CAR-X細胞工程學

引言

嵌合抗原受體（CAR）-T細胞療法已徹底改變了血液惡性腫瘤的治療，并持續改變著多種其他疾病的治療格局。然而，當前的CAR-T細胞療法存在一些限制其療效并阻礙其更廣泛應用的因素，其中部分可歸因于T細胞的內在特性。因此，使用常規T細胞之外的免疫細胞已成為一種有前景的策略，以彌補這些局限性。

一、CAR-X細胞的免疫生物學

不同的免疫細胞平臺擁有不同的效應功能和識別機制，可以通過CAR工程加以利用，以擴大治療范圍并解決限制CAR-Tconv細胞療法的障礙。

NK細胞

NK細胞是先天免疫反應的關鍵組成部分，能夠無需預先致敏即可快速響應病原細胞。大多數循環NK細胞為CD16?CD56?dim表型，具有強大的殺傷腫瘤細胞和病毒感染細胞的能力。這種細胞毒性由多種機制介導，主要包括釋放各種細胞因子、產生細胞毒顆粒（穿孔素和顆粒酶）以及結合死亡受體如Fas配體（FasL）和TNF相關凋亡誘導配體（TRAIL）。與具有效應表型的T細胞相比，NK細胞釋放的促炎細胞因子較少，因此誘發炎癥副作用（如細胞因子釋放綜合征和免疫效應細胞相關神經毒性綜合征）的風險較低。它們較短的壽命也降低了持續激活或過度細胞毒性的風險，但這對過繼性轉移治療構成了挑戰。這些細胞毒性機制，結合有利的安全性特征，使NK細胞成為CAR工程的一個強大而多功能的平臺。

NK細胞的激活由激活信號和抑制信號共同介導。NK激活受體（如NKG2D、NKp46和CD16a）觸發對表達應激誘導配體（如MICA和MICB）的細胞的細胞毒性。相比之下，NK細胞上的抑制性受體（如KIR和NKG2A）與健康細胞上的MHC-I分子結合，識別“自我”信號并抑制NK細胞激活。這個過程使NK細胞能夠檢測到MHC-I缺失或下調的腫瘤細胞，這是一些實體瘤常用的免疫逃逸策略。通過CD16a，NK細胞還能識別IgG包被的病原細胞并介導抗體依賴性細胞毒性（ADCC），有助于抗體依賴性清除。這些識別機制賦予了NK細胞強大而廣泛的靶向能力，使其適用于抗原異質或MHC-I表達下調的腫瘤的細胞免疫治療。

盡管具有固有的細胞毒性和有利的安全性特征，NK細胞的體內功能持久性有限（在沒有外源性細胞因子支持的情況下大約1-2周），且抗原驅動的克隆擴增潛力有限，從而限制了持續的腫瘤殺傷活性。與Tconv細胞相比，NK細胞擁有先天抗病毒防御機制，導致病毒載體的轉導效率較低。此外，NK細胞也容易受到TME內免疫抑制信號的影響。

巨噬細胞

巨噬細胞是先天免疫系統不可或缺的組成部分，通過吞噬病原體和細胞碎片、分泌促炎細胞因子和趨化因子、以及呈遞抗原激活適應性免疫來維持免疫穩態。巨噬細胞對腫瘤來源的趨化因子表現出高趨化性，并能產生基質金屬蛋白酶（MMPs）（特別是MMP9和MMP12），這些酶可以降解細胞外基質（ECM）成分，從而促進強大的腫瘤浸潤。抗腫瘤巨噬細胞大多采用M1極化表型，可由干擾素-γ（IFNγ）或細菌脂多糖誘導。M1極化巨噬細胞執行效應功能，包括吞噬作用、產生細胞毒性活性氧和氮物種、以及分泌促炎細胞因子（例如，IL-1β、IL-6、TNF和IL-12）。這種促炎細胞因子和趨化因子的釋放在驅動全身性炎癥和招募細胞毒性T細胞和NK細胞方面起著關鍵作用，進一步擴大針對病理損傷的免疫激活。

相比之下，由抗炎信號（如IL-4和TGFβ）誘導的M2巨噬細胞促進組織修復，但也促進腫瘤進展。在TME內，缺氧和免疫抑制因子（如TGFβ）使腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）偏向M2樣表型，后者介導免疫抑制，分泌促血管生成因子如血管內皮生長因子（VEGF），并通過MMP2和MMP9重塑ECM。ECM重塑過程促進腫瘤侵襲、轉移以及免疫抑制微環境的形成。因此，盡管M1巨噬細胞的效應功能為實體瘤治療提供了有前景的潛力，但其功能可塑性是巨噬細胞免疫治療臨床轉化的主要挑戰。

Treg細胞

Treg細胞是CD4? T細胞的一個特殊亞型，介導免疫耐受和穩態。Treg細胞的TCR特異性識別自身肽和MHC分子，使Treg細胞能夠調節抗原呈遞細胞（APCs）和效應淋巴細胞的活動。Treg細胞的免疫抑制表型由FOXP3為中心的轉錄網絡和獨特的Treg細胞特異性表觀遺傳景觀共同協調。

FOXP3介導的特征基因表達是Treg細胞主要抑制機制的基礎。CD25（IL-2受體的α鏈，由IL2RA編碼）的組成性高表達使Treg細胞能夠消耗可溶性IL-2，從而限制其對效應T細胞的可用性。這種IL-2剝奪抑制了效應T細胞的激活和增殖。同時，Treg細胞上的CTLA4與APCs上的CD80和CD86結合，競爭性地減少它們與效應T細胞上共刺激受體CD28的結合。IL-2剝奪和共刺激阻斷的結合驅動效應T細胞走向功能失能甚至凋亡。

除了接觸依賴性抑制外，Treg細胞還分泌免疫調節細胞因子（主要是TGFβ和IL-10）以抑制效應T細胞和APCs的活化、細胞因子產生和增殖。Treg細胞可以感知過度炎癥下的代謝變化；例如，FOXP3促進CD39和CD73的表達，這兩種表面外切核苷酸酶可將細胞外ATP水解為腺苷，腺苷可在靶細胞中誘導細胞內抑制信號通路。在過度炎癥條件下，CD39和CD73檢測到過度活化的免疫細胞釋放的細胞外ATP增加，并產生腺苷以抑制其活性。

總的來說，Treg細胞擁有獨特的免疫抑制功能，因此適用于治療以過度激活的免疫反應為特征的疾病，如自身免疫性疾病和移植物抗宿主病（GvHD）。然而，天然Treg細胞僅占循環CD4? T細胞的大約5%，這對大規模擴增和過繼性轉移構成了實際限制。將內在的免疫抑制能力與CAR介導的抗原識別相結合，同時配合定制的擴增和工程策略，可能會增強靶向特異性，改善功能穩定性，并防止不必要的泛免疫抑制。

非常規T細胞

非常規T細胞，包括NKT細胞、γδ T細胞和黏膜相關恒定T（MAIT）細胞，是不同于CD4?和CD8? αβ T細胞的特殊T細胞亞群，在抗原識別和功能特性上均有所不同。與Tconv細胞不同，非常規T細胞通過非多態性抗原呈遞分子或MHC非依賴性機制識別非肽抗原。因此，非常規T細胞在過繼性轉移期間誘發GvHD的風險較低，因此有望用于“即用型”同種異體細胞產品。此外，這些細胞可以介導靶向細胞毒性，表現出獨特的組織趨向性，并橋接先天性和適應性免疫反應。非常規T細胞僅占循環T細胞的大約10%，其低豐度導致它們在傳統細胞免疫治療中較少被探索。盡管如此，它們的獨特特征可能有助于克服CAR-Tconv細胞的某些局限性，如抗原逃逸和TME抑制。

NKT細胞：NKT細胞是T細胞的一個獨特亞群，結合了T細胞和NK細胞的細胞毒性機制和靶標識別能力。恒定NKT（iNKT）細胞是主要的NKT細胞亞群。它們通過半不變TCR識別由非多態性CD1d分子呈遞的甘油脂抗原，該TCR由保守的α鏈與受限的β鏈庫配對組成，這與Tconv細胞形成對比，后者表達通過廣泛V（D）J重組產生的、高度多樣化的TCRs。值得注意的是，iNKT細胞在惡劣的TME中表現出顯著的適應性；它們可以靶向免疫抑制區室（如TAMs和髓源性抑制細胞），這些細胞通常在其表面表達CD1d。通過細胞毒顆粒釋放、死亡受體結合和細胞因子分泌，iNKT細胞可以清除這些表達CD1d的抑制性區室。此外，iNKT細胞對腫瘤來源的趨化因子（包括CCL2和CCL20）表現出強烈的趨化反應，從而促進有效的腫瘤歸巢。在一項直接比較NK細胞和iNKT細胞的臨床前小鼠模型中，在晚期乳腺癌的TME中觀察到了不同的功能狀態。NK細胞表現出衰老特征。相比之下，iNKT細胞保持了過度激活的表型，并保留了效應功能。這種激活狀態的特征是耗竭相關抑制性受體（包括CTL4A、TIM3和PD1）的表達減少，同時激活和細胞毒性分子（如顆粒酶B、NKG2D和IFNγ）的表達增加。這些特征支持了iNKT細胞浸潤實體瘤并在免疫抑制性TME內維持功能的能力。

γδ T細胞：γδ T細胞以其TCRs為特征，該TCR由γ鏈和δ鏈組成，而不是Tconv細胞中的α鏈和β鏈。雖然它們僅占循環T細胞的大約4%（0.5-16%），γδ T細胞與αβ T細胞一起在抗腫瘤中起著關鍵且不可替代的作用。根據可變δ鏈（Vδ）的組成，γδ T細胞分為Vδ1、Vδ2、Vδ3和Vδ5。其中，Vδ2是主要群體（占γδ T細胞的60-95%），而Vδ1細胞最多占三分之一。Vδ2細胞大多在周圍血中循環并表現出細胞毒活性，而Vδ1細胞優先存在于黏膜組織中。在TCR結合后，γδ T細胞分泌I型細胞因子（包括TNF和IFNγ），產生細胞毒顆粒，并介導死亡受體結合。它們還可以作為APCs將腫瘤抗原交叉呈遞給αβ T細胞，從而放大抗腫瘤反應。由于其強大的細胞毒性，Vδ2細胞一直是γδ T細胞免疫治療各種實體瘤的焦點。Vδ1細胞也因其記憶樣表型、對激活誘導凋亡的抵抗性以及向實體瘤的浸潤而受到關注。腫瘤浸潤Vδ1細胞的存在與良好的患者預后相關，表明其治療價值。此外，γδ T細胞也表達NK激活受體（例如，NKG2D和NKp33）以發揮不依賴于TCR的細胞毒性。例如，Vδ2細胞具有高水平的CD16，可以識別抗體的Fc區以介導ADCC。

MAIT細胞：MAIT細胞優先聚集在黏膜組織中，并表達半不變TCR α鏈（Vα7.2-Jα33）。MAIT細胞平均占總T細胞的3.1%（0.1-9.2%）。它們的TCR特異性識別由MHC I類相關蛋白1（MR1）呈遞的微生物衍生代謝物，MR1是一種在骨髓來源的APCs和一些上皮細胞上高表達的非多態性分子。值得注意的是，M2極化的TAMs可以表現出MR1表達升高，使得MR1高表達的巨噬細胞更容易受到MAIT細胞介導的靶向，這可能有助于MAIT細胞適應免疫抑制性TME。MR1限制性激活通過釋放效應分子（如顆粒酶）和促炎細胞因子（包括IFNγ、TNF和IL-17）觸發MAIT細胞強大的細胞毒性。組織駐留MAIT細胞分泌的IL-17促進中性粒細胞招募，激活的MAIT細胞可以通過上調CD40L與樹突狀細胞相互作用，從而反式激活其他免疫細胞。與其他兩種非常規T細胞類似，MAIT細胞也表達幾種NK細胞激活受體（如NKG2D、NKp40和NKp33），使其能夠不依賴于MR1而激活，從而拓寬其腫瘤靶向能力。重要的是，MAIT細胞上的MR1限制性和半不變TCR在同種異體骨髓移植過程中不介導同種異體反應，表明其具有用于“即用型”細胞產品的潛力。

總的來說，這些非常規T細胞表現出獨特的免疫屬性，包括特殊的靶標譜、組織趨向性和對惡劣TME的適應性，這可以彌補CAR-Tconv細胞療法面臨的挑戰。

二、CAR-X細胞的制造與工程

CAR-NK細胞

NK細胞可以從患者的外周血單個核細胞（PBMCs）中獲取，并使用添加了細胞因子（主要是IL-2）的培養基和經輻照的飼養細胞進行擴增。然而，循環NK細胞的低豐度（約占循環淋巴細胞的10%）、功能持久性短（通常1-2周）以及對基因修飾的抵抗性限制了PBMCs來源NK細胞的效率。因此，大多數臨床前和臨床研究傾向于使用非自體來源來開發CAR-NK細胞，包括NK-92細胞系、臍帶血（UCB）、誘導多能干細胞（iPS細胞）、CD34?造血祖細胞和人胚胎干細胞。其中，UCB來源的NK細胞是臨床研究中最廣泛使用的來源（NCT00900809、NCT03056339和NCT05008575；）。

臨床UCB通常從冷凍保存的臍帶血單位中獲得，進一步通過CD3、CD19和CD14陰性選擇進行純化以分選出NK細胞。外源性IL-2、飼養細胞膜結合IL-21和4-1BB配體對于UCB來源CAR-NK細胞的體外維持至關重要。人誘導多能干細胞是另一個重要來源，可以使用飼養細胞支持培養和逐步細胞因子驅動條件分化為功能性NK細胞，這些條件促進造血定向和NK細胞成熟。這些誘導的NK細胞來源受到青睞，因為它們同種異體反應風險較低，易于進行基因修飾，并且可以在體外大規模擴增，使其對“即用型”產品開發具有吸引力。

對于CAR轉導，逆轉錄病毒載體仍然是主要方法，效率為22.7-91.1%（中位數約60%）。非病毒方法，如電穿孔和脂質納米顆粒（LNPs），已被探索，但到目前為止尚未達到病毒系統的效率。

CAR-NK細胞中的CAR結構與CAR-T細胞中的主要區別在于共刺激域的選擇。在CAR-T細胞設計中，CD28共刺激通常與更強的細胞毒性相關，但也與快速耗竭相關，而4-1BB共刺激則促進持久的抗腫瘤反應并支持記憶表型。相比之下，在CAR-NK細胞中，CD28共刺激可以在體外和小鼠模型中產生強大的抗腫瘤活性，其持久性和腫瘤浸潤能力與4-1BB共刺激相當。機制研究表明，CAR-NK細胞中的CD28信號傳導招募各種關鍵激酶，主要是淋巴細胞特異性蛋白酪氨酸激酶（LCK）和ζ鏈相關蛋白激酶70（ZAP70），這可能增強CAR-NK細胞功能并減輕基礎信號傳導。盡管如此，尚無確切的臨床證據來確定在CAR-NK細胞背景下CD28還是4-1BB更優越，因為兩者都經常被應用。

其他策略包括將NK細胞特異性信號分子整合到CAR結構中，以利用天然的NK細胞信號通路。此類分子包括NKG2D、LFA-1、2B4、DAP10和4-1BB。

CAR-巨噬細胞

PBMCs來源的單核細胞仍然是人源化模型中CAR-巨噬細胞研究的主要來源，而THP-1單核細胞系在臨床前研究中常被用作替代物。在臨床研究中，單核細胞先用G-CSF從外周血中動員，然后通過單采術獲得，隨后通過補充GM-CSF分化為巨噬細胞（NCT06562647和NCT04660929）。

工程化的CAR-巨噬細胞被保存在含有關鍵細胞因子的培養基中，主要是M-CSF和GM-CSF，這些因子支持譜系規范和功能成熟。除了PBMCs中的單核細胞外，iPS細胞是治療性CAR-巨噬細胞的另一個重要來源，因為其具有卓越的基因可操作性和可擴展性。生成iPS細胞來源CAR-巨噬細胞的主要挑戰在于精確地將iPS細胞定向分化為巨噬細胞。一個逐步分化方案使用連續暴露于細胞因子，包括bFGF、VEGF、SCF、IGF1、IL-3、M-CSF和GM-CSF。在最終分化階段去除IL-3使M-CSF和GM-CSF能夠驅動終末分化和功能極化，產生具有一致表型和效應功能的CARa-巨噬細胞。

病毒轉導是向巨噬細胞遞送CAR基因的主要策略；例如，Ad5F35腺病毒系統實現了平均79.28%的穩健CAR轉導效率、86.39%的細胞活力和86.78%的純度（NCT04660929）。慢病毒載體也已用于轉導CAR-巨噬細胞；可以通過優化感染條件來提高轉導效率，包括去除聚凝膠、將病毒暴露時間延長至過夜孵育、摻入密碼子優化的VSV-G包膜，以及將感染延遲至單核細胞分離后7天。

盡管如此，由于巨噬細胞具有獨特的核酸傳感通路，會觸發抗病毒防御并限制基因轉移效率，非病毒遞送策略正受到越來越多的關注。例如，已經探索使用LNPs將CAR mRNA遞送到巨噬細胞中并實現原位編程。有趣的是，由于巨噬細胞具有天然的吞噬能力，它們能非常有效地內化納米顆粒（如LNPs），這使得巨噬細胞非常適合進行體內CAR工程。此外，豐富的腫瘤駐留TAMs可以通過體內CAR工程（例如DNA納米載體）重編程為M1極化表型，從而實現局部區域抗腫瘤效應并降低全身性炎癥的風險。

早期的臨床前CAR-巨噬細胞設計整合了巨噬細胞特異性信號分子的胞內結構域，例如Megf10和FcRγ以驅動吞噬作用，以及CD147以促進MMP產生。這種策略后來通過整合來自模式識別受體和其他巨噬細胞相關受體的結構域而得到擴展。例如，FcγR1（天然介導巨噬細胞中的細胞因子釋放和抗體依賴性細胞吞噬作用）已被整合到CAR結構中，在體內顯示出良好的抗腫瘤功效和吞噬活性。其他功能受體，如MerTK、Megf10和FcRγ，同樣增強了抗原依賴性吞噬作用，改善了抗原呈遞，并在多種實體瘤模型中減輕了腫瘤負荷。然而，這些CAR結構也引發了關于巨噬細胞介導的全身性炎癥的安全性問題，因此尚未進行進一步的臨床評估。相比之下，經典的CD3ζ-CAR結構具有明確的安全性特征。盡管CD3ζ在天然巨噬細胞中通常不表達，但CD3ζ-CAR可以在體外促進CAR-巨噬細胞的吞噬作用和細胞因子產生，并在卵巢癌和表達GD2的神經母細胞瘤小鼠模型中顯著減輕腫瘤負荷且副作用可耐受。這一結果可能是由于CD3ζ和FcRγ之間的結構同源性。這種功能穩健性使CD3ζ-CAR成為第一個進入臨床試驗的CAR-巨噬細胞設計（NCT04660929；）。

CAR-巨噬細胞的一個關鍵功能考慮是促進和維持輸注后的M1樣表型。將CD3ζ與來自TLR4的TIR結構域串聯融合可增加NF-κB核轉位并維持促炎細胞因子表達，這些都是M1樣極化的強烈跡象。但與M1極化相關的強效促炎細胞因子產生和效應功能引發了關于全身性炎癥副作用的潛在擔憂。在臨床應用之前，需要進一步的改進以提高功能性和安全性。

CAR-Treg細胞

在當前的CAR-Treg細胞研究中，從CD4?富集的PBMCs中分選出的CD4?CD25highCD127?天然Treg（nTreg）細胞因其功能穩定性而受到青睞。CAR結構通常通過逆轉錄病毒載體遞送到nTreg細胞中，隨后用抗CD3/CD28磁珠刺激以誘導激活和擴增。工程化的CAR-Treg細胞然后在補充有重組IL-2的X-VIVO15培養基中培養，IL-2對其存活和維持FOXP3表達至關重要。為了進一步維持FOXP3依賴性免疫抑制表型的穩定性并有選擇地限制效應Tconv細胞的增殖，通常將mTOR抑制劑（如雷帕霉素或依維莫司）與IL-2一起加入培養基中。盡管這些基于nTreg的方案使得在臨床前CAR-Treg細胞研究中能夠在體外生成CAR-Treg細胞，但nTreg細胞固有的低豐度（約占循環CD4? T細胞的5%）仍然是臨床轉化的一個關鍵限制。

相比之下，誘導性Treg（iTreg）細胞是通過轉化CD4? Tconv細胞產生的，與nTreg細胞相比，提供了更具可擴展性的來源。iTreg細胞在當前的CAR-Treg細胞研究中較少受到重視，因為產生具有穩定體內免疫抑制表型的iTreg細胞存在技術障礙。iTreg細胞容易丟失FOXP3表達并獲得效應T細胞表型，特別是在炎癥條件下。CAR-iTreg細胞是通過同時將外源性FOXP3和CAR基因導入CD4? Tconv細胞中產生的，但功能評估主要局限于體外分析。盡管未評估體內譜系穩定性，但適度的體內結果可能反映了這些CAR-iTreg細胞的不穩定性。沿著這些思路，僅誘導FOXP3不足以在特征基因位點建立Treg細胞特異性DNA低甲基化，這對于穩定的Treg細胞表型至關重要。因此，確保FOXP3表達和Treg細胞特異性表觀遺傳景觀對于生成功能穩定且臨床可擴展的CAR-iTreg細胞至關重要。

例如，為了更有效地誘導FOXP3，可以在IL-2之外聯合添加TGFβ和細胞周期蛋白依賴性激酶8（CDK8）和CDK19抑制劑，因為它們不僅可以誘導FOXP3表達，還可以限制效應T細胞分化。此外，在體外轉化過程中剝奪CD28共刺激信號可以促進在Treg細胞特征基因增強子區域建立Treg細胞特異性DNA低甲基化，該過程不依賴于FOXP3。將這些策略相結合，可以在炎癥性腸病和GvHD的小鼠模型中產生穩定且功能性的iTreg細胞，并具有抑制效力。將這種穩定且功能性iTreg細胞策略與CAR工程相結合，是開發具有增強譜系穩定性、抑制效力和轉化可擴展性的CAR-Treg細胞的一個有前景的方向。

CAR-Treg細胞中的CAR結構尚未整合許多新的或定制的設計，大多采用第二代CAR結構。然而，與Tconv細胞相比，CAR-Treg細胞對共刺激域表現出不同的偏好。在一項對十種整合了不同共刺激域的CAR-Treg細胞構建體進行的體內比較評估中，野生型CD28設計顯示出優于所有其他構建體（包括那些含有4-1BB的構建體）的抑制功能。在自身免疫性疾病和GvHD模型中的其他體內研究也證實，與4-1BB相比，CD28共刺激顯著增強了功能穩定性和治療功效。這種差異反映了Treg細胞獨特的免疫生物學特性；CD28信號傳導對于維持Treg細胞增殖和CTLA4表達至關重要。相比之下，CAR-Treg細胞中的4-1BB共刺激容易引發基礎激活，從而降低譜系穩定性。在體外擴增期間，短暫暴露于mTOR抑制劑和維生素C可以減輕4-1BB CAR-Treg細胞中基礎信號傳導誘導的功能障礙，這可能是由于特征基因位點的表觀遺傳修飾。盡管如此，對于CAR-Treg細胞而言，CD28仍然是最功能穩定的共刺激域。

非常規CAR-T細胞

臨床iNKT細胞是從自體PBMCs中提取的，使用靶向恒定TCR α鏈Vα24-Jα18的特異性微珠。分離的iNKT細胞使用依賴于飼養細胞的系統進行刺激和培養，該系統以α-半乳糖神經酰胺（αGC）脈沖的PBMCs為特征。αGC是一種合成的甘油脂抗原，可以被PBMCs中APCs上的CD1d呈遞；因此，αGC脈沖的PBMCs可以刺激iNKT細胞的激活和擴增。此外，αGC脈沖的人工APCs（aAPCs）結合IL-2能夠產生臨床規模的CAR-iNKT細胞劑量（每次輸注≥1 × 10?個細胞）。在體外擴增期間補充重組IL-2和IL-21進一步增強了CD62L? iNKT細胞的富集，將其豐度在初次擴增后增加到80.4%，而單獨使用IL-2時為56.9%。這些擴增的CAR-iNKT細胞在體外和淋巴瘤小鼠模型中表現出抗腫瘤活性。盡管這種PBMCs來源、依賴飼養細胞的方案效率很高，但iNKT細胞僅占循環T細胞的0.01-0.1%，這對可擴展的臨床應用構成了挑戰。

使用可擴展的同種異體來源開發“即用型”CAR-iNKT細胞是一個有前景的替代方案。來自臍帶血來源的造血干細胞可以被引導分化為各種類型的免疫細胞，包括iNKT細胞。為了生成臍帶血來源的同種異體CAR-iNKT細胞，CD34? HSCs通過CAR慢病毒和CRISPR-Cas9（B2M-CIITA引導RNA）進行共編輯。B2M和CIITA引導RNA引導敲除人類白細胞抗原I類（HLA-I）和HLA-II分子，從而產生HLA? CAR-HSCs。然后，通過一個逐步程序將同種異體CAR-HSCs分化為成熟的同種異體CAR-iNKT細胞，該程序包括淋巴祖細胞擴增和成熟補充物、CD3–CD28–CD2 T細胞激活劑和IL-15。對于體外擴增，有多種方法可用，效率相當，包括αCD3和αCD28擴增、αGC和PBMC擴增以及人工APC擴增。該方案可以從5 × 10?個CD34? HSCs中產生1 × 1012個同種異體CAR-iNKT細胞，顯示出巨大的臨床可擴展應用潛力。

CAR-γδT細胞的制造需要有效的譜系富集和體外擴增，但目前對于Vδ2或Vδ1細胞都沒有被廣泛接受或穩健的方案。Vδ2細胞最初在過繼性轉移研究中受到更多關注，因為與Vδ1細胞相比，其外周豐度更高，細胞毒性潛力更強。Vδ2細胞的體外激活和擴增利用了它們對異戊烯焦磷酸的識別，異戊烯焦磷酸通過哺乳動物細胞中的甲羥戊酸途徑產生。用唑來膦酸處理分選的PBMCs會破壞APCs中的甲羥戊酸途徑，導致異戊烯焦磷酸積累，從而選擇性地激活和富集Vδ2細胞。分離和病毒轉導后，需要補充細胞因子（IL-2、IL-15和IL-21）和aAPCs以支持體外擴增并維持CAR-Vδ2細胞的體內細胞毒性。然而，用這些方法生成的CAR-Vδ2細胞在持續的腫瘤抗原刺激下會迅速失去細胞毒性，并需要額外的IL-2給藥。

Vδ1細胞因其記憶樣表型、對激活誘導凋亡的抵抗性以及向實體瘤的浸潤而在CAR工程中引起興趣。開發了一種臨床級Vδ1細胞擴增和分化方案，涉及細胞因子混合物（如IL-15、IL-2和IFNγ）以及通過OKT3抗體進行的TCR刺激。在CAR背景下，當前的CAR-Vδ1細胞研究大多采用基于抗體的富集策略，使用與CAR-Vδ2細胞類似的細胞因子混合物（可溶性IL-2、IL-15和IL-21）和aAPCs來生成和擴增Vδ1細胞。T細胞絲裂原刀豆素A（ConA）選擇性地擴增來自PBMCs的Vδ1細胞，但總體產量和基因修飾效率仍然有限。ConA激活的Vδ1細胞表現出較低的CAR轉導效率（約20-40%），而CD3激活和CD28激活的αβ T細胞的平均轉導效率為61.57%。此外，即使在擴增后，αβ T細胞仍然是培養物中的主要群體，從而限制了臨床上足夠的CAR-Vδ1細胞產品的生成。仍然需要一個穩健有效的體外擴增方案。

鑒于CAR-MAIT細胞或MAIT細胞過繼性轉移研究的稀缺性，目前仍缺乏一個穩健的體外CAR-MAIT細胞制造方案。MAIT細胞可以通過靶向TCR Vα7.2從PBMCs中分離出來，并用表達CAR的慢病毒載體轉導，然后在含有細胞因子混合物（包括IL-2、IL-7和IL-15）的培養基中體外擴增。

目前大多數非常規CAR-T細胞研究都采用了常規CAR的CAR結構，定制的CAR設計很少。探索性努力已經整合了細胞因子共表達以增強持久性和細胞毒性功能；例如，在CAR-iNKT細胞中包含IL-15改善了功能，在體內外產生了持久的持久性且無明顯毒性。共表達IL-12可以進一步增加CD62L? CAR-iNKT細胞中CD62L的表達，誘導持久的記憶表型，并維持體內抗腫瘤反應。在CAR-Vδ1T細胞中，共表達IL-2增強了體外細胞毒性，并放大了細胞因子（包括TNF和IFNγ）的分泌。除了細胞因子共表達外，整合雙特異性T細胞銜接器（BiTE）分泌等策略也在非常規CAR-T細胞中進行了探索。例如，靶向HLA-G的CAR-γδT細胞分泌PDL1–CD3ε BiTE，抵消了原發性腫瘤細胞上PDL1的上調，并在體內外增強了細胞毒性反應。

總的來說，當前非常規CAR-T細胞的設計大多依賴于來自CAR-Tconv細胞的既定CAR結構。定義非常規CAR-T細胞的功能免疫生物學對于指導定制的CAR結構設計至關重要。

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三、CAR-X細胞的治療應用

CAR-NK細胞

NK細胞是基于CAR免疫療法中研究第二廣泛的免疫細胞平臺，被廣泛認為是CAR-Tconv細胞的有前景的替代方案，因為它們可以減輕CRS和GvHD等并發癥。CAR-NK細胞的治療潛力已在多種腫瘤中得到探索，多項臨床試驗顯示出有前景的療效、潛在挑戰和安全性特征。

初步的CAR-NK細胞研究主要靶向CD19，這是一個針對B細胞譜系血液惡性腫瘤經過廣泛驗證的靶點。將IL-15和iC9自殺基因整合到CAR-NK細胞中，在37名B細胞惡性腫瘤患者中，實現了1年總生存率68%和無進展生存率32%（NCT03056339；）。值得注意的是，這些患者中有31人至少接受過三線治療但仍復發，這突顯了該方法相對于標準治療的療效。類似地，iPS細胞來源的CAR-NK細胞在86名B細胞淋巴瘤患者中顯示出良好的安全性和初步活性，該設計整合了Fc受體CD16與抗CD19-CAR結合，以增強NK細胞的ADCC。這種方法在所有患者中實現了11.6%的CRS發生率，同時客觀緩解率為54.4%，中位緩解持續時間為16.9個月（NCT04245722；）。CAR-NK細胞也已針對其他B細胞抗原開發，包括CD20和FLT3，在臨床前模型中顯示出積極的抗腫瘤活性。例如，雙功能CAR-NK細胞通過雙重識別CD20和NKG2D在體外殺死了CD20?腫瘤細胞。類似地，FLT3-CAR-NK細胞在體外對FLT3? B細胞急性淋巴細胞白血病細胞表現出細胞毒性，并在異種移植小鼠模型中抑制了B細胞急性淋巴細胞白血病進展，且安全性可控。

CAR-NK細胞也正在被研究用于一系列實體瘤，靶向幾種已確立的標志物。在各種實體瘤中，表面應激誘導配體上調很常見，這些配體可以被NK細胞激活受體NKG2D識別。用NKG2D胞外域替換常規CAR結構中的單鏈可變片段（scFv）域，使CAR-NK細胞能夠特異性靶向患者肝臟中的轉移性結直腸腫瘤（NCT03415100）。人表皮生長因子受體2（HER2）是在各種實體瘤中表達的經典標志物，一直是CAR-NK細胞實體瘤研究的主要焦點。一項涉及9名HER2?膠質母細胞瘤患者顱內注射抗HER2-CAR-NK細胞的I期臨床試驗報告了中位總生存期為31周，盡管該治療對疾病進展影響有限（NCT03383978）。此外，其他靶點，如EGFR、B7-H6和間皮素，也顯示出臨床前潛力。

CAR-巨噬細胞

巨噬細胞卓越的腫瘤浸潤和吞噬能力使CAR-巨噬細胞成為治療實體瘤的有希望的候選者，而實體瘤通常對CAR-Tconv細胞療法無效。目前，CAR-巨噬細胞研究大多處于臨床前階段，旨在實現穩定的M1極化。

首份關于CAR-巨噬細胞應用于患者的報告涉及用抗間皮素-CAR-巨噬細胞（SY001，NCT06562647）治療兩名晚期卵巢癌患者。該CAR-巨噬細胞產品在卵巢癌異種移植小鼠模型中誘導了近乎完全的腫瘤消退。然而，接受治療的兩名患者在28天的隨訪期內僅病情穩定，沒有明確的治療獲益。最近的一項臨床試驗用CD3ζ基抗HER2-CAR-巨噬細胞治療了14名HER2?實體瘤患者（NCT04660929）。輸注的CAR-巨噬細胞遷移到實體瘤TME中并交叉激活CD8? T細胞。然而，治療效果有限，因為只有44%的HER2 3+（HER2高表達水平）腫瘤患者在8周時病情穩定，在HER2 2+腫瘤患者中沒有觀察到有意義的活性。中位無進展生存期僅為1.47個月。所有患者都出現了不同的治療相關不良事件，64%（9/14）的患者出現1級和2級CRS，所有癥狀均在1-4天內緩解。這些結果表明，將CAR-巨噬細胞應用于實體瘤患者在技術上是可行的，但當前設計的治療效果有限。

CAR-Treg細胞

多克隆Treg細胞的過繼性轉移在一系列臨床前和臨床研究中，對于以過度免疫活性為特征的疾病（如1型糖尿病和GvHD）具有治療效果。然而，對脫靶過度免疫抑制和潛在促腫瘤作用的擔憂限制了進一步的臨床探索。CAR的整合可以提供抗原特異性靶向，從而提高安全性并減少治療所需的細胞劑量，從而解決了關鍵的轉化挑戰。

CAR-Treg細胞在GvHD和移植排斥等疾病中展現出巨大前景。在造血干細胞移植后的GvHD中，HLA不匹配，特別是HLA-A2，在觸發免疫同種異體反應中起關鍵作用。HLA-A2由各種細胞（包括APCs）表達；因此，靶向HLA-A2的CAR-Treg細胞（A2-CAR-Treg細胞）可以抑制APCs向來自供體的同種異體反應性T細胞呈遞抗原，從而預防小鼠的異種GvHD。在非人靈長類動物中，A2-CAR-Treg細胞遷移到移植部位并持續進行局部免疫抑制。此外，A2-CAR-Treg細胞抑制了HLA誘導的皮膚移植免疫排斥，在小鼠中保持了皮膚完整性并改善了移植結果。這些有前景的結果推動了兩項正在進行的A2-CAR-Treg細胞預防移植排斥的臨床試驗（NCT04817774和NCT05234190）。

非常規CAR-T細胞

工程化非常規CAR-T細胞方法在很大程度上是探索性的，旨在利用其細胞毒性潛力、更廣泛的靶標識別能力和降低的MHC依賴性。然而，這些研究大多只是將CAR結構和設計策略從CAR-Tconv細胞移植到非常規T細胞上，并且主要側重于評估細胞毒性功效。盡管如此，大多數這些策略忽略了非常規T細胞的獨特功能特性和組織趨向性。進一步的研究應超越直接適應，探索針對這些細胞內在生物學特性定制的CAR設計。對其在TME中的激活、持久性和功能的更深入的機制理解對于優化其臨床應用至關重要。

CAR-iNKT細胞已在臨床前模型中針對實體瘤進行開發。靶向GD2（在神經母細胞瘤細胞上高表達的標志物）的CAR-iNKT細胞表現出位點特異性遷移、腫瘤浸潤和抗腫瘤活性。目前，有一項已發表的針對神經母細胞瘤患者的I期臨床試驗靶向GD2。觀察到了足夠的體內擴增和腫瘤遷移：每次輸注產品平均產生4.5 × 10?（范圍2.9 × 10? – 9.1 × 10?）個CAR-NKT細胞，并且外周血中CAR-NKT細胞的豐度與其在腫瘤組織中的積累呈正相關。然而，初步臨床結果并不理想，客觀緩解率僅為25%（3/12），且只有一例完全緩解（NCT0329454）。

第一個CAR-γδ T細胞研究于2004年進行，它用靶向CD19或GD2的第一代CAR轉導了Vδ2細胞。后來的一項研究將第二代抗CD19-CAR引入γδ T（包括Vδ1和Vδ2）細胞，表明CAR-γδ T細胞可以在CD19? aAPCs上擴增。為了改善歸巢，一種方法是用NKG2D的外部部分替換CAR的scFv域，使其能夠識別腫瘤相關的NKG2D配體。NKG2D-CAR-Vδ2細胞在卵巢癌小鼠模型中延長了生存期，并且已經進行了一項臨床試驗，以驗證其在復發和/或難治性轉移性實體瘤患者中的治療效果（NCT04107142）。另一種策略是整合PDL1–CD3ε BiTE。該BiTE結合腫瘤細胞上的PDL1和旁觀者T細胞上的CD3ε，促進CAR-γδ T細胞浸潤，并通過招募的T細胞放大細胞毒性效應。該策略由在TME內分泌的抗HLA-G-CAR-γδ T細胞工程化，在小鼠中減少了腫瘤負荷并改善了生存期，從而引發了一項評估其治療潛力的臨床試驗（NCT06150885）。

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結語

每個CAR-X細胞平臺都利用了獨特的免疫屬性，這些屬性可能補充甚至超越CAR-Tconv細胞，特別是在實現改善的安全性特征、增強的腫瘤浸潤和更廣泛的治療適用性方面。然而，在臨床轉化之前，仍需要解決細胞類型特異性功能、可擴展制造和安全性特征方面的關鍵挑戰。

大多數替代性CAR平臺是先天樣或調節性免疫細胞，它們本身并未針對持續、強效地殺傷腫瘤細胞或病原體進行優化。因此，需要開發細胞類型特異性的CAR設計以實現優化的治療效果。此外，CAR-X細胞療法的臨床轉化不僅取決于功能療效，還取決于用于細胞來源和體外擴增的可擴展且可靠的制造過程。

盡管存在這些限制，基于CAR的細胞免疫治療領域正在迅速發展，以滿足未滿足的治療需求，并將應用范圍從血液惡性腫瘤擴展到更廣泛的疾病領域，包括難治性腫瘤、自身免疫性疾病、實體瘤及更多疾病患者。

參考資料：

CAR-X cell engineering. Nature Reviews Bioengineering. 2026 April 27

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