Phytomedicine (1區，IF=11.3)｜丹酚酸B共價修飾Keap1關鍵半胱氨酸，激活Nrf2緩解藥物性肝損傷（季莉莉/葛廣波/黃鎮林—上海...

2026年6月11日，上海中醫藥大學季莉莉、葛廣波、黃鎮林團隊等，聯合亳州學院、上海中醫藥國際標準化研究院等單位，在Phytomedicine（中科院1區，TOP期刊，IF=11.3）在線發表題為“Salvianolic acid B attenuates drug-induced liver injury in an Nrf2-dependent mechanism via covalently modifying Keap1 at Cys395/Cys434”的研究論文。該文于2026年2月15日投稿，2026年5月29日修回，2026年6月8日接收。

研究發現，丹參來源多酚類成分丹酚酸B（Sal B）可通過共價修飾Keap1的Cys395和Cys434，削弱Keap1-Nrf2相互作用，促進核因子E2相關因子2（Nrf2）抗氧化防御通路激活，從而在藥物性肝損傷（DILI）模型中發揮肝保護作用。值得關注的是，該研究首次提出Keap1 Cys395是調控Nrf2活化的關鍵新型半胱氨酸修飾位點，為從天然產物中開發DILI干預候選物提供了新的機制依據。

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【摘 要】

背景：藥物性肝損傷（DILI）是全球性健康問題，目前治療選擇仍然有限。核因子E2相關因子2（Nrf2）信號通路在抵御DILI中發揮關鍵作用，因此被認為是潛在治療靶點。

目的：本研究旨在探討丹參（Salvia miltiorrhiza Bge.）來源多酚類化合物丹酚酸B（Sal B）對DILI的肝保護作用，并闡明其潛在分子機制，重點關注Nrf2通路。

方法：研究首先通過化合物篩選確定Sal B是一種強效Nrf2激活劑。隨后采用細胞熱轉變實驗（CETSA）、表面等離子體共振（SPR）和微量熱泳動（MST）檢測Sal B與Nrf2抑制蛋白Kelch樣ECH相關蛋白1（Keap1）之間的直接相互作用。研究進一步利用Nrf2敲除（Nrf2-/-）小鼠和肝臟特異性Keap1敲除（Hepcre-Keap1flox/flox）小鼠，評估Nrf2和Keap1在Sal B介導肝保護作用中的功能?；谫|譜的化學蛋白質組學分析和突變實驗用于鑒定Sal B修飾的特定半胱氨酸殘基。分子動力學模擬用于分析Sal B結合后Keap1構象的變化。

結果：Sal B能夠強烈激活Nrf2，而Nrf2敲除顯著削弱其肝保護作用。Sal B可直接結合Keap1。在Hepcre-Keap1flox/flox小鼠中，DILI本身得到緩解，同時Sal B的保護作用也被削弱。進一步研究顯示，Sal B可共價修飾Keap1雙甘氨酸重復（DGR）結構域內的Cys395和Cys434。突變這些殘基會削弱Sal B-Keap1相互作用，并消除Nrf2激活。Sal B的修飾改變了Keap1 Kelch結構域構象，使Nrf2結合口袋變得松散，從而促進Nrf2激活。

結論：Sal B通過共價修飾Keap1的Cys395和Cys434激活Nrf2，從而對DILI發揮肝保護作用。這些發現為Sal B作為DILI潛在新型治療候選物提供了機制依據。

01

研究背景及科學問題

藥物性肝損傷（DILI）是指由藥物及其代謝產物引起的肝毒性反應，嚴重時可進展為急性肝衰竭（ALF）。全球每年DILI發病率約為每百萬人49.4例，其中亞洲發病率最高，約為每百萬人178.2例。在西方國家，對乙酰氨基酚（APAP）和抗菌藥物是DILI的主要原因，其中APAP約占美國ALF病例的39%。相比之下，在東方地區，草藥和抗結核治療是DILI的重要誘因之一，這在一定程度上與草藥在許多亞洲國家醫療體系中的重要地位有關。在中國，草藥性肝損傷約占DILI病例的27%。值得注意的是，在一些西方國家，如美國、冰島和西班牙，草藥補充劑使用較為普遍，草藥性肝損傷同樣在DILI病因中占據較高比例。因此，由藥物和草藥共同導致的肝損傷已成為全球重要公共衛生問題。

激活細胞內抗氧化系統已成為DILI治療中較為公認的策略。例如，N-乙酰半胱氨酸（NAC）是還原型谷胱甘肽（GSH）合成的前體，也是APAP中毒的主要治療藥物。Nrf2是細胞抗氧化應答的關鍵調控因子。Nrf2-ECH同源結構域（Neh）1–7是Nrf2的主要功能區域，其中Neh2含有與Keap1結合的位點。Keap1是Nrf2的主要抑制蛋白，可募集Cullin 3泛素E3連接酶復合物至Neh2結構域，促進Nrf2泛素化和降解。Keap1主要包含三個結構域：N端BTB結構域，可募集Cullin 3；中央IVR區域，可穩定Nrf2結合；以及C端雙甘氨酸重復（DGR）結構域，可與Neh2區域相互作用。破壞Keap1-Nrf2相互作用能夠促進Nrf2激活，因此被認為是緩解氧化應激并減輕DILI的有效策略。

半胱氨酸（Cys）殘基含有巰基（-SH），具有高度親核性，因而特別容易與親電性配體發生反應。這種內在反應活性使其能夠發生共價修飾，并深刻影響蛋白質結構和功能。在Keap1中，特定半胱氨酸殘基的共價修飾可破壞其與Nrf2的相互作用，導致Nrf2穩定和激活。其中，Cys151是目前研究最充分的位點。靶向Cys151的小分子，如富馬酸二甲酯和omaveloxolone，已分別在多發性硬化癥和弗里德賴希共濟失調治療中取得臨床成功。然而，Keap1共含有27個半胱氨酸殘基，其中許多位點仍缺乏充分研究。系統探索這些較少被關注的半胱氨酸殘基，有助于深化對Keap1-Nrf2相互作用的基礎認識，并促進新型Nrf2激活劑發現，從而推動氧化應激相關疾病治療策略的發展。

丹酚酸B（Sal B）是從丹參中分離得到的多酚類化合物。既往研究提示，Sal B可通過激活Nrf2介導的抗氧化信號通路，緩解皮膚衰老、創傷性腦損傷和化療誘導的心臟毒性等多種疾病。基于其優良的抗氧化活性，Sal B也顯示出治療DILI的潛力。本研究發現，Sal B可在體內和體外減輕DILI。進一步機制研究表明，Sal B可共價修飾Keap1上的半胱氨酸殘基，尤其是Cys395和Cys434，從而破壞Keap1-Nrf2相互作用。值得注意的是，本研究首次報道Keap1 Cys395的共價修飾。這一共價修飾促進Nrf2激活，最終參與Sal B抵抗DILI的肝保護作用。

02

重要發現及亮點

Nrf2在DILI中的關鍵作用與Sal B候選物發現

根據引起DILI的潛力，當前FDA批準藥物可被劃分為撤市、黑框警告、警告和注意事項、不良反應四類。本研究選擇了兩種具有代表性的肝毒性藥物進行后續研究：甲氨蝶呤（MTX，黑框警告）和對乙酰氨基酚（APAP，警告和注意事項）。為探索草藥性肝損傷，研究還選擇了三種代表性草藥來源毒性化合物：千里光寧堿（SENE，來源于菊三七Gynura japonica或千里光Senecio scandens）、川楝素（TSN，來源于川楝Melia toosendan）和雷公藤多苷（TWM/TWN，來源于雷公藤Tripterygium wilfordii）。

研究者從GeneCards人類基因組數據庫中篩選DILI相關基因，并進一步利用Metascape數據庫進行分析。富集分析顯示，“對氧水平的反應”和“活性氧（ROS）”等生物過程顯著參與DILI。關鍵基因分析顯示，Nrf2是DILI中的核心分子，在10,172個基因中排名第39位。進一步對APAP、MTX和TWN誘導肝損傷的基因表達數據進行分析，也證實Nrf2始終處于較高排名。這些結果共同提示，Nrf2在DILI發生機制中具有關鍵作用。

由于多數多酚類化合物能夠激活Nrf2，研究者進一步通過分子對接篩選120種天然多酚與Keap1的結合能力。結果顯示，Sal B與Keap1的結合親和力最高。熒光素酶報告實驗進一步證明，Sal B可誘導Nrf2轉錄激活，有效濃度低于20 μM。隨后，研究者選取在分子對接和熒光素酶實驗中均呈陽性的11種多酚，在APAP處理的肝細胞中繼續驗證。結果顯示，Sal B能夠顯著逆轉APAP導致的細胞活力下降。整體來看，Sal B具有激活Nrf2并緩解DILI的潛力。

圖1：Nrf2在DILI中的關鍵作用及Sal B作為靶向治療候選物的發現。（A）代表性藥物性毒性藥物和草藥來源毒性化合物。（B）基于GeneCards數據集（藥物性肝損傷，DILI）的Metascape通路富集分析。（C）DILI相關基因符號散點圖。（D）用于高通量篩選的多酚類化合物與Keap1對接評分圖。（E）多酚類化合物對接值與轉錄激活濃度的散點圖。Sal B被標記為高度有前景的候選化合物。黑色三角形代表Sal B，紅色三角形表示轉錄激活濃度＜20 μM，藍色三角形表示轉錄激活濃度＞20 μM。（F）細胞活力檢測。數據以均值±SEM表示（n = 6）。**p<0.01，與對照組相比；<0.05，#<0.01，與APAP組相比。

Nrf2是Sal B抵抗多種肝毒性藥物損傷的重要基礎

為評估Nrf2在Sal B介導DILI保護中的關鍵作用，研究者分離Nrf2+/+或Nrf2-/-小鼠原代肝細胞，并分別使用兩種代表性肝毒性藥物APAP、MTX，以及三種天然肝毒性化合物SENE、TSN和TWN處理，隨后與Sal B共同孵育。

在Nrf2+/+原代肝細胞中，Sal B顯著提高了APAP、TSN、SENE或TWN降低的細胞活力。然而，在Nrf2-/-原代肝細胞中，Sal B無法恢復APAP、TSN、SENE或TWN導致的細胞活力下降。對于MTX誘導的細胞活力降低，Sal B在Nrf2+/+原代肝細胞中同樣具有逆轉作用，但在Nrf2-/-原代肝細胞中這一保護作用減弱。

ROS檢測結果顯示，在Nrf2+/+原代肝細胞中，Sal B可有效降低上述五種肝毒性物質誘導升高的細胞ROS水平。然而，在Nrf2-/-原代肝細胞中，Sal B降低TSN誘導ROS升高的作用完全消失，對APAP、TWN和MTX誘導ROS升高的抑制作用也明顯減弱。這些結果表明，Nrf2在抵御DILI中發揮重要作用。在所測試的五種肝毒性物質中，Nrf2對Sal B抵抗APAP和TSN誘導肝毒性尤其關鍵。因此，后續研究選擇APAP和TSN作為重點模型。

圖2：Nrf2是Sal B抵抗肝毒性藥物保護作用所必需的。分離自Nrf2+/+或Nrf2-/-小鼠的原代肝細胞經Sal B（10 μM和25 μM）及不同肝毒性物質處理后，檢測細胞活力（左圖）和ROS水平（右圖）。（A）APAP（7.5 mM）。（B）TSN（500 μM）。（C）SENE（50 μM）。（D）TWN（5 μg/ml）。（E）MTX（250 μM）。數據以均值±SEM表示（n = 3）。*p<0.05，與對照組相比；<0.05，與肝毒性物質處理組相比；&p<0.05，&&p<0.01，與Nrf2+/+組相比。

Sal B緩解APAP和TSN誘導肝損傷依賴Nrf2

在動物實驗中，APAP或TSN顯著升高Nrf2+/+小鼠血清ALT/AST活性，而Sal B能夠明顯降低這些升高的肝損傷指標。然而，在APAP處理的Nrf2-/-小鼠中，Sal B的這一作用完全消失；在TSN處理的Nrf2-/-小鼠中，其作用也顯著減弱。同時，Nrf2-/-小鼠中由APAP或TSN引起的ALT/AST升高進一步加重。

組織學觀察顯示，在Nrf2+/+小鼠中，Sal B可緩解APAP誘導的肝細胞核固縮和壞死，以及TSN誘導的肝細胞腫脹。相比之下，在Nrf2-/-小鼠中，APAP誘導更嚴重的肝細胞壞死，TSN導致更大范圍的肝細胞腫脹，并且Sal B改善這些病變的作用完全消失。進一步檢測發現，Sal B可顯著降低Nrf2+/+小鼠肝臟中APAP和TSN誘導升高的ROS水平，但這一作用在Nrf2-/-小鼠中完全消失。Sal B還可逆轉APAP或TSN處理后Nrf2+/+小鼠肝臟GSH含量下降；但在APAP處理的Nrf2-/-小鼠中，Sal B無法恢復GSH含量，在TSN處理的Nrf2-/-小鼠中也僅輕微升高GSH。上述結果說明，Sal B對APAP和TSN誘導肝毒性的保護作用依賴Nrf2。

圖3：Sal B對APAP和TSN誘導肝損傷的保護作用依賴Nrf2。APAP誘導肝損傷：（A-B）血清ALT和AST。（C）肝臟組織學評估。顯示各實驗組代表性圖像。比例尺：50、100 μm。（D）肝臟ROS水平。（E）肝臟GSH水平。TSN誘導肝損傷：（F-G）血清ALT和AST。（H）肝臟組織學評估。顯示各實驗組代表性圖像。比例尺：50、100 μm。（I）肝臟ROS水平。（J）肝臟GSH水平。數據以均值±SEM表示（n = 3–5）。*p<0.05，***p<0.001，與對照組相比；<0.05，#<0.01，##<0.001，與APAP或TSN組相比；&p<0.05，&&p<0.01，&&&p<0.001，與Nrf2+/+組相比。

Sal B通過直接結合Keap1誘導Nrf2活化

動物實驗顯示，在APAP或TSN處理小鼠肝臟中，Sal B促進Nrf2核轉位，并增強肝臟Gclc和Gclm mRNA表達。體外實驗同樣證實，Sal B可在APAP或TSN處理的HepaRG肝細胞中激活Nrf2抗氧化信號軸。

隨后，研究者進一步探索Sal B激活Nrf2的機制。CETSA結果顯示，Sal B處理后Keap1熱穩定性增強，提示Sal B可能與Keap1結合。SPR分析顯示，Sal B與Keap1具有較強結合親和力，平衡解離常數KD為4.171 μM。MST檢測進一步證實Sal B與Keap1之間存在相互作用，解離常數Kd約為14.6 μM。Pull-down實驗顯示，Sal B偶聯磁珠能夠顯著拉下Keap1蛋白，而游離Sal B可削弱這一作用。此外，Co-IP實驗顯示，Sal B顯著降低APAP和TSN處理小鼠肝臟中Keap1-Nrf2相互作用。綜合來看，Sal B通過直接與Keap1相互作用激活Nrf2。

圖4：Sal B通過直接結合Keap1誘導Nrf2活化。（A-B）核Nrf2蛋白水平的代表性蛋白條帶及定量分析，Lamin B1作為上樣內參。（C）CETSA實驗。（D）SPR檢測。（E）MST檢測。（F）用于pull-down實驗的Sal B偶聯磁珠構建示意圖（左圖）；Sal B偶聯磁珠拉下的Keap1蛋白（中圖和右圖）。數據以均值±SEM表示（n = 3）。*p<0.05，與對照組或Sal B組相比；<0.05，與APAP或TSN組相比。

肝臟特異性Keap1敲除削弱Sal B對DILI的保護作用

為驗證Keap1是否是Sal B抵抗DILI的作用靶點，研究者使用肝臟特異性Keap1敲除小鼠開展實驗。APAP和TSN均可顯著升高Keap1flox/flox小鼠和Hepcre-Keap1flox/flox小鼠血清ALT/AST活性。然而，與Keap1flox/flox小鼠相比，Hepcre-Keap1flox/flox小鼠ALT/AST升高幅度明顯較低。Sal B可顯著降低Keap1flox/flox小鼠中APAP或TSN誘導升高的ALT/AST活性；但在Hepcre-Keap1flox/flox小鼠中，Sal B在APAP處理條件下不能降低這些指標，在TSN處理條件下也僅輕度降低。

組織學結果顯示，與Keap1flox/flox小鼠相比，APAP或TSN誘導的肝細胞腫脹和細胞核固縮在Hepcre-Keap1flox/flox小鼠中明顯減輕。Sal B可明顯改善Keap1flox/flox和Hepcre-Keap1flox/flox小鼠中的APAP或TSN誘導肝細胞損傷，但在Hepcre-Keap1flox/flox小鼠中的改善幅度弱于Keap1flox/flox小鼠。

隨后研究者檢測肝臟氧化應激損傷。在Keap1flox/flox小鼠肝臟中，APAP和TSN均顯著降低GSH含量并升高ROS水平，而Sal B可有效逆轉這些變化。相比之下，在Hepcre-Keap1flox/flox小鼠中，APAP未導致肝臟GSH含量下降，Sal B也未進一步提高GSH水平。APAP或TSN誘導的肝臟ROS升高在Hepcre-Keap1flox/flox小鼠中較Keap1flox/flox小鼠更輕，Sal B降低ROS的效果也較弱。類似地，在TSN處理的Hepcre-Keap1flox/flox小鼠中，肝臟GSH水平較Keap1flox/flox小鼠更高，而Sal B僅誘導輕度升高。這些結果提示，Keap1是Sal B發揮Nrf2激活和肝保護作用的重要靶點。

圖5：Sal B對APAP或TSN誘導肝損傷的作用在肝臟特異性Keap1敲除小鼠中的表現。APAP誘導肝損傷：（A-B）血清ALT和AST。（C）肝臟組織學評估。顯示各實驗組代表性圖像。比例尺：50、100 μm。（D）肝臟ROS水平。（E）肝臟GSH水平。TSN誘導肝損傷：（F-G）血清ALT和AST。（H）肝臟組織學評估。顯示各實驗組代表性圖像。比例尺：50、100 μm。（I）肝臟ROS水平。（J）肝臟GSH水平。數據以均值±SEM表示（n = 3–4）。*p<0.05，***p<0.001，與對照組相比；<0.05，##<0.001，與APAP或TSN組相比；&p<0.05，&&&p<0.001，與Keap1flox/flox組相比。

鑒定Sal B結合Keap1的關鍵半胱氨酸殘基

為闡明Sal B與Keap1之間的共價結合機制，并確定關鍵修飾位點，研究者采用基于質譜的化學蛋白質組學分析，系統篩選潛在半胱氨酸殘基。Sal B的特征性碎片離子被進一步解析?？赡軈⑴cSal B結合的候選半胱氨酸殘基包括：位于BTB結構域的Cys77和Cys151，位于IVR結構域的Cys226、Cys249、Cys273、Cys288和Cys297，以及位于DGR結構域的Cys395、Cys434和Cys518。進一步分析中，IVR結構域被細分為IVR-V1和IVR-V2兩個區域，分別包含Cys226/Cys249和Cys273/Cys288/Cys297。由于分子操作環境（MOE）軟件預測Cys518與Sal B的共價結合親和力相對較低，因此后續研究未納入該位點。

基于上述發現，研究者構建了一系列Keap1質粒，用以評估不同結構域中半胱氨酸殘基對Sal B結合的貢獻。這些質粒包括全長Keap1，以及多個結構域特異性半胱氨酸突變體：BTB結構域Cys77和Cys151突變體（Keap1-CBTBA）、IVR結構域Cys226、Cys249、Cys273、Cys288和Cys297突變體（Keap1-CIVRA），以及DGR結構域Cys395和Cys434突變體（Keap1-CDGRA）。

隨后，研究者將這些質粒轉染至Keap1缺失Huh-7細胞，評估Sal B對Nrf2活化的影響。Sal B可顯著提高轉染全長Keap1細胞中的Nrf2蛋白水平。然而，在Keap1-CBTBA轉染細胞中，這一升高輕度減弱；在表達Keap1-CIVRA或Keap1-CDGRA的細胞中，Sal B誘導的Nrf2升高完全消失，同時這些突變并不改變Keap1蛋白水平。MST進一步檢測Sal B與這些GFP標記Keap1變體的結合親和力，結果顯示，Sal B與Keap1、Keap1-CBTBA、Keap1-CIVRA和Keap1-CDGRA結合的Kd值分別為9.52 μM、26.6 μM、56.86 μM和183.2 μM。綜合來看，DGR結構域中的Cys395和Cys434是介導Sal B與Keap1共價相互作用的主要決定因素；IVR結構域中的Cys226、Cys249、Cys273、Cys288和Cys297發揮中等作用；BTB結構域中的Cys77和Cys151對Sal B結合Keap1的貢獻較小。

圖6：鑒定Sal B結合Keap1的關鍵半胱氨酸殘基。（A）利用質譜和親核取代反應鑒定Sal B在Keap1上結合位點的實驗流程示意圖。（B）Sal B與Keap1相互作用的化學結構、加合物分子式和結合位點。（C）Keap1結構模型，顯示半胱氨酸殘基，不同顏色突出顯示。Sal B修飾的半胱氨酸殘基被標出。（D）突變型Keap1質粒構建示意圖。突變的半胱氨酸殘基被標示。（E）Keap1缺失Huh-7細胞和表達Keap1的Huh-7細胞中的Keap1蛋白水平。（F）Keap1缺失Huh-7細胞轉染不同Keap1突變體并經Sal B（10 μM）處理后，Nrf2和Keap1蛋白水平。右側顯示定量灰度分析。數據以均值±SEM表示（n = 3）。*p<0.05，與對照組相比；<0.05，#<0.01，與野生型Keap1相比。（G）MST結合曲線顯示Sal B與Keap1，或Sal B與不同Keap1突變體之間的相互作用。每種相互作用的解離常數（Kd）列于右側。

Sal B主要通過共價修飾Keap1 Cys395和Cys434激活Nrf2

由于DGR結構域Cys395/Cys434和IVR結構域Cys226、Cys249、Cys273、Cys288、Cys297的突變均會削弱Sal B誘導的Nrf2激活，研究者進一步解析這些位點的作用。隨后構建GFP標記Keap1質粒，包括DGR結構域Cys395或Cys434突變體（分別命名為Keap1-C434A-GFP和Keap1-C395A-GFP）、IVR結構域Cys226/Cys249突變體（Keap1-CIVR-1A-GFP），以及IVR結構域Cys273/Cys288/Cys297突變體（Keap1-CIVR-2A-GFP）。

MST分析顯示，Cys395或Cys434突變均顯著降低Sal B與Keap1的結合親和力，Kd值分別由9.52 μM升高至119.4 μM和154.9 μM。相比之下，Cys226/Cys249雙突變和Cys273/Cys288/Cys297三突變僅中等程度降低結合親和力，Kd值分別由9.52 μM升高至53.12 μM和28.8 μM。基于質譜的化學蛋白質組學分析進一步證實，Sal B及其片段可與Keap1肽段中的Cys395和Cys434發生共價結合。細胞活力實驗顯示，在轉染空載體的細胞中，Sal B可有效恢復APAP或TSN降低的肝細胞存活率；但在轉染全長Keap1的細胞中，這種保護作用完全消失。值得注意的是，在表達Cys395和Cys434被替換的Keap1-CDGRA突變體細胞中，這種“保護作用消失”又被逆轉。上述結果提示，Sal B誘導的Cys395和Cys434共價修飾對于Sal B激活Nrf2并抵抗DILI具有重要意義。

研究者進一步采用分子動力學模擬，評估Sal B在Cys395、Cys434或二者同時修飾時Keap1 Kelch結構域構象變化。與未結合配體的apo狀態相比，Cys395/Cys434雙修飾使Kelch結構域回轉半徑（Rg）從1.804 nm升高至1.828 nm。Cys395單修飾使Rg升高至1.823 nm，而Cys434單修飾變化很小，為1.806 nm，接近apo狀態。均方根波動（RMSF）分析顯示，Sal B對Cys395和Cys434的修飾增加了Nrf2結合口袋附近氨基酸的柔性，如Arg336、Asp385、His516、Gln528和Gln563，從而導致該結合口袋結構松散。為進一步確認Keap1-Nrf2結合是否受到影響，研究者進行了集合對接分析。結果顯示，Cys395/Cys434雙修飾降低了Kelch結構域與Nrf2 ETGE基序的中位結合親和力，并略微提高其與DLG基序的親和力。Cys395單獨修飾同時降低Kelch-ETGE和Kelch-DLG結合親和力，而Cys434修飾則使兩者親和力輕度升高，提示相較于Cys434，Cys395在Sal B調控Nrf2-Keap1相互作用中更關鍵。

為從功能層面驗證上述觀察，研究者將編碼全長Keap1、Keap1-CDGRA、Keap1-C395A或Keap1-C434A的質粒轉染至Keap1缺失Huh-7細胞，并進行Sal B處理。結果顯示，Cys434或Cys395單突變以及Cys434/Cys395雙突變均可減弱Sal B增強Nrf2表達的作用，其中雙突變影響最強，但這些突變并不改變Keap1表達。值得注意的是，Keap1-C395A質粒導致的Nrf2表達降低幅度大于Keap1-C434A質粒。與此一致，細胞活力實驗顯示，Sal B可保護肝細胞免受APAP和TSN誘導的肝毒性損傷，而轉染全長Keap1會完全消除這種保護作用。Keap1-C395A轉染可恢復Sal B的肝保護效應，而Keap1-C434A轉染在TSN處理細胞中不能恢復，在APAP處理細胞中也僅部分恢復。整體而言，DGR結構域Cys395的共價修飾對Sal B誘導Nrf2激活和抵抗DILI的肝保護作用至關重要，Cys434也有貢獻，但程度較低。

圖7：Sal B通過共價修飾Keap1的Cys395和Cys434誘導Nrf2活化。（A）突變型Keap1質粒構建示意圖。特定突變的半胱氨酸殘基被標示。（B）MST結合曲線顯示Sal B與Keap1，或Sal B與不同Keap1突變體（Keap1-C434A-GFP、Keap1-C395A-GFP、Keap1-CIVR-1A-GFP和Keap1-CIVR-2A-GFP）之間的相互作用。每種相互作用的解離常數（Kd）列于右側。（C）Sal B修飾肽段的MS碎片譜圖。（D）Keap1缺失Huh-7細胞經APAP或TSN處理后的細胞活力檢測。（E）apo狀態、Cys395修飾、Cys434修飾以及Cys395/434雙修飾Kelch結構域的最大中心結構。Arg336、Asp385、Cys395、Cys434、His516、Gln528和Gln563以球形形式顯示。（F）apo狀態、Cys395修飾、Cys434修飾以及Cys395/434雙修飾Kelch結構域的回轉分析。（G）apo狀態、Cys395修飾、Cys434修飾以及Cys395/434雙修飾Kelch結構域的RMSF分析。具有明顯RMSF變化的殘基被標注。（H）ETGE/DLG基序與apo狀態、Cys395修飾、Cys434修飾以及Cys395/434雙修飾Kelch結構域之間的集合對接分析。（I）Keap1缺失Huh-7細胞轉染不同Keap1突變體并經Sal B（10 μM）處理后，Nrf2和Keap1蛋白水平。右側顯示定量灰度分析。數據以均值±SEM表示（n = 3）。*p<0.05，與對照組相比；<0.05，與野生型Keap1相比；&p<0.05，與Keap1-CDGRA相比。（J）Keap1缺失Huh-7細胞經APAP或TSN處理后的細胞活力檢測。數據以均值±SEM表示（n = 3）。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，與對照組相比；<0.05，#<0.01，##<0.001，與APAP或TSN組相比；&p<0.05，&&&p<0.001，與Vector組相比。

機制示意圖總結

綜合上述結果，Sal B可通過共價修飾Keap1的Cys395和Cys434，引起Keap1構象變化，削弱Keap1-Nrf2相互作用，從而促進Nrf2抗氧化防御系統激活。該機制最終參與Sal B對APAP和TSN誘導DILI的保護作用。

圖8：Sal B通過共價修飾Keap1的Cys395和Cys434誘導Keap1構象變化，進而激活Nrf2，從而緩解DILI的機制示意圖。

【貢獻】★★★★★

本研究表明，Sal B能夠以Keap1/Nrf2依賴性方式有效緩解APAP和TSN誘導的肝損傷。進一步機制研究發現，Sal B可共價修飾Keap1的Cys395和Cys434殘基，從而破壞Keap1-Nrf2相互作用，并最終激活Nrf2抗氧化防御系統。重要的是，研究鑒定Cys395是一個對Nrf2激活具有關鍵意義的新型半胱氨酸修飾位點。這些發現提示，Sal B在DILI臨床管理中具有潛在治療開發價值。

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