)，n=4 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。（H）通過檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中釋放的 LDH，計(jì)算在 H?O?（300 μM）存在條件下，轉(zhuǎn)染 Ad-NC 或 Ad-LTBP4、并接受或未接受 MCC950（10 μM）孵育的 NRCMs 細(xì)胞死亡百分比，n=6 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。（A–H）采用雙因素方差分析并進(jìn)行 Tukey 多重比較檢驗(yàn)。n 表示生物學(xué)重復(fù)數(shù)。數(shù)據(jù)以均值 ± SD 表示。源數(shù)據(jù)見 Source Data 文件。

細(xì)胞內(nèi) LTBP4 是激活心肌細(xì)胞 NLRP3 炎癥小體信號(hào)通路的主要形式

為了判斷 LTBP4 是通過細(xì)胞外形式還是細(xì)胞內(nèi)形式激活心肌細(xì)胞中的 NLRP3 炎癥小體通路，研究者構(gòu)建了缺失信號(hào)肽的 LTBP4 腺病毒（Ad-LTBP4Δ2-27aa）。這一構(gòu)建體可避免 LTBP4 定位至分泌囊泡，從而將其功能限制在細(xì)胞內(nèi)區(qū)室。表達(dá)全長(zhǎng) LTBP4 的 HEK293T 細(xì)胞上清中可檢測(cè)到 LTBP4，而感染 Ad-LTBP4Δ2-27aa 的細(xì)胞上清中 LTBP4 極少，提示 LTBP4Δ2-27aa 主要位于細(xì)胞內(nèi)。

Western blot 結(jié)果顯示，無論在基礎(chǔ)狀態(tài)還是 AngII 刺激條件下，LTBP4Δ2-27aa 與全長(zhǎng) LTBP4 類似，均可增加 NRCMs 中 NLRP3 和 Cleaved-CASP1 的表達(dá)。此外，LTBP4Δ2-27aa 與野生型 LTBP4 一樣，可顯著增強(qiáng) H?O? 誘導(dǎo)的 NRCMs 細(xì)胞死亡。這些結(jié)果說明，細(xì)胞內(nèi) LTBP4 可能是驅(qū)動(dòng)心肌細(xì)胞 NLRP3 炎癥小體信號(hào)激活和細(xì)胞死亡的主要形式。

圖5：LTBP4 在心肌細(xì)胞內(nèi)激活 NLRP3 炎癥小體信號(hào)通路。（A）LTBP4 信號(hào)肽缺失示意圖。（B）Western blot 分析轉(zhuǎn)染 Ad-NC、Ad-LTBP4 或 Ad-LTBP4Δ2-27aa 的 NRCMs 中 NLRP3、CASP1、LTBP4 和 TUBULIN 的蛋白表達(dá)，n=4 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。（C）Western blot 分析在有或無 AngⅡ（10 μM）條件下，轉(zhuǎn)染 Ad-NC、Ad-LTBP4 或 Ad-LTBP4Δ2-27aa 的 NRCMs 中 NLRP3、CASP1、LTBP4 和 TUBULIN 的蛋白表達(dá)，n=4 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。（D）Calcein-AM 染色顯示在有或無 H?O?（300 μM）條件下，轉(zhuǎn)染 Ad-NC、Ad-LTBP4 或 Ad-LTBP4Δ2-27aa 的 NRCMs 中活細(xì)胞情況（綠色熒光），n=6 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。比例尺，40 μm。（E）通過檢測(cè)轉(zhuǎn)染 Ad-NC、Ad-LTBP4 或 Ad-LTBP4Δ2-27aa 的 NRCMs 細(xì)胞培養(yǎng)上清中釋放的 LDH，計(jì)算在有或無 H?O?（300 μM）條件下的細(xì)胞死亡百分比，n=6 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。（B）、（C）中 NLRP3 和 CASP1 以及（E）采用單因素方差分析并進(jìn)行 Tukey 多重比較檢驗(yàn)；（C）中 LTBP4 和（D）采用雙側(cè) Welch 方差分析并進(jìn)行 Dunnett’s T3 多重比較檢驗(yàn)。n 表示生物學(xué)重復(fù)數(shù)。數(shù)據(jù)以均值 ± SD 表示。源數(shù)據(jù)見 Source Data 文件。

LTBP4 可與 NLRP3 和 NEK7 相互作用，并向 MTOC 募集

為了闡明 LTBP4 調(diào)控 NLRP3 信號(hào)通路的分子機(jī)制，研究者利用 BioGRID 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果提示 LTBP4 與 NLRP3 之間可能存在相互作用。隨后，研究者通過共免疫沉淀（co-IP）實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這一點(diǎn)，包括在 HEK293T 細(xì)胞中過表達(dá) LTBP4-FLAG 和 NLRP3-MYC，在 H9C2 細(xì)胞中檢測(cè) LTBP4-FLAG 與內(nèi)源性 NLRP3，以及檢測(cè) H9C2 細(xì)胞中內(nèi)源性 LTBP4 與內(nèi)源性 NLRP3 的相互作用。GST pull-down 實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證，GST 標(biāo)記的 NLRP3 可直接與 HEK293T 細(xì)胞裂解液中的 FLAG 標(biāo)記 LTBP4 相互作用。免疫熒光染色也顯示，U2OS 細(xì)胞中 LTBP4-FLAG 與 NLRP3-MYC 存在共定位；在 H9C2 細(xì)胞中，H?O? 處理后內(nèi)源性 NLRP3 與內(nèi)源性 LTBP4 的相互作用較未處理對(duì)照增加。

為了進(jìn)一步探索 LTBP4 過表達(dá)增強(qiáng) NLRP3 炎癥小體激活的機(jī)制，研究者在轉(zhuǎn)染 Ad-LTBP4 的 NRCMs 中進(jìn)行了免疫沉淀-質(zhì)譜分析。質(zhì)譜蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NEK7 是 LTBP4 的相互作用蛋白之一。隨后，研究者通過 co-IP 實(shí)驗(yàn)證實(shí)了 LTBP4 與 NEK7 的相互作用，包括在 HEK293T 細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染 LTBP4-FLAG 和 NEK7-HA，以及在 H9C2 細(xì)胞中檢測(cè) LTBP4-FLAG 與內(nèi)源性 NEK7。免疫熒光染色還顯示，U2OS 細(xì)胞中 LTBP4-FLAG 與 NEK7-HA 存在共定位。與細(xì)胞結(jié)果一致，TAC 后小鼠心臟組織中 LTBP4 與 NEK7 的相互作用較假手術(shù)對(duì)照增強(qiáng)。

研究者進(jìn)一步使用 AngII 刺激心肌細(xì)胞，以模擬 TAC 后體內(nèi)心臟應(yīng)激反應(yīng)。結(jié)果顯示，在 AngII 刺激下，NRCMs 中 LTBP4 可共定位至 MTOC，并在該部位增強(qiáng)其與 NEK7 的相互作用。為解釋 AngII 如何誘導(dǎo) LTBP4 定位改變，研究者再次利用 BioGRID 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn) LTBP4 與動(dòng)力蛋白輕鏈 Tctex-type 1（DYNLT1）存在潛在相互作用。DYNLT1 是細(xì)胞質(zhì)動(dòng)力蛋白的一個(gè)亞基，而動(dòng)力蛋白已知可促進(jìn) NLRP3 炎癥小體向 MTOC 轉(zhuǎn)運(yùn)，并且對(duì) NLRP3 炎癥小體激活至關(guān)重要。co-IP 實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在 AngII 刺激的 NRCMs 中，LTBP4 與 DYNLT1 確實(shí)存在相互作用。

為了進(jìn)一步判斷 AngII 是否通過動(dòng)力蛋白促進(jìn) LTBP4 定位至 MTOC，研究者使用動(dòng)力蛋白抑制劑 Ciliobrevin A（CilioA）抑制動(dòng)力蛋白功能。免疫熒光染色顯示，AngII 刺激可增強(qiáng) NRCMs 中 LTBP4 向 MTOC 的定位，而 CilioA 處理則減少 AngII 刺激下 LTBP4 在 MTOC 的共定位。上述結(jié)果共同提示，AngII 刺激后 LTBP4 向 MTOC 的轉(zhuǎn)位部分由動(dòng)力蛋白介導(dǎo)。

圖6：LTBP4 與 NLRP3 和 NEK7 相互作用。（A–B）H9C2 細(xì)胞中 LTBP4 與 NLRP3 的共免疫沉淀（Co-IP）。細(xì)胞轉(zhuǎn)染 Ad-NC 或 Ad-LTBP4 48 小時(shí)后，用 200 μM H?O? 處理 6 小時(shí)，并用抗 FLAG 抗體進(jìn)行免疫沉淀（A）。細(xì)胞經(jīng) H?O? 刺激后，用抗 NLRP3 抗體或?qū)φ?IgG 進(jìn)行免疫沉淀（B）。n=3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。（C）GST pull-down 實(shí)驗(yàn)。將表達(dá) LTBP4-FLAG 的 HEK293T 細(xì)胞裂解液與 GST 標(biāo)記的 NLRP3 蛋白共同孵育。n=3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。（D–E）U2OS 細(xì)胞中 NLRP3-MYC（紅色）和 LTBP4-FLAG（綠色）的免疫染色（D），以及有或無 H?O? 條件下 H9C2 細(xì)胞中 NLRP3（紅色）和 LTBP4（綠色）的免疫染色（E）。細(xì)胞核用 DAPI 染色（藍(lán)色），n=6 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。比例尺分別為 15 μm（D）和 10 μm（E）。（F）HEK293T 細(xì)胞中 LTBP4 與 NEK7 的 Co-IP。細(xì)胞共轉(zhuǎn)染 HA-NEK7 和 FLAG-LTBP4 后，用抗 HA 抗體進(jìn)行免疫沉淀。n=3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。（G）H9C2 細(xì)胞中 LTBP4 與 NEK7 的 Co-IP。細(xì)胞轉(zhuǎn)染 Ad-NC 或 Ad-LTBP4，并經(jīng) H?O? 處理后，用抗 FLAG 抗體進(jìn)行免疫沉淀。n=3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。（H）假手術(shù)或 TAC 手術(shù)后 Ltbp4fl/fl 小鼠左心室中 LTBP4、NLRP3 和 NEK7 的 Co-IP，用抗 NEK7 抗體或?qū)φ?IgG 進(jìn)行免疫沉淀。每組 n=3。（I）在有或無 10 μM AngII 條件下，NRCMs 中 NEK7（綠色）、LTBP4（紅色）和 γ-Tubulin（紫色）的免疫染色。細(xì)胞核用 DAPI 染色（藍(lán)色），n=3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。比例尺，10 μm。（J）NRCMs 中 LTBP4 與 DYNLT1 的 Co-IP。NRCMs 轉(zhuǎn)染 Ad-NC 或 Ad-LTBP4 24 小時(shí)，經(jīng) 10 μM AngII 處理 24 小時(shí)、5 mM Nigericin 處理 1.5 小時(shí)后，用抗 FLAG 抗體進(jìn)行免疫沉淀。n=3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。（K）在接受或未接受 AngII + Nigericin 和 CilioA（25 μM）處理的 NRCMs 中，LTBP4（綠色）和 γ-Tubulin（紅色）的免疫染色。細(xì)胞核用 DAPI 染色（藍(lán)色），n=6 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。比例尺，10 μm。（H）中 NLRP3 采用非配對(duì)雙側(cè) Student’s t 檢驗(yàn)，（H）中 LTBP4 采用雙側(cè) Welch 檢驗(yàn)；（K）采用雙側(cè) Welch 方差分析并進(jìn)行 Dunnett’s T3 多重比較檢驗(yàn)。n 表示生物學(xué)重復(fù)數(shù)。數(shù)據(jù)以均值 ± SD 表示。源數(shù)據(jù)見 Source Data 文件。

LTBP4 促進(jìn) NLRP3 與 NEK7 相互作用，并有助于 NLRP3 炎癥小體組裝

NLRP3 與 NEK7 結(jié)合形成寡聚體，是激活下游炎癥通路的重要過程。前述結(jié)果已經(jīng)證明 LTBP4 可分別與 NLRP3 和 NEK7 相互作用。為進(jìn)一步研究 LTBP4 是否影響 NLRP3 與 NEK7 的結(jié)合，研究者在 HEK293T 細(xì)胞中過表達(dá) LTBP4-FLAG、NLRP3-MYC 和 NEK7-HA，并進(jìn)行 co-IP 實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，LTBP4 過表達(dá)顯著增強(qiáng) NEK7 與 NLRP3 的相互作用。免疫熒光染色也顯示，LTBP4 過表達(dá)可增強(qiáng) U2OS 細(xì)胞中 NLRP3 與 NEK7 的相互作用。

此外，co-IP 結(jié)果顯示，在 TAC 后，與 Ltbp4fl/fl 小鼠相比，心肌細(xì)胞特異性 Ltbp4 缺失顯著降低 Ltbp4cko 小鼠心臟中 NLRP3 與 NEK7 的相互作用。考慮到動(dòng)力蛋白可介導(dǎo) NLRP3 向 MTOC 轉(zhuǎn)運(yùn)并促進(jìn)其與 NEK7 結(jié)合，研究者進(jìn)一步檢測(cè) LTBP4 過表達(dá)是否通過動(dòng)力蛋白依賴性機(jī)制促進(jìn) NLRP3 向 MTOC 轉(zhuǎn)位。免疫熒光染色顯示，LTBP4 過表達(dá)增強(qiáng) NRCMs 中 NLRP3 向 MTOC 的轉(zhuǎn)位；但在使用 CilioA 后，這種增強(qiáng)的轉(zhuǎn)位被削弱。由此說明，LTBP4 過表達(dá)可通過動(dòng)力蛋白促進(jìn) NLRP3 募集至 MTOC。

為了探索 LTBP4 在 NLRP3 炎癥小體形成中的作用，研究者用 Ad-NC 或 Ad-LTBP4 感染 NRCMs。co-IP 結(jié)果顯示，LTBP4 過表達(dá)顯著增強(qiáng) NLRP3 與 Pro-CASP1 的相互作用，提示 LTBP4 有助于 NLRP3 炎癥小體組裝。

隨后，研究者進(jìn)一步研究 NEK7-LTBP4 相互作用在 NLRP3 炎癥信號(hào)通路中的作用。分子對(duì)接分析提示，LTBP4 蛋白 C 端區(qū)域可與 NLRP3 和 NEK7 相互作用。為了進(jìn)一步確定 LTBP4 上與 NLRP3 和 NEK7 結(jié)合的具體區(qū)域，研究者進(jìn)行了截短實(shí)驗(yàn)，在 HEK293T 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染不同長(zhǎng)度的 LTBP4 片段和 NEK7-HA。結(jié)果顯示，LTBP4Δ1326-1624aa（Δ1）、LTBP4Δ1403-1624aa（Δ2）和 LTBP4Δ1574-1624aa（Δ3）均不能與 NEK7 相互作用，提示 LTBP4 的 1574–1624 位氨基酸對(duì)于形成 NEK7 結(jié)合腔至關(guān)重要。

為驗(yàn)證 LTBP4 的 1574–1624 位氨基酸是否參與促進(jìn) NLRP3 炎癥小體信號(hào)通路，研究者構(gòu)建了缺失該區(qū)域的 LTBP4 腺病毒變體（Ad-LTBP4Δ3）。Western blot 顯示，在 H?O? 處理的 H9C2 細(xì)胞中，LTBP4Δ3 上調(diào) Cleaved-CASP1 的能力低于野生型 LTBP4。此外，在 H?O? 處理的 NRCMs 中，LTBP4Δ3 加重細(xì)胞死亡的能力也不如野生型 LTBP4 顯著。這些結(jié)果提示，LTBP4 的 1574–1624 位氨基酸區(qū)域?qū)τ谄湔{(diào)控 NLRP3 炎癥小體信號(hào)通路至關(guān)重要。

為解釋 LTBP4 在不同細(xì)胞類型中作用存在差異的原因，研究者從成年小鼠心臟中分離了心肌細(xì)胞、心臟成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。結(jié)果顯示，NEK7 在心肌細(xì)胞中高度表達(dá)，而在心臟成纖維細(xì)胞中的表達(dá)顯著低于心肌細(xì)胞。因此，LTBP4 與 NEK7 的結(jié)合，是 LTBP4 增強(qiáng)心肌細(xì)胞 NLRP3 炎癥小體激活的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

圖7：LTBP4 促進(jìn) NLRP3 與 NEK7 的相互作用。（A–B）HEK293T 細(xì)胞中 LTBP4、NLRP3 和 NEK7 的外源性 Co-IP 實(shí)驗(yàn)。將編碼 FLAG 標(biāo)記 LTBP4、MYC 標(biāo)記 NLRP3 和 HA 標(biāo)記 NEK7 的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 HEK293T 細(xì)胞 48 小時(shí)后，分別用抗 MYC 抗體（A）或抗 HA 抗體（B）進(jìn)行免疫沉淀。n=6 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。（C）TAC 手術(shù)后 28 天 Ltbp4fl/fl 和 Ltbp4cko 小鼠左心室中 NEK7、LTBP4 和 NLRP3 相互作用的 Co-IP 分析。免疫沉淀使用抗 NLRP3 抗體或?qū)φ?IgG 進(jìn)行。n=3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。（D）在有或無 LTBP4 過表達(dá)、并存在或不存在 CilioA 的條件下，經(jīng) AngII 和 Nigericin 處理的 NRCMs 中 NLRP3（綠色）和 γ-Tubulin（紅色）的免疫染色。細(xì)胞核用 DAPI 染色（藍(lán)色），n=6 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。比例尺，10 μm。（E）NRCMs 中 Pro-CASP1、LTBP4 和 NLRP3 的內(nèi)源性 Co-IP 實(shí)驗(yàn)。NRCMs 在 AngⅡ（10 μM）存在條件下轉(zhuǎn)染 Ad-NC 或 Ad-LTBP4 后，用抗 NLRP3 抗體或?qū)φ?IgG 進(jìn)行免疫沉淀。n=3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。（F）HEK293T 細(xì)胞中的 Co-IP 分析。將編碼 FLAG 標(biāo)記 LTBP4 N 端截短體和 HA 標(biāo)記 NEK7 的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 HEK293T 細(xì)胞 48 小時(shí)后，用抗 FLAG 抗體進(jìn)行免疫沉淀。n=3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。（G）Western blot 分析在 H?O?（200 μM）存在條件下，轉(zhuǎn)染 Ad-NC、Ad-LTBP4 和 Ad-LTBP4Δ3 的 H9C2 細(xì)胞中 Cleaved-CASP1、FLAG 和 TUBULIN 的蛋白表達(dá)，n=6 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。（H）Calcein-AM 染色顯示在 H?O?（300 μM）存在條件下，轉(zhuǎn)染 Ad-NC、Ad-LTBP4 和 Ad-LTBP4Δ3 的 NRCMs 中活細(xì)胞情況（綠色熒光），n=6 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。比例尺，40 μm。（A）采用雙側(cè) Welch 檢驗(yàn)；（B）、（C）和（E）采用非配對(duì)雙側(cè) Student’s t 檢驗(yàn)；（D）、（G）和（H）采用單因素方差分析并進(jìn)行 Tukey 多重比較檢驗(yàn)。n 表示生物學(xué)重復(fù)數(shù)。數(shù)據(jù)以均值 ± SD 表示。源數(shù)據(jù)見 Source Data 文件。

LTBP4 與 HFrEF 患者中 NLRP3 和 IL-1β 水平呈正相關(guān)

為了進(jìn)一步探索 NLRP3 與 LTBP4 之間的關(guān)系，研究者在 HFrEF 患者心臟組織樣本以及 TAC 誘導(dǎo)的心力衰竭小鼠模型中進(jìn)行了免疫熒光染色。結(jié)果顯示，在 HFrEF 患者和心力衰竭小鼠模型的心肌細(xì)胞中，LTBP4 和 NLRP3 均高度表達(dá)并存在共定位。進(jìn)一步分析顯示，HFrEF 患者血漿 LTBP4 水平與 IL-1β 水平之間存在顯著正相關(guān)。此外，研究者還發(fā)現(xiàn)，心力衰竭患者左心室中 LTBP4 與 NLRP3 的基因表達(dá)呈正相關(guān)。總體來看，在人類和小鼠衰竭心臟組織中，LTBP4 與 NLRP3 存在共定位，并且在心力衰竭患者中，LTBP4 表達(dá)與 NLRP3 和 IL-1β 水平呈正相關(guān)。

圖8：LTBP4 與 HFrEF 患者中的 NLRP3 和 IL-1β 呈正相關(guān)。（A）供者和 HFrEF 患者左心室心臟切片中 NLRP3（紅色）和 LTBP4（綠色）的免疫染色，每組 n=3。比例尺，50 μm、12.5 μm。（B）HFrEF 患者血漿 LTBP4 與 IL-1β 水平之間的相關(guān)性分析（n=22）。（C）心力衰竭患者中 LTBP4 與 NLRP3 基因表達(dá)水平之間的相關(guān)性分析（n=17）（GEO 登錄號(hào)：GSE84796）。（D）機(jī)制示意圖顯示，與對(duì)照組相比，HFrEF 患者血漿 LTBP4 水平顯著升高，并與 IL-1β 呈正相關(guān)。心肌細(xì)胞中 LTBP4 缺失可抑制炎癥小體激活，并減輕 TAC 誘導(dǎo)的心力衰竭小鼠模型中的病理性心臟重構(gòu)。機(jī)制上，細(xì)胞內(nèi) LTBP4 增強(qiáng) NLRP3 的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，并與動(dòng)力蛋白 DYNLT1 結(jié)合，協(xié)同介導(dǎo) NLRP3 向 MTOC 轉(zhuǎn)位，從而促進(jìn)心肌細(xì)胞中 NLRP3 與 NEK7 的相互作用。（B–C）采用雙側(cè) Spearman 相關(guān)性檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。n 表示生物學(xué)重復(fù)數(shù)。源數(shù)據(jù)見 Source Data 文件。圖8D 使用 BioRender 付費(fèi)訂閱制作，協(xié)議編號(hào)：DJ29BF4WI8。

【Citation】:Ma, S., Jiang, N., Zuo, Z., Lian, Z., Wu, J., Ma, J., Wei, X., He, Y., Pan, Q., Lin, J., Li, Y., Hou, Y., Zhi, X., Li, X., Osto, E., Dai, Y., Li, J., Guo, J., & Meng, D. LTBP4 deficiency inhibits NLRP3 inflammasome activation in cardiomyocytes and attenuates heart failure in male mice.Nature Communications,2026.

【貢獻(xiàn)】★★★★★

本研究將 LTBP4 確定為炎癥小體激活中的關(guān)鍵因子，并顯示其與 HFrEF 患者 IL-1β 水平相關(guān)。心肌細(xì)胞中 LTBP4 缺失可抑制 NLRP3 炎癥小體激活，并減輕心力衰竭過程中的病理性心臟重構(gòu)。

這些結(jié)果揭示了 LTBP4 在 NLRP3 炎癥小體信號(hào)通路和心力衰竭進(jìn)展中的調(diào)控作用，為理解心力衰竭炎癥機(jī)制提供了重要線索，也提示 LTBP4 相關(guān)通路可能為心力衰竭干預(yù)策略提供新的研究方向。

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