創(chuàng)新藥研發(fā)成敗揭秘：Linker剛性不是越強(qiáng)越好，平衡才是關(guān)鍵

很多人都有這樣的經(jīng)歷：買回來(lái)的家具看起來(lái)設(shè)計(jì)精巧，但裝好之后卻總有些地方不順手——門關(guān)不嚴(yán)、抽屜卡頓。問(wèn)題往往不在大件結(jié)構(gòu)，而出在那些不起眼的連接部位。

PROTAC 分子的設(shè)計(jì)也有類似之處。一個(gè)典型的 PROTAC 由識(shí)別目標(biāo)蛋白的 POI 配體、招募 E3 泛素連接酶的 E3 配體，以及連接兩者的 linker（連接臂）組成。linker 看似只是把兩個(gè)配體連在一起，實(shí)際上卻同時(shí)影響三元復(fù)合物幾何、構(gòu)象分布、細(xì)胞滲透、代謝穩(wěn)定性和代謝物性質(zhì)，是決定候選分子能否繼續(xù)推進(jìn)的關(guān)鍵變量之一。

(a) PROTAC分子結(jié)構(gòu)。 (b) 三元結(jié)構(gòu)組成。(c) 如果沒(méi)有 PROTAC，E2 和 E3 酶無(wú)法與 POI 相互作用，導(dǎo)致無(wú)法降解。(d) 引入 PROTAC 分子。(e) 形成三元復(fù)合物，使 E3 連接酶和 POI 能夠接近。(f) POI 的泛素化。(g) 多聚泛素化標(biāo)記 POI 以進(jìn)行降解。(h) 轉(zhuǎn)運(yùn)至蛋白酶體進(jìn)行降解。(i) POI 分解成肽，完成降解循環(huán)。PROTAC 被回收并準(zhǔn)備形成新的三元復(fù)合物。

因此，linker 設(shè)計(jì)不是簡(jiǎn)單的“選一條長(zhǎng)度合適的鏈”，而是一個(gè)需要同時(shí)處理藥效、DMPK 與安全性約束的多參數(shù)優(yōu)化問(wèn)題。

一、Linker至少影響五個(gè)相互耦合的維度

1. 三元復(fù)合物的空間幾何與動(dòng)力學(xué)

PROTAC 發(fā)揮作用的關(guān)鍵，不只是分別結(jié)合目標(biāo)蛋白和 E3 連接酶，而是形成能夠驅(qū)動(dòng)泛素化的“生產(chǎn)性三元復(fù)合物”。除總體穩(wěn)定性外，復(fù)合物的協(xié)同性、形成與解離動(dòng)力學(xué)、兩個(gè)蛋白的相對(duì)取向，以及目標(biāo)蛋白表面可被泛素化的賴氨酸是否處于合適位置，都可能影響最終降解效率。[1–3]

PROTAC 選擇性誘導(dǎo)靶標(biāo)降解的示意圖

因此，linker 需要提供合適的距離、方向和構(gòu)象約束。過(guò)短可能造成空間位阻，使兩端配體無(wú)法同時(shí)結(jié)合；過(guò)長(zhǎng)則可能增加構(gòu)象熵，使有效取向在全部構(gòu)象中的占比下降。但這并不是單調(diào)關(guān)系：不同 POI–E3 組合可能對(duì)應(yīng)完全不同的最優(yōu)長(zhǎng)度和幾何窗口。

2. 分子的構(gòu)象自由度

柔性鏈段可以幫助分子適應(yīng)不同蛋白表面，并探索更多可能的三元復(fù)合物姿態(tài)；但過(guò)高的構(gòu)象自由度也會(huì)帶來(lái)大量無(wú)效構(gòu)象，并增加結(jié)合時(shí)的構(gòu)象熵代價(jià)。

相對(duì)剛性的 linker 有機(jī)會(huì)減少無(wú)效構(gòu)象、提高有利構(gòu)象的占比，并使結(jié)構(gòu)—活性關(guān)系更容易解釋；但如果剛性片段鎖定了錯(cuò)誤方向，或限制了蛋白表面的適配能力，也可能顯著削弱降解活性。

因此，Linker需要在“靈活”和“受控”之間找到平衡。

3. 細(xì)胞膜滲透

PROTAC 通常處于“超出五規(guī)則”（beyond rule of five，bRo5）的化學(xué)空間，常見(jiàn)特征包括分子量較大、極性較高、氫鍵供體/受體較多以及可旋轉(zhuǎn)鍵較多，這些因素都會(huì)增加被動(dòng)跨膜的難度。linker 的長(zhǎng)度、極性、離子化狀態(tài)和柔性會(huì)進(jìn)一步改變這一平衡。

但二維結(jié)構(gòu)參數(shù)并不能完整解釋滲透性。一些 PROTAC 能夠在不同介質(zhì)中重新分配構(gòu)象群，通過(guò)分子內(nèi)氫鍵、π–π 相互作用或疏水折疊降低暴露的極性表面積，表現(xiàn)出“分子變色龍”特征。研究顯示，linker 的化學(xué)性質(zhì)與柔性對(duì)這類折疊構(gòu)象的形成非常關(guān)鍵。[5,6]

(A) 概述了由Rgyr和 SA 3D PSA定義的化學(xué)性質(zhì)空間中，每個(gè) PROTAC 的五個(gè)結(jié)構(gòu)簇中 26 種構(gòu)象子集的分布情況。性質(zhì)空間中結(jié)構(gòu)多樣性更高的區(qū)域，即所選構(gòu)象密度更高的區(qū)域，用黃綠色和等高線標(biāo)出。(B) 化學(xué)性質(zhì)空間中不同折疊構(gòu)象的分布。折疊構(gòu)象為綠色，半折疊構(gòu)象為藍(lán)色，線性構(gòu)象為紅色。請(qǐng)注意，某些構(gòu)象占據(jù)相同的性質(zhì)空間，因此在圖 A 和圖 B 中重疊顯示。

4. 代謝穩(wěn)定性

linker 往往是 PROTAC 的重要代謝區(qū)域之一，但并非所有分子都以 linker 為主要軟點(diǎn)。具體代謝位置取決于完整分子的構(gòu)象、電子環(huán)境、酶可及性和連接方式。常見(jiàn)反應(yīng)可包括烷基或芳環(huán)羥基化、N/O-去烷基化、酰胺或其他連接鍵水解，以及不同形式的鏈段斷裂。

較長(zhǎng)的 PEG 樣或線性烷基鏈通常會(huì)增加潛在氧化位點(diǎn)，但代謝穩(wěn)定性并不只由鏈長(zhǎng)決定。引入環(huán)狀、不飽和或立體受限片段有時(shí)可以減少軟點(diǎn)或改變酶識(shí)別方式；與此同時(shí)，也可能帶來(lái)溶解度、滲透性或離子化方面的新問(wèn)題。

5. 代謝物的藥理與安全性風(fēng)險(xiǎn)

linker 發(fā)生斷裂后，生成的片段不一定是完全失活的“廢料”。POI 配體相關(guān)代謝物可能仍然結(jié)合靶蛋白，卻無(wú)法招募 E3；E3 配體相關(guān)片段也可能保留一定結(jié)合能力。由于這些代謝物通常比母體分子更小，其游離比例、組織分布和清除速度可能明顯不同。

已有研究表明，某些由 linker 不穩(wěn)定性產(chǎn)生的 POI 結(jié)合型代謝物可以與完整 PROTAC 競(jìng)爭(zhēng)靶點(diǎn)，從而削弱體內(nèi)降解效果。[9] 因此，“母體藥物減少”并不等于藥理作用已經(jīng)結(jié)束。

二、Linker 不是越長(zhǎng)越好，也不是越短越好

在常規(guī)印象中，增加Linker長(zhǎng)度似乎可以為兩端配體提供更大的活動(dòng)空間，讓它們更容易分別找到目標(biāo)蛋白和E3連接酶。然而，對(duì)PROTAC來(lái)說(shuō)，過(guò)度延長(zhǎng)Linker往往得不償失。

當(dāng)鏈段過(guò)長(zhǎng)時(shí)，通常會(huì)出現(xiàn)幾個(gè)問(wèn)題：

第一，分子量繼續(xù)上升，口服吸收和膜滲透更加困難。

第二，可旋轉(zhuǎn)鍵增加，分子的構(gòu)象數(shù)量迅速增多，真正有利于三元復(fù)合物形成的構(gòu)象比例可能下降。

第三，代謝軟點(diǎn)增多，Linker更容易發(fā)生氧化、去烷基化或斷裂。

第四，兩個(gè)蛋白之間的相對(duì)位置變得難以約束，雖然“夠得著”，卻未必能形成適合泛素化的幾何關(guān)系。

另一方面，過(guò)短的 linker 可能造成配體或蛋白之間的空間沖突，也可能迫使三元復(fù)合物采用不利構(gòu)象。

因此，更準(zhǔn)確的設(shè)計(jì)目標(biāo)不是尋找“最小有效長(zhǎng)度”，而是尋找適合特定 POI、E3、連接位點(diǎn)和配體組合的最優(yōu)幾何窗口。這個(gè)窗口既包括端到端距離，也包括出射方向、局部剛性、可折疊性和構(gòu)象群分布。

三、柔性有利于探索，剛性有利于約束，但二者都不是萬(wàn)能答案

在Linker優(yōu)化中，另一個(gè)核心問(wèn)題是柔性與剛性的平衡。

柔性 linker 常由 PEG、烷基鏈或混合鏈段構(gòu)成，合成便利，也容易在早期快速探索 SAR。其代價(jià)是可旋轉(zhuǎn)鍵較多、構(gòu)象數(shù)量龐大，并可能引入多個(gè)氧化或去烷基化位點(diǎn)。

剛性化可以通過(guò)引入哌啶、環(huán)己烷、炔基、芳環(huán)或芳雜環(huán)等片段來(lái)降低部分構(gòu)象自由度。潛在收益包括減少無(wú)效構(gòu)象、改善代謝穩(wěn)定性、改變折疊方式，并提高 SAR 的可解釋性。但不同環(huán)系對(duì)極性、堿性、溶解度和滲透性的影響差異很大。例如，含可質(zhì)子化氮的環(huán)狀片段可能提高溶解度，也可能增加電荷負(fù)擔(dān)；因此不能把“加環(huán)”簡(jiǎn)單等同于“更易成藥”。

BTK PROTAC 的 6e→3e 優(yōu)化案例可以說(shuō)明這一點(diǎn)。6e 含有較長(zhǎng)、柔性的 PEG linker，在小鼠肝微粒體中的半衰期約為 1.3 分鐘；后續(xù)研究同時(shí)探索了剛性 linker 和 CRBN 配體，篩得 3e，其微粒體半衰期超過(guò) 145 分鐘，BTK 降解活性也由 6e 的 DC50 約 41.9 nM 提高到 3e 的 7.0 ± 1.4 nM。[8]

不過(guò)，這一案例不能被解讀為“僅靠剛性化就能帶來(lái)全部改善”，因?yàn)?linker 與 CRBN 配體均發(fā)生了優(yōu)化。更準(zhǔn)確的結(jié)論是：在合適的整體結(jié)構(gòu)背景下，linker 剛性化可以成為同時(shí)改善藥效與代謝性質(zhì)的有效策略之一。

四、連接位點(diǎn)和出射向量，可能比鏈條本身更重要

談到Linker優(yōu)化，人們很容易把注意力集中在鏈長(zhǎng)和化學(xué)組成上，卻忽視了連接位點(diǎn)。

同一條 linker 連接在配體的不同位置，可能產(chǎn)生完全不同的降解活性、選擇性和 DMPK 表現(xiàn)。連接位點(diǎn)會(huì)改變配體的出射方向、三元復(fù)合物的幾何關(guān)系，也可能遮擋原本參與蛋白結(jié)合的關(guān)鍵相互作用。對(duì) BET 降解劑的研究已經(jīng)顯示，改變 warhead 骨架或 linker 的連接向量，可以顯著改變?nèi)獜?fù)合物識(shí)別和細(xì)胞降解活性。[4]

一個(gè)較合理的連接位點(diǎn)通常需要同時(shí)滿足三點(diǎn)：

?位于或接近溶劑暴露區(qū)域，盡量不破壞配體與蛋白的關(guān)鍵相互作用；

?連接后仍能保持足夠的 POI 與 E3 二元結(jié)合能力，并形成有利的三元復(fù)合物取向；

?連接鍵及其鄰近結(jié)構(gòu)不存在明顯的水解、氧化或去烷基化風(fēng)險(xiǎn)。

因此，在實(shí)際項(xiàng)目中，與其只圍繞同一連接位點(diǎn)反復(fù)加長(zhǎng)或縮短鏈條，不如并行建立多個(gè) exit vector（出射向量）系列。很多時(shí)候，問(wèn)題不是“鏈不夠好”，而是“鏈從錯(cuò)誤的方向伸了出去”。

五、Linker 會(huì)影響 PROTAC 如何穿過(guò)細(xì)胞膜

PROTAC 的作用對(duì)象通常位于細(xì)胞內(nèi)，因此，足夠的細(xì)胞暴露是實(shí)現(xiàn)降解的前提。這里存在一個(gè)常見(jiàn)矛盾：為了形成有利的三元復(fù)合物，分子可能需要一定長(zhǎng)度和柔性；為了提高被動(dòng)滲透，又希望減少暴露極性、可旋轉(zhuǎn)鍵和電荷。

分子內(nèi)氫鍵和環(huán)境依賴性折疊是解決這一矛盾的可能路徑之一。需要強(qiáng)調(diào)的是，“變色龍效應(yīng)”并不意味著分子一定在水相中完全展開(kāi)、進(jìn)入膜后才突然折疊。更準(zhǔn)確的描述是：分子在不同介質(zhì)中占據(jù)不同的構(gòu)象群，低極性環(huán)境可能富集更緊湊、暴露極性更低的構(gòu)象，從而有利于膜分配和跨膜。

因此，僅依靠分子量、cLogP、氫鍵數(shù)量和二維 TPSA 等靜態(tài)參數(shù)，通常不足以預(yù)測(cè) PROTAC 的滲透性。更有價(jià)值的評(píng)價(jià)應(yīng)結(jié)合細(xì)胞滲透實(shí)驗(yàn)、溶液構(gòu)象、分子內(nèi)相互作用、離子化狀態(tài)以及不同介質(zhì)中的動(dòng)態(tài)變化。

六、完整 PROTAC 不能被看成三個(gè)零件的簡(jiǎn)單相加

POI 配體、linker 和 E3 配體的單獨(dú)數(shù)據(jù)可以提供設(shè)計(jì)線索，但不能直接外推出完整 PROTAC 的代謝和藥代性質(zhì)。三部分連接后，分子的構(gòu)象、電子環(huán)境、空間遮擋、酶可及性和溶劑暴露都會(huì)發(fā)生變化。原本容易代謝的位點(diǎn)可能被隱藏，原本穩(wěn)定的片段也可能因新的連接方式而出現(xiàn)軟點(diǎn)。

一項(xiàng)針對(duì) 40 個(gè) PROTAC 的人肝細(xì)胞代謝研究顯示，完整分子的代謝行為不能由各組成配體的代謝結(jié)果簡(jiǎn)單預(yù)測(cè)，linker 的化學(xué)性質(zhì)和長(zhǎng)度會(huì)顯著影響代謝易感性。[7]

包含40個(gè)PROTAC的數(shù)據(jù)集

因此，PROTAC 應(yīng)被視為新的、獨(dú)立的化學(xué)實(shí)體，而不是幾個(gè)已知模塊的簡(jiǎn)單拼接。

七、Linker 斷裂后，藥效和安全性可能重新洗牌

linker 斷裂并不是 PROTAC 獨(dú)有的代謝方式，但對(duì)雙功能降解劑尤其值得關(guān)注，因?yàn)閿嗔褧?huì)把一個(gè)具有事件驅(qū)動(dòng)作用機(jī)制的分子，轉(zhuǎn)化為一個(gè)或多個(gè)可能仍具有占位型結(jié)合能力的片段。

從藥效角度看，POI 配體相關(guān)代謝物可能繼續(xù)占據(jù)靶蛋白結(jié)合位點(diǎn)，卻不能招募 E3；如果暴露足夠高，就可能表現(xiàn)為普通抑制劑，或與母體 PROTAC 競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。2024 年報(bào)道的一項(xiàng)口服 ERα VHL-PROTAC 研究中，linker 代謝產(chǎn)生的靶點(diǎn)結(jié)合型代謝物被證實(shí)會(huì)競(jìng)爭(zhēng) ERα，并限制體內(nèi)最大降解程度。[9]

AZ'6421 和化合物 8 在體外和體內(nèi)的 ER 激動(dòng)作用的證據(jù)

從安全性角度看，主要代謝物的結(jié)合譜、游離比例、組織分布和物種差異也可能與母體不同。因此，對(duì)于存在明顯鏈段斷裂的候選分子，至少應(yīng)回答以下問(wèn)題：

1. 主要生成哪些代謝物，斷裂發(fā)生在何處？

2. 這些代謝物在不同物種和不同生物基質(zhì)中的形成比例是否一致？

3. 它們是否仍保留 POI、E3 或其他蛋白的結(jié)合能力？

4. 它們的暴露是否足以改變母體藥物的 PK/PD 關(guān)系、療效或安全窗口？

如果這些問(wèn)題沒(méi)有得到回答，僅監(jiān)測(cè)母體藥物濃度，可能無(wú)法完整解釋體內(nèi)藥效不足、作用延遲或毒性信號(hào)。

八、Linker 優(yōu)化應(yīng)從“單指標(biāo)修補(bǔ)”轉(zhuǎn)向多參數(shù)平衡

linker 設(shè)計(jì)中最常見(jiàn)的誤區(qū)，是發(fā)現(xiàn)一個(gè)問(wèn)題后只修復(fù)一個(gè)指標(biāo)。為提高溶解度而增加極性基團(tuán)，可能降低細(xì)胞滲透；為提高滲透而增加脂溶性，可能加劇非特異性結(jié)合、低溶解度或代謝風(fēng)險(xiǎn)；為提高穩(wěn)定性而大幅剛性化，也可能損害三元復(fù)合物的適配能力。

更現(xiàn)實(shí)的策略，是建立多參數(shù)評(píng)價(jià)框架，至少同步考察：

?二元結(jié)合、三元復(fù)合物形成、協(xié)同性與降解動(dòng)力學(xué)；

?DC50、Dmax、選擇性以及鉤狀效應(yīng)（hook effect）；

?水溶性、生理介質(zhì)溶解度和聚集傾向；

?細(xì)胞滲透、外排和細(xì)胞內(nèi)游離暴露；

?肝微粒體、肝細(xì)胞、血漿或全血穩(wěn)定性；

?主要代謝軟點(diǎn)、代謝物鑒定和跨物種差異；

?血漿蛋白結(jié)合、非特異性結(jié)合與組織分布；

?母體及主要活性代謝物的 PK/PD 關(guān)系。

DMPK 評(píng)價(jià)不應(yīng)等到降解活性優(yōu)化完成后才開(kāi)始。越早識(shí)別水解風(fēng)險(xiǎn)、氧化軟點(diǎn)、低滲透、外排或高非特異性結(jié)合等問(wèn)題，越有機(jī)會(huì)在同一輪 SAR 中同步解決，而不是在后期反復(fù)返工。

結(jié)語(yǔ)：Linker 設(shè)計(jì)是一門多目標(biāo)平衡藝術(shù)

在 PROTAC 分子中，POI 配體決定“找誰(shuí)”，E3 配體決定“請(qǐng)誰(shuí)來(lái)”，而 linker 決定雙方能否以合適的距離、方向和動(dòng)力學(xué)方式相遇。

它影響三元復(fù)合物幾何和協(xié)同性，調(diào)節(jié)分子的構(gòu)象與折疊，參與決定細(xì)胞滲透和體內(nèi)暴露，同時(shí)也可能成為代謝軟點(diǎn)及活性代謝物的來(lái)源。

因此，優(yōu)秀的 linker 并不追求某一個(gè)指標(biāo)的極致，而是在降解活性、選擇性、滲透性、溶解度、代謝穩(wěn)定性和安全性之間找到適合具體項(xiàng)目的平衡。對(duì) PROTAC 而言，這種平衡往往比“鏈長(zhǎng)多少個(gè)原子”更接近真正的成藥問(wèn)題。

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