J Med Chem (1區(qū)) I 瞄準(zhǔn) MASH 治療痛點：化合物 27 兼具強效 FXR 激活與低 MRGPRX4 脫靶風(fēng)險！(張磊/顧兵—華南理工...

2026年5月，廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）顧兵團隊、華南理工大學(xué)張磊團隊等，聯(lián)合南方醫(yī)科大學(xué)、華南理工大學(xué)等單位，在Journal of Medicinal Chemistry（2024 Impact Factor=6.8）在線發(fā)表題為“Discovery of Non-Carboxylic Steroidal FXR Agonist as a Promising Preclinical Candidate for Metabolic Dysfunction-Associated Steatohepatitis”的研究論文。該文于2025年11月5日投稿，2026年3月25日修回，2026年4月29日接收。

代謝功能障礙相關(guān)脂肪性肝炎（MASH）是脂肪肝疾病進展中的關(guān)鍵階段，可進一步發(fā)展為肝纖維化、肝硬化甚至肝衰竭，已成為全球代謝性肝病治療領(lǐng)域的重要難題。FXR 是當(dāng)前 MASH 藥物研發(fā)中的重要靶點，代表性藥物 OCA 已在臨床研究中顯示出抗纖維化潛力，但其劑量相關(guān)性瘙癢等不良反應(yīng)限制了進一步應(yīng)用。因此，如何在保持 FXR 強效激活的同時降低脫靶風(fēng)險，成為新一代 FXR 激動劑設(shè)計中的核心挑戰(zhàn)。

本研究圍繞這一痛點，采用基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計策略，對 OCA 的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)進行系統(tǒng)優(yōu)化，提出了“去羧酸化+構(gòu)象限制”的設(shè)計思路。研究團隊發(fā)現(xiàn)，OCA 的羧基結(jié)構(gòu)可能與 MRGPRX4 激活相關(guān)，而 MRGPRX4 被認為與非組胺能瘙癢反應(yīng)密切相關(guān)。基于此，作者設(shè)計并合成了一系列非羧酸甾體類 FXR 激動劑，最終篩選出表現(xiàn)突出的候選化合物 compound 27。

實驗結(jié)果顯示，compound 27 具有強效 FXR 激動活性，在 TR-FRET 實驗中的 EC?? 為 10 ± 3 nM，在細胞熒光素酶報告基因?qū)嶒炛械?EC?? 為 128 ± 9 nM，活性優(yōu)于 OCA。同時，compound 27 對 MRGPRX4 的非期望激活明顯降低，其選擇性指數(shù)達到 201，約為 OCA 的 25 倍，提示其可能具有更優(yōu)的安全性窗口。此外，compound 27 還表現(xiàn)出較高的大鼠口服生物利用度（F = 70.30%），并可激活 hTGR5，形成 FXR/TGR5 雙通路調(diào)控優(yōu)勢。

在體內(nèi)藥效方面，compound 27 在 CCl? 誘導(dǎo)的肝纖維化模型中顯著減輕膠原沉積，改善肝組織纖維化病理變化；在 WD 與 CCl? 共誘導(dǎo)的 MASH 模型中，compound 27 能明顯改善肝脂肪變性、炎癥浸潤、肝細胞氣球樣變和纖維化指標(biāo)，部分療效優(yōu)于 OCA。這說明 compound 27 不僅在分子和細胞水平具有良好活性，也在復(fù)雜疾病模型中展現(xiàn)出扎實的臨床前治療潛力。

總體來看，該研究的亮點不只是發(fā)現(xiàn)了一個更強的 FXR 激動劑，更重要的是提出了一種兼顧療效與安全性的藥物設(shè)計邏輯：通過非羧酸結(jié)構(gòu)降低 MRGPRX4 相關(guān)瘙癢風(fēng)險，同時保留并增強 FXR/TGR5 介導(dǎo)的代謝調(diào)控和抗纖維化作用。compound 27 因此有望成為 MASH 治療領(lǐng)域具有進一步開發(fā)價值的新型臨床前候選化合物，也為下一代膽汁酸受體調(diào)節(jié)劑的結(jié)構(gòu)優(yōu)化提供了重要參考。

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【摘要】

代謝功能障礙相關(guān)脂肪性肝炎（MASH）正成為日益嚴峻的全球健康挑戰(zhàn)，迫切需要有效的治療手段。法尼醇 X 受體（FXR）是治療 MASH 的一個有前景的靶點。本研究報道了一種新型非羧酸甾體類 FXR 激動劑——化合物 27 的理性設(shè)計。該化合物表現(xiàn)出有效的 FXR 激動活性（TR-FRET：EC?? = 10 ± 3 nM；熒光素酶報告基因?qū)嶒灒篍C?? = 128 ± 9 nM），同時與 OCA 相比，對脫靶受體 MRGPRX4 的激活作用降低。化合物 27 在大鼠中具有較高的口服生物利用度（F = 70.30%），并能激活 hTGR5（HTRF：EC?? = 1360 nM）。體內(nèi)研究證實了其療效：在 CCl? 誘導(dǎo)的肝纖維化模型中，化合物 27 能減輕膠原沉積；在 MASH 模型中，它能改善脂肪變性和炎癥灶。總體而言，化合物 27 通過增強 FXR/TGR5 活性并抑制 MRGPRX4 的“雙路徑”策略，獲得了較有前景的療效與安全性特征，支持其作為 MASH 新型治療藥物進一步開發(fā)。

01

研究背景及科學(xué)問題

代謝功能障礙相關(guān)脂肪性肝炎（MASH），過去稱為非酒精性脂肪性肝炎（NASH），已經(jīng)成為一種全球性流行疾病。MASH 是代謝功能障礙相關(guān)脂肪性肝病（MAFLD）疾病譜中具有重要臨床意義的階段。MASH 的進展始于肝細胞內(nèi)脂質(zhì)過度積累，組織學(xué)上表現(xiàn)為細胞質(zhì)內(nèi)脂滴沉積，即肝脂肪變性。持續(xù)性的脂肪變性會進一步引發(fā)肝細胞損傷和炎癥反應(yīng)，隨著時間推移可能發(fā)展為進行性肝纖維化和肝硬化。值得注意的是，MASH 已經(jīng)成為全球肝移植和肝相關(guān)死亡的重要原因。雖然飲食干預(yù)和體育鍛煉等生活方式改變在早期 MASH 中具有治療效果，但多數(shù)患者很難長期堅持。因此，開發(fā)既能改善 MASH 癥狀、又能阻止纖維化進展的藥物具有迫切需求。然而，MASH 的病理機制尚未完全闡明，目前治療選擇也非常有限，這凸顯了開發(fā)安全性和有效性更優(yōu)的新療法的緊迫性。

法尼醇 X 受體（FXR）是一種配體激活型核受體轉(zhuǎn)錄因子，可被其內(nèi)源性配體激活，如鵝去氧膽酸（CDCA）。FXR 激活后會通過誘導(dǎo)小異二聚體伴侶（SHP）形成反饋調(diào)節(jié)環(huán)路，從而抑制膽固醇 7α-羥化酶（CYP7A1）的表達，減少膽汁酸生物合成，并影響膽汁酸穩(wěn)態(tài)。具體而言，F(xiàn)XR 還能通過抑制 SREBP 轉(zhuǎn)錄因子的活性，影響肝臟膽固醇和甘油三酯代謝。FXR 也與脂質(zhì)氧化過程密切相關(guān)，并可被過氧化物酶體增殖物激活受體 γ 共激活因子 1α（PGC-1α）激活，從而促進 PGC-1α 介導(dǎo)的脂肪酸 β 氧化。因此，F(xiàn)XR 在調(diào)控膽汁酸合成、轉(zhuǎn)運和代謝方面具有關(guān)鍵作用，同時還參與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、葡萄糖代謝和炎癥反應(yīng)等生理過程，這使其成為治療 MASH 的有前景靶點。

近年來，許多 FXR 激動劑被開發(fā)用于 MASH 治療，并進入不同階段的臨床試驗。奧貝膽酸（OCA，也稱 INT-747，圖 1）是鵝去氧膽酸的 C6α-乙基修飾衍生物，因其抗膽汁淤積和肝保護特性，已作為原發(fā)性膽汁性膽管炎（PBC）的二線治療藥物獲得加速批準(zhǔn)。一項針對非肝硬化 MASH 患者的隨機、雙盲、安慰劑對照研究顯示，每日 25 mg OCA 在 18 個月中期分析時達到了主要終點，即在 MASH 未惡化的情況下實現(xiàn)纖維化改善（至少降低 1 個分期），提示結(jié)果積極。然而，在每日口服 25 mg OCA 的劑量下，超過 50% 的患者出現(xiàn)了瘙癢這一最常見不良事件。TC-100（INT-787，圖 1）是一種新型 C11β-羥基化 OCA 衍生物，具有與 OCA 相當(dāng)?shù)?FXR 激動活性，可通過調(diào)節(jié)膽汁酸穩(wěn)態(tài)和腸道菌群改善腸黏膜損傷。

非甾體類 FXR 激動劑 Cilofexor（GS-9674，圖 1）可顯著降低非肝硬化 MASH 患者的肝脂肪變性，并可能通過降低血清纖維化標(biāo)志物發(fā)揮抗纖維化作用。然而，中度至重度瘙癢是常見不良反應(yīng)，尤其在較高劑量下更明顯。Tropifexor（LJN-452，圖 1）是選擇性最強的 FXR 激動劑，可顯著降低 ALT、GGT、體重和肝脂肪含量。FXR 激動劑 omesdafexor（MET-409，圖 1）與恩格列凈聯(lián)合治療，在一項針對 2 型糖尿病合并 MASH 患者的 12 周 IIa 期試驗中顯示出良好的安全性，并可降低肝脂肪含量。

OCA 作為 FDA 批準(zhǔn)用于 PBC 的藥物，也是首個進入 MASH III 期臨床試驗的 FXR 靶向治療藥物，說明其作用機制和臨床療效已經(jīng)得到較系統(tǒng)的驗證。然而，劑量依賴性瘙癢嚴重限制了其臨床應(yīng)用。尤其是在高劑量組中，9% 的患者因難以耐受瘙癢而停藥，這凸顯了開發(fā)安全性更優(yōu)的優(yōu)化型 FXR 激動劑的必要性。已有研究表明，OCA 可通過選擇性激活人 MRGPRX4（hX4，一種表達于背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的 Mrgpr 家族孤兒 GPCR 成員）誘導(dǎo)非組胺能瘙癢，而這一作用并不依賴其經(jīng)典靶點 FXR 或 TGR5。進一步機制研究顯示，3-磷酸化脫氧膽酸（DCA-3P，圖 S1）通過其磷酸基團與 Arg82、Arg95 和 Arg86 三個周圍殘基相互作用，對 hX4 的活性比 DCA 高 65 倍；DCA 是天然膽汁酸中最強的 hX4 激動劑，EC?? 為 2.9 μM。這提示 hX4 與激動劑之間相互作用增強可能誘發(fā)更強烈的瘙癢。此外，Nateglinide 的更強效衍生物 MS47134（圖 S1）也可通過其羧基與 Arg82 殘基發(fā)生電荷相互作用，插入正電性靜電勢口袋中。

與此同時，Takeda G 蛋白偶聯(lián)受體 5（TGR5）是另一種膽汁酸受體。同時靶向 FXR 和 TGR5 的雙重激動劑已顯示出治療代謝性和慢性肝病的潛力，因此開發(fā)此類藥物也是治療 MASH 的可行策略。膽汁酸衍生配體 BAR502（圖 S1）為這一策略提供了概念驗證；它是一種 FXR/TGR5 雙重激動劑，并在臨床前模型中顯示出療效。相關(guān)類似物也提供了重要的構(gòu)效關(guān)系信息：BAR501（圖 S1）通過 7-OH 和 6-Et 的異構(gòu)化獲得，表現(xiàn)為選擇性 TGR5 激動劑而不激活 FXR，證實 7α-OH 對 FXR 結(jié)合至關(guān)重要。相反，BAR704（圖 S1）是一種 3-脫氧衍生物，作為選擇性 FXR 激動劑發(fā)揮作用，提示 3α-OH 對 TGR5 激活具有關(guān)鍵作用。這些構(gòu)效關(guān)系共同表明，同時保留 3α-OH 和 7α-OH 基團，是維持 FXR/TGR5 平衡雙重激動活性的關(guān)鍵。

基于這些關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)—功能認識，下一代 FXR 激動劑的開發(fā)需要采取雙目標(biāo)優(yōu)化策略：一方面增強療效，另一方面減少副作用。首先，應(yīng)采用基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計（SBDD）方法，以提高效力和療效，并優(yōu)化藥代動力學(xué)特征，從而降低臨床劑量。與此同時，基于結(jié)構(gòu)的選擇性優(yōu)化對于消除 MRGPRX4 交叉激活風(fēng)險至關(guān)重要，這對于減輕未來 FXR 激動劑在臨床應(yīng)用中可能出現(xiàn)的瘙癢相關(guān)不良反應(yīng)具有重要意義。

圖 1. 代表性 FXR 激動劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

02

重要發(fā)現(xiàn)及亮點

2.1. 理性設(shè)計

選擇性 FXR 激動劑的開發(fā)需要同時關(guān)注兩個方面：既要保持對 FXR 的高親和力，又要盡量減少脫靶相互作用，尤其是降低或消除與 MRGPRX4 的相互作用。OCA 與 FXR-LBD 復(fù)合物的 X 射線晶體結(jié)構(gòu)顯示，OCA 的甾體母核占據(jù)疏水口袋（S1），而末端羧基部分延伸至兩個不同的潛在亞口袋方向：一個是“后門”位點（S2，由 Tyr257、Phe298 和 Thr383 構(gòu)成），另一個是溶劑暴露區(qū)域。這種結(jié)合模式通過疏水相互作用和特異性氫鍵穩(wěn)定 FXR 的活性構(gòu)象，從而促進共激活因子募集。

鑒于羧基是許多 FXR 激動劑的共同結(jié)構(gòu)特征，并且已被認為可能是激活 MRGPRX4 的潛在藥效團，本研究的設(shè)計策略聚焦于修飾側(cè)鏈拓撲結(jié)構(gòu)，以利用 FXR 與 MRGPRX4 亞口袋結(jié)構(gòu)之間的細微差異。

為探究 OCA 激活 MRGPRX4 的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，研究構(gòu)建了 OCA 與 MRGPRX4 的結(jié)合模式（圖 2B）。結(jié)果顯示，OCA 與 MRGPRX4 的相互作用模式與 MS47134 相似（圖 S3）。兩種配體的羧基部分幾乎完全重疊（圖 2C），提示羧基可能是激活 MRGPRX4 的關(guān)鍵藥效團。OCA 的甾體骨架與 Val99、Trp158、Ile239、Tyr240、Leu246、Glu247 和 Leu249 等疏水殘基相互作用，通過疏水作用維持結(jié)合模式的明顯穩(wěn)定性。OCA 柔性側(cè)鏈發(fā)生約 90° 翻轉(zhuǎn)，使其羧基能夠與 Arg82 形成鹽橋，并與 MRGPRX4 中的 Tyr254 和 Tyr250 形成氫鍵相互作用。此外，該側(cè)鏈進一步伸入一個由 Phe78、Ile81、Arg82、Leu85、Ile90、Arg95、Leu98、Val99 和 Met102 構(gòu)成的狹窄疏水亞口袋。

FXR 與 MRGPRX4 亞口袋結(jié)合位點中的細微差異，為選擇性 FXR 激動劑的理性設(shè)計提供了堅實的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。因此，構(gòu)效優(yōu)化工作將 OCA 側(cè)鏈作為提高選擇性的關(guān)鍵修飾位點。

為減輕 MRGPRX4 的脫靶激活，研究者試圖通過去除側(cè)鏈中的羧基來降低設(shè)計分子與 MRGPRX4 的結(jié)合親和力。OCA 側(cè)鏈中的羧基被酰肼基團替代，以施加構(gòu)象限制，從而有效限制側(cè)鏈翻轉(zhuǎn)。這一結(jié)構(gòu)修飾得到化合物 7（圖 2D 和圖 S4），其對 MRGPRX4 的對接評分顯著低于先導(dǎo)結(jié)構(gòu)（Glide XP Score：?5.63 kcal/mol；OCA 為 ?7.17 kcal/mol，表 S1）。然而，這一改變也導(dǎo)致其 FXR 激動活性下降約 3 倍；在熒光素酶報告基因?qū)嶒炛校衔?7 在 10 μM 時的效能僅為 OCA 的 32%。因此，為了在保持 FXR 活性的同時進一步降低 MRGPRX4 結(jié)合，研究者在酰肼側(cè)鏈末端引入了結(jié)構(gòu)不同的基團。該策略旨在通過空間位阻阻礙其與 MRGPRX4 相互作用，同時維持其與 FXR-LBD 內(nèi)關(guān)鍵位點的接觸。在這一思路指導(dǎo)下，研究者系統(tǒng)優(yōu)化了 OCA 衍生側(cè)鏈結(jié)構(gòu)，并合成了一系列聚焦型類似物，用于評價其 FXR 特異性藥理性質(zhì)。

圖 2. 非羧酸甾體類 FXR 激動劑的設(shè)計策略：（A）基于 OCA 的結(jié)構(gòu)設(shè)計策略進行新型 FXR 激動劑的理性設(shè)計；（B）OCA 在 MRGPRX4 中的預(yù)測結(jié)合模式；（C）MS47134 與 OCA 在 MRGPRX4 中的疊合對接模擬；（D）OCA 與化合物 7 在 MRGPRX4 中的疊合對接模擬。

2.2. 構(gòu)效關(guān)系

本研究采用兩種獨立實驗評價所合成化合物的體外 FXR 激動活性，以確定半數(shù)最大有效濃度（EC??）和最大激動效能。首先，采用時間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移（TR-FRET）共激活因子募集實驗，直接定量配體誘導(dǎo)的 FXR 與共激活因子肽之間的相互作用。該均相實驗使用鋱標(biāo)記抗 GST 抗體、熒光素標(biāo)記共激活因子肽和 GST 標(biāo)記 FXR-LBD，以測量化合物親和力和效能。TR-FRET 中的 EC?? 和效能主要反映化合物對 FXR-LBD 的內(nèi)在結(jié)合親和力。此外，研究還在 HEK-293 細胞中進行 FXR 驅(qū)動的熒光素酶報告基因?qū)嶒灒@些細胞共同轉(zhuǎn)染人 FXR 表達質(zhì)粒和相應(yīng)報告構(gòu)建體。該實驗得到的 EC?? 和效能用于評價細胞水平的功能活性，即通過完整轉(zhuǎn)錄級聯(lián)反應(yīng)測量受體激活。在兩種實驗中，均以 OCA 作為參照激動劑，并將 10 μM OCA 的反應(yīng)定義為 100% 效能。

受到化合物 7 與 MRGPRX4 復(fù)合物相互作用減弱的啟發(fā)，研究者以化合物 7 為基礎(chǔ)，在 R1 位系統(tǒng)評價了多種酰基或磺酰基取代衍生物，以探索 FXR-LBD 亞口袋的空間耐受性。表 1 總結(jié)顯示，乙酰基取代（8）顯著削弱 FXR 激活。相反，苯甲酰衍生物（9）在兩種實驗形式中均較母體化合物 7 表現(xiàn)出增強的 FXR 激動活性。值得注意的是，化合物 9 在熒光素酶報告基因?qū)嶒炛械募毎踊钚愿鼜姡珽C?? 為 489 ± 11 nM，而 OCA 為 688 ± 10 nM。然而，在苯甲酰環(huán)對位引入甲基（10）、甲氧基（11）、氟（12）和叔丁基（13）取代基會削弱 FXR 激動活性，在熒光素酶報告基因?qū)嶒炛衅湫ЯΦ陀?OCA。

使用磺酰胺生物電子等排體延長側(cè)鏈（14—18）總體上導(dǎo)致 TR-FRET 實驗中的激動效力下降，其中僅未取代苯基磺酰胺 15 表現(xiàn)出中等活性。化合物 9 和 15 在熒光素酶報告基因?qū)嶒炛械?EC?? 值相近，但在 TR-FRET 實驗中顯示出明顯不同的結(jié)合親和力。化合物 9 的內(nèi)在結(jié)合親和力（TR-FRET 實驗 EC?? = 97 ± 15 nM）為其作為進一步優(yōu)化的化學(xué)起點提供了可量化依據(jù)。

基于上述結(jié)果，并認識到改變側(cè)鏈構(gòu)象翻轉(zhuǎn)有助于降低與 MRGPRX4 的相互作用，研究者提出了一種新的構(gòu)象限制策略：通過碳酰肼骨架的分子內(nèi)環(huán)化實現(xiàn)構(gòu)象約束。該方法在相當(dāng)于 C24 的位置引入芳香雜環(huán)，以介導(dǎo)受體激活。

研究者進一步探索了以雜原子替代 5-吡唑啉酮核心 4 位亞甲基的策略，以增加極性并改善其與 FXR-LBD 親水性亞口袋的互補性。由此得到 1,3,4-噁二唑衍生物 21—27。表 2 顯示，引入苯基（21）、乙氧羰基（22）、羧基（23）或羥甲基（24）取代基后，F(xiàn)XR 激活效力顯著降低，在熒光素酶報告基因?qū)嶒炛邢鄬τ?OCA 的激動效能僅為 4%—40%。1,3,4-噁二唑-2(3H)-酮衍生物 25 表現(xiàn)出中等激動活性（熒光素酶報告基因?qū)嶒灒篍C?? = 575 ± 47 nM，Emax = 67%），而 2-氨基-1,3,4-噁二唑衍生物 26 表現(xiàn)為弱至中等活性。

1,3,4-噁二唑-2(3H)-硫酮衍生物 27 則成為與 OCA 相比 FXR 激動活性明顯更強的化合物。在 TR-FRET 實驗中，化合物 27 對 FXR 配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域顯示出高結(jié)合親和力（EC?? = 10 ± 3 nM，Emax = 133%；OCA 為 100%）。這種結(jié)合活性有效轉(zhuǎn)化為細胞轉(zhuǎn)錄激活能力，熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示其 EC?? = 128 ± 9 nM，Emax = 125%（OCA 為 100%）。雖然細胞中誘導(dǎo)完整轉(zhuǎn)錄反應(yīng)需要略高濃度，但該化合物在生化實驗和功能實驗中均表現(xiàn)穩(wěn)定而強效，凸顯了化合物 27 進一步開發(fā)的潛力。

隨后，研究者進一步探索了含硫羰基雜環(huán)，得到 1,2,4-三唑（28）和 1,3,4-噻二唑（29）衍生物。與 1,3,4-噁二唑衍生物 27 中氧原子的氫鍵受體能力和高電負性相比，1,3,4-噻二唑衍生物 29 中的硫原子作為較弱氫鍵受體，可能是其結(jié)合親和力降低的主要原因。此外，1,2,4-三唑衍生物 28 活性顯著降低，可能是由于 NH 部分的陽離子化特征與目標(biāo)結(jié)合口袋中以受體驅(qū)動為主的環(huán)境不相容。總體而言，表 2 所示構(gòu)效關(guān)系證實，策略性引入氫鍵受體基團，尤其是在構(gòu)象受限的五元芳香環(huán)上引入化合物 27 中的硫羰基部分，是獲得高 FXR 激活效力和效能的關(guān)鍵。芳香雜環(huán)提供的穩(wěn)定性進一步支持其作為高級先導(dǎo)候選物的潛力。

為了實現(xiàn) FXR 相對于 MRGPRX4 的選擇性激動，研究者在化合物 27 末端位置引入具有較大空間體積的芐基，并系統(tǒng)評價不同取代基對 FXR 激動活性的影響。所合成的一系列化合物中，帶羧基的化合物 43 在 FXR 熒光素酶報告基因?qū)嶒炛械?EC?? 為 330 ± 24 nM。相反，異丙基（39）、叔丁基（40）和叔丁酯（42）等體積較大的取代基導(dǎo)致 FXR 活性顯著下降，這可能是由于它們在結(jié)合口袋內(nèi)產(chǎn)生空間沖突。未取代衍生物（30）和甲基取代類似物（31）仍保持較強 FXR 激動活性，提示較小基團更容易被配體結(jié)合位點容納。

鑒于芐基取代衍生物（30—44）表現(xiàn)出中等 FXR 活性，研究者隨后設(shè)計了一組空間需求更低的類似物。該聚焦化合物庫引入了緊湊的脂肪鏈和五元呋喃雜環(huán)，旨在系統(tǒng)探究 FXR-LBD 對空間和電子性質(zhì)的耐受性，并進一步細化 FXR 激活的構(gòu)效關(guān)系。

甲基取代（45，Emax = 54%）使細胞效能低于 OCA，而氘代甲基（46，Emax = 72%）則提高了活性。烯丙基衍生物 47 表現(xiàn)出高效力（EC?? = 158 ± 14 nM，Emax = 104%），其柔性鏈可在 FXR-LBD 中形成疏水接觸。相反，剛性炔丙基（48）和氰乙基（49）基團降低了效能。極性取代基可能增強激動效力：羥乙基衍生物 50（EC?? = 270 ± 22 nM）可向 His341 提供氫鍵（圖 S5）。在含氟衍生物中，二氟乙基 53（Emax = 97%）優(yōu)于二氟甲基 52（Emax = 7%），提示存在活性陡變現(xiàn)象。在所有設(shè)計化合物中，化合物 27、47 和 50 作為 FXR 激動劑表現(xiàn)出理想性質(zhì)和納摩爾級效力，因此被選為有吸引力的藥理工具分子，用于進一步研究。

2.3. 化學(xué)合成

化合物 7—18 的合成過程見方案 1。簡言之，OCA 在 EDCI·HCl/HOBt 介導(dǎo)下與乙酰肼或多種對位取代苯甲酰肼縮合，得到酰基乙酰肼 8 和酰基苯甲酰肼 9—13。中間體 2a 由 OCA 與 Boc-肼在類似的 EDCI·HCl 活化條件下制備。隨后，使用濃鹽酸/甲醇對 2a 進行 Boc 脫保護，得到化合物 7。最后，化合物 7 與多種磺酰氯發(fā)生親核取代反應(yīng)，得到目標(biāo)磺酰肼衍生物 14—18。

如方案 2 所示，在 Novozyme 435（N435）催化下，對 OCA 的 C3 位進行區(qū)域選擇性乙酰化，得到中間體 2b。2b 與 Meldrum 酸縮合得到酰基 Meldrum 酸中間體 2c。2c 在甲醇中回流得到 β-酮酯 2d。2d 與肼衍生物在乙醇中回流發(fā)生環(huán)縮合，完成吡唑啉酮核心構(gòu)建，得到甲基和苯基取代吡唑啉酮 19 和 20。

如方案 3 所示，在堿性條件下對甲酯 2e 的 C3-羥基進行選擇性硅基保護，得到保護中間體 2f，產(chǎn)率為 90%。隨后，2f 在甲醇中與水合肼發(fā)生肼解，得到關(guān)鍵酰肼中間體 2g，產(chǎn)率為 93%。2g 再與苯甲酰氯發(fā)生酰胺化反應(yīng)，得到化合物 2h。以 p-TsCl 作為脫水劑進行分子內(nèi)環(huán)脫水，得到化合物 2i。最后，用 TBAF 脫保護，得到目標(biāo)產(chǎn)物 21。

化合物 22—24 按照與 21 類似的路線制備，見方案 4。所得化合物 22 在 LiOH 溶液中水解，以 86% 產(chǎn)率得到化合物 23。最后，在 0 °C 下用 BH?·Me?S 選擇性還原羧基，得到目標(biāo)化合物 24。

化合物 25—27 的合成路線見方案 5。關(guān)鍵酰肼中間體 2g 與 CDI 加熱發(fā)生分子內(nèi)環(huán)化，得到中間體 2l。隨后用 TBAF 脫除 TBS 保護基，得到目標(biāo)化合物 25。2g 與 BrCN 反應(yīng)后，伯胺發(fā)生親核取代形成單取代氨基腈。隨后在加熱條件下，氰基水解引發(fā)分子內(nèi)環(huán)化，構(gòu)建 2-氨基-1,3,4-噁二唑骨架。經(jīng)同樣的 TBAF 脫保護流程得到目標(biāo)化合物 26。在堿性條件下，2g 與 CS? 反應(yīng)生成穩(wěn)定的二硫代碳酸鉀中間體。加熱發(fā)生分子內(nèi)環(huán)化，得到中間體 2n。最后用 TBAF 脫除 TBS 保護基，得到目標(biāo)化合物 27。

目標(biāo)化合物 28 和 29 的合成見方案 6。OCA 與氨基硫脲縮合，高效得到酰基中間體 2o。隨后在堿性條件下環(huán)化，得到目標(biāo)化合物 28。對于化合物 29，中間體 2g 與 CS? 反應(yīng)生成二硫代碳酸鉀中間體。使用濃硫酸作為脫水劑進行分子內(nèi)脫水環(huán)化，同時去除 TBS 保護基，得到目標(biāo)化合物 29。

如方案 7 所示，在 DMF 和 MeCN 的極性非質(zhì)子混合溶劑中、堿性條件下，化合物 27 與多種烷基鹵化物發(fā)生親核取代反應(yīng)，得到相應(yīng)目標(biāo)產(chǎn)物。對于化合物 52，其二氟甲基硫醚部分通過文獻方法引入：先與 BrCF?COONa 發(fā)生親核取代，隨后經(jīng)熱脫羧得到產(chǎn)物，分離產(chǎn)率為 43%。

2.4. 選定化合物的藥代動力學(xué)研究

藥代動力學(xué)（PK）研究對于闡明藥物在體內(nèi)的行為、優(yōu)化給藥劑量和給藥方案具有重要作用，并能為藥物開發(fā)提供重要指導(dǎo)。因此，研究者考察了 3 個臨床前候選化合物 27、47 和 50 的 PK 性質(zhì)，主要藥代動力學(xué)參數(shù)見表 5。口服給藥后，化合物 27 顯示出最高的藥物暴露量（AUC?–t = 11000 ± 4270 h·ng/mL）和最慢的血漿清除率（CL = 931 ± 318 mL/h/kg）。這些結(jié)果支持化合物 27 在 SD 大鼠中具有良好的吸收和分布特征。化合物 27 在 SD 大鼠中具有較高口服生物利用度（F = 70.3%），提示其胃腸通透性優(yōu)良。總體來看，這些數(shù)據(jù)表明化合物 27 在 SD 大鼠中具有相對有利的藥代動力學(xué)性質(zhì)，表現(xiàn)為較高吸收與分布，以及較低清除率。

2.5. 組織分布譜研究

考慮到 FXR 主要表達于肝臟和腸道，觀察到化合物分布于這兩個組織具有藥理學(xué)意義。口服給藥后，化合物 27 在給藥后 1 h 即在肝臟中達到較高濃度，肝/血漿濃度比（L/P）為 24.9（表 6）。到 4 h 時，該比值仍維持在 22.5，說明其對主要靶器官具有持續(xù)且優(yōu)先的分布。同時，在回腸中也檢測到可測濃度，1 h 時回腸/血漿濃度比（I/P）為 1.2。以血漿濃度反映的系統(tǒng)暴露量從 1 h 到 4 h 明顯下降，組織濃度也相應(yīng)降低，提示其經(jīng)歷了相對快速的清除階段。較高且持續(xù)的 L/P 比值，加上血漿水平快速下降，提示化合物 27 能被肝臟高效攝取并隨后清除；這種分布特征可能有助于在維持作用部位療效的同時限制系統(tǒng)暴露。

總體而言，組織分布數(shù)據(jù)支持化合物 27 能在 FXR 相關(guān)組織中獲得相當(dāng)暴露，并且明顯偏向肝臟分布。高肝臟濃度和快速清除的藥代模式，可能有利于作為肝臟靶向治療藥物。

2.6. 細胞毒性實驗

通過 CCK-8 實驗進行細胞毒性分析（圖 S6）顯示，化合物 27 在 40 μM 時對 HEK293 細胞無明顯細胞毒性，IC?? 為 82.8 μM。同樣，在 80 μM 時，它對 HEK-293T 細胞也未誘導(dǎo)可檢測的細胞毒性（IC?? > 100 μM）。總體而言，這些數(shù)據(jù)表明化合物 27 在哺乳動物細胞模型中具有良好的安全性特征。

2.7. 核受體選擇性

在熒光素酶報告基因?qū)嶒炛校衔?27 對其他關(guān)鍵核受體未表現(xiàn)出明顯激動活性，具體包括 LXRα、RXRα、RXRβ 和 THRβ（表 7）。這些結(jié)果提示化合物 27 對 FXR 具有較高選擇性。當(dāng)然，仍需進一步研究，以更全面地表征其對其他受體類型的選擇性譜。

2.8. 化合物 27 對 MRGPRX4 激動活性的評價

研究者采用鈣動員實驗評價所選化合物對 MRGPRX4 的激動活性（表 8），以 DCA 作為陽性對照（EC?? = 279 nM），并將其在 10 μM 時的激動效能定義為 100%。化合物 27 在 90 μM 時表現(xiàn)出 32% 的部分激動效能，EC?? 為 25685 nM。相比之下，OCA 的激動效能為 61%，EC?? 為 5379 nM。選擇性指數(shù)（SI）定義為 MRGPRX4 與 FXR 的 EC?? 比值。OCA 的 SI 約為 8（5379/668）。值得注意的是，化合物 27 的 SI 顯著更高，為 201（25685/128），與 OCA 相比選擇性提高約 25 倍。基于其對 FXR 相對于 MRGPRX4 更高的選擇性指數(shù)（化合物 27：SI = 201；OCA：SI = 8），化合物 27 可被視為具有潛在更優(yōu)治療窗口的候選物。

雖然鈣流實驗?zāi)軌蚩煽繙y量與急性瘙癢相關(guān)的主要 Gq 偶聯(lián)信號，但對該受體調(diào)控特征的更完整理解仍需后續(xù)研究。此外，盡管化合物 27 的結(jié)構(gòu)優(yōu)化已顯著降低其相對于 OCA 的 MRGPRX4 活性，但僅憑體外數(shù)據(jù)尚不能完全排除殘余的、低于閾值的活性。因此，這一新化學(xué)類型應(yīng)被理解為降低而非徹底消除 MRGPRX4 介導(dǎo)瘙癢風(fēng)險。其較高的體外選擇性為潛在更優(yōu)治療窗口提供了強有力的機制依據(jù)。然而，是否真正具有無瘙癢特征，仍需在經(jīng)過驗證的體內(nèi)瘙癢模型中進一步確認。

2.9. 化合物 27 的 TGR5 激動活性評價

在 hTGR5 受體激活實驗中（表 9），化合物 27 表現(xiàn)出明顯的激動效能（EC?? = 1360 nM，Emax = 151%），優(yōu)于 OCA（EC?? = 2826 nM，Emax = 142%）。此外，化合物 27 對 rTGR5 的最大激活效能達到 140%，顯著高于 OCA（67%）。值得注意的是，人類瘙癢主要與 MRGPRX4 信號通路相關(guān)，而非 TGR5 激活。因此，化合物 27 的 TGR5 補充激活作用可能與其 FXR 激動作用一起，增強對 MASH 癥狀的整體改善。

重要的是，雖然 BAR502 和 OCA 都是有效的 FXR/TGR5 雙重激動劑，但 OCA 中的膽汁酸核心和羧酸鹽基團與 MRGPRX4 激活有關(guān)。相反，不含羧酸的 BAR502 在 17α-乙炔雌二醇小鼠瘙癢模型中未誘發(fā)抓撓行為。基于這一點，化合物 27 被設(shè)計為一種不同的非羧酸甾體骨架，其極性頭部為構(gòu)象受限的 1,3,4-噁二唑-2(3H)-硫酮。該有意設(shè)計的結(jié)構(gòu)修飾旨在主動破壞與 MRGPRX4 的關(guān)鍵相互作用。通過有效參與 TGR5 介導(dǎo)的通路，同時避免 MRGPRX4 相關(guān)瘙癢風(fēng)險，這種雙通路優(yōu)化策略使化合物 27 成為下一代候選物：既能實現(xiàn) FXR 激活和協(xié)調(diào)性代謝調(diào)節(jié)，又可能具備更優(yōu)的瘙癢安全性特征。

2.10. 化合物 27 在 LPS 誘導(dǎo) RAW264.7 細胞中的體外療效

研究者在脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的 RAW264.7 小鼠巨噬細胞中考察了化合物 27 的抗炎活性及其潛在機制。首先通過 CCK-8 實驗評價細胞毒性，結(jié)果證實化合物 27 在最高 60 μM 濃度下不會顯著影響細胞活力（圖 3A）。LPS 刺激顯著升高培養(yǎng)上清中的亞硝酸鹽水平；亞硝酸鹽是一氧化氮（NO）的穩(wěn)定代謝物，可作為炎癥激活指標(biāo)。在 LPS 刺激前 1 h 預(yù)處理化合物 27，可顯著抑制亞硝酸鹽升高，其抑制作用強于 OCA（圖 3B）。

此外，化合物 27 明顯下調(diào)促炎標(biāo)志物 Tnf、Adgre1 和 Cyp8b1 的 mRNA 表達，同時上調(diào)核受體 Nr1h4（FXR）的表達（圖 3C）。與 FXR 通路參與相一致，化合物 27 還提高了抗氧化反應(yīng)相關(guān)基因 Hmox1 和 Nqo1 的 mRNA 水平，并觀察到 Nrf2 有相應(yīng)升高趨勢（圖 3D）。這些結(jié)果提示，化合物 27 的抗炎活性至少部分可能通過 FXR 激活及隨后增強細胞抗氧化反應(yīng)實現(xiàn)。

總體而言，化合物 27 能有效抑制 RAW264.7 巨噬細胞中的 LPS 誘導(dǎo)炎癥。其抗炎活性與體外低細胞毒性共同支持其作為有前景治療候選物繼續(xù)研究。

圖 3. 化合物 27 在 LPS 誘導(dǎo) RAW264.7 細胞中的處理效果：（A）通過 CCK-8 實驗評價不同劑量化合物 27 對 RAW264.7 細胞活力的影響；（B）化合物 27 降低亞硝酸鹽水平，亞硝酸鹽作為 NO 生成標(biāo)志物；（C、D）通過 qPCR 分析相關(guān)基因，每組基因表達水平均歸一化至 WT 組。所有數(shù)據(jù)以均值 ± SD 表示（n = 3—6）。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，采用單因素 ANOVA 及 Dunnett 多重比較事后檢驗分析。

2.11. 化合物 27 在 CCl? 誘導(dǎo)肝纖維化模型中的體內(nèi)療效

研究者通過每周兩次腹腔注射 CCl?、連續(xù) 4 周，在小鼠中誘導(dǎo)肝纖維化（圖 4A）。與正常對照組相比，CCl? 模型組血清 TBA 和 TBIL 水平顯著升高（圖 4B），提示膽汁酸代謝紊亂和膽紅素排泄受損。正常對照組肝組織的天狼星紅染色顯示（圖 4C），肝細胞形態(tài)保持良好，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝索呈放射狀排列，未見膠原沉積。相比之下，CCl? 誘導(dǎo)纖維化模型組表現(xiàn)出嚴重結(jié)構(gòu)破壞，特征為寬大的膠原隔連接多個匯管區(qū)和中央靜脈，符合橋接纖維化表現(xiàn)，同時纖維化面積顯著增加。

為量化肝組織中的膠原沉積，研究者使用 AIPathwell v2 測量天狼星紅染色切片中的膠原陽性面積。OCA 處理可部分溶解匯管區(qū)膠原隔并減少纖維化面積，但局部纖維束仍然存在。值得注意的是，化合物 27 處理顯著減輕了纖維化病理表現(xiàn)，表現(xiàn)為匯管區(qū)膠原隔變薄、橋接結(jié)構(gòu)減少，并且經(jīng)天狼星紅定量證實膠原沉積顯著降低（圖 4D）。一致地，羥脯氨酸定量結(jié)果顯示，與 OCA 組相比，化合物 27 處理顯著降低肝臟總膠原含量（圖 4E）。總體而言，這些結(jié)果表明，化合物 27 能通過恢復(fù)肝實質(zhì)完整性并抑制細胞外基質(zhì)積累，有效改善 CCl? 誘導(dǎo)的肝纖維化。

圖 4. 化合物 27 在 CCl? 誘導(dǎo)肝纖維化小鼠中的處理效果：（A）實驗設(shè)計示意圖；（B）血清學(xué)數(shù)據(jù)；（C）通過天狼星紅染色進行肝組織病理學(xué)分析；（D）天狼星紅染色陽性面積定量；（E）肝組織中羥脯氨酸含量檢測。所有數(shù)據(jù)以均值 ± SD 表示（n = 6—8）。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，采用單因素 ANOVA 及 Dunnett 多重比較事后檢驗分析。

2.12. 化合物 27 在 ANIT 誘導(dǎo)膽汁淤積性肝損傷模型中的體內(nèi)療效

研究者進一步在 ANIT 誘導(dǎo)的膽汁淤積性肝損傷模型中開展體內(nèi)藥效學(xué)評價，實驗設(shè)計見圖 5A。如圖 5B 所示，與正常對照相比，ANIT 模型組中與膽汁淤積和肝損傷相關(guān)的血清生物標(biāo)志物明顯升高。OCA 處理使 ALP 水平中度下降，并顯著降低 TBA；但對 ALT、AST 和 TBIL 的影響很小。相反，化合物 27 能有效使所有檢測參數(shù)恢復(fù)至接近正常對照組水平。

H&E 染色切片中的肝損傷由 Servicebio 采用四級評分系統(tǒng)進行評價（表 S4）。H&E 染色病理分析（圖 5C）顯示，正常對照組小鼠肝結(jié)構(gòu)保持完整，肝細胞形態(tài)規(guī)則，核質(zhì)比平衡。相比之下，ANIT 模型組小鼠肝結(jié)構(gòu)破壞，出現(xiàn)明顯嗜酸性壞死灶，并在匯管區(qū)可見顯著炎癥浸潤。OCA 處理可部分恢復(fù)組織結(jié)構(gòu)，但仍存在殘余炎癥；而化合物 27 處理則使組織學(xué)形態(tài)接近正常，壞死或炎癥極少。組織病理學(xué)評價（圖 5D）證實，與 ANIT 模型組相比，化合物 27 顯著改善肝細胞損傷。化合物 27 處理明顯改善 ANIT 誘導(dǎo)膽汁淤積性肝損傷模型中的肝壞死、纖維化和炎性細胞浸潤。這些結(jié)果顯示其對肝損傷具有強保護作用，并突出其作為膽汁淤積性肝損傷高效治療藥物的潛力。

圖 5. 化合物 27 在 ANIT 誘導(dǎo)膽汁淤積小鼠中的處理效果：（A）實驗設(shè)計示意圖；（B）血清學(xué)數(shù)據(jù)；（C）通過 H&E 染色進行肝組織病理學(xué)分析，其中壞死以紅色箭頭表示，炎癥以藍色箭頭表示，出血以黑色箭頭表示；（D）肝損傷組織病理學(xué)評分。所有數(shù)據(jù)以均值 ± SD 表示（n = 6—8）。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，采用單因素 ANOVA 及 Dunnett 多重比較事后檢驗分析。

2.13. 化合物 27 在 WD 與 CCl? 共誘導(dǎo) MASH 模型中的體內(nèi)療效

鑒于候選化合物 27 在細胞水平顯示出 FXR/TGR5 雙靶點激動作用，研究者進一步使用 WD 與 CCl? 共誘導(dǎo)的 MASH 模型，在復(fù)雜生理環(huán)境中評價其抗 MASH 療效，實驗流程見圖 6A。與正常對照組相比，模型組肝重/體重比、腹股溝脂肪組織/體重比和附睪脂肪組織/體重比顯著升高，同時肝臟 TC 和 TG 水平升高（圖 6B）。化合物 27（20 mg/kg）顯著降低腹股溝和附睪脂肪組織/體重比，使其達到與正常組相當(dāng)?shù)乃剑覠o統(tǒng)計學(xué)顯著差異。值得注意的是，OCA 和化合物 27 均明顯減少肝脂質(zhì)積累，其中化合物 27 的作用更為明顯。

組織病理學(xué)分析（圖 6D）進一步證實，WD 與 CCl? 共誘導(dǎo)模型產(chǎn)生了嚴重 MASH 特征，包括脂肪變性、炎癥、肝細胞氣球樣變和肝纖維化。小鼠肝組織 H&E 染色顯示大量細胞質(zhì)脂滴空泡，并經(jīng)油紅 O 染色進一步驗證（圖 6D）。此外，MASH 小鼠肝小葉中也明顯觀察到炎性細胞浸潤和肝細胞氣球樣變。相比之下，OCA 和化合物 27 均顯著改善脂肪變性、小葉炎癥和氣球樣變。采用 NAFLD 活動度評分（NAS）進行定量評估，其中 NAS ≥ 5 定義為 MASH，NAS < 3 則排除 MASH。實驗結(jié)果顯示，OCA 和化合物 27 均顯著改善肝脂肪變性和小葉炎癥。此外，化合物 27（20 mg/kg）還改善肝細胞氣球樣變，其療效顯著優(yōu)于 OCA（圖 6F）。

研究者使用 AIpathwell v2 對感興趣區(qū)域內(nèi)膠原纖維面積與總組織面積之比進行定量。與正常對照組相比，模型組表現(xiàn)出典型纖維化特征，包括天狼星紅染色顯示膠原沉積增加，以及 α-SMA 陽性面積擴大（圖 6H）。OCA 和化合物 27 均明顯減輕纖維化；定量分析顯示，OCA 使纖維化膠原面積比例相對于模型組降低 30%，而相同劑量的化合物 27 降低超過 50%，提示其抗纖維化作用更強（圖 6G）。

線粒體功能障礙在 MASH 發(fā)病機制中發(fā)揮核心作用。肝細胞透射電鏡觀察顯示，與正常對照相比，模型組出現(xiàn)明顯線粒體超微結(jié)構(gòu)改變，表現(xiàn)為顯著腫脹、外膜破壞以及嵴結(jié)構(gòu)廣泛喪失，提示線粒體功能受損。化合物 27（20 mg/kg）顯著改善線粒體損傷（圖 6E）。最后，與正常對照組相比，模型組血清生物標(biāo)志物（ALT、AST、TBA、TC、HDL 和 LDL）顯著惡化。OCA 或化合物 27 處理均顯示出有益變化：所有生物標(biāo)志物均顯著下降，其中化合物 27（20 mg/kg）的改善最為明顯（圖 6C）。

綜合上述數(shù)據(jù)，化合物 27 是一種值得進一步研究的有效候選物，可用于 MASH 治療；臨床前研究提示其具有克服 OCA 相關(guān)局限的潛力。

圖 6. 化合物 27 在 WD 與 CCl? 共誘導(dǎo) MASH 小鼠中的處理效果：（A）實驗設(shè)計示意圖；（B）體重、組織重量比和肝脂質(zhì)水平；（C）血清生化參數(shù)；（D）通過 H&E、油紅 O、天狼星紅染色和 α-SMA 免疫組化進行肝組織病理學(xué)分析；（E）肝組織透射電鏡圖像，其中細胞核（N）、線粒體（M）、細胞質(zhì)脂質(zhì)（黃色箭頭）和線粒體損傷（紅色箭頭）；（F）NAFLD 活動度總評分；（G）天狼星紅染色陽性面積定量；（H）α-SMA 免疫組化陽性面積定量。所有數(shù)據(jù)以均值 ± SD 表示（n = 6—8）。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，采用單因素 ANOVA 及 Dunnett 多重比較事后檢驗分析。

2.14. 分子動力學(xué)模擬分析

為闡明 FXR 與化合物 27 相互作用的分子機制，研究者首先對化合物 27 與 FXR（PDB：1OSV）進行分子對接，以建立初始結(jié)合構(gòu)象，隨后進行 100 ns 分子動力學(xué)（MD）模擬，以優(yōu)化蛋白—配體相互作用。生產(chǎn)模擬階段中，F(xiàn)XR 的 Cα 原子和化合物 27 重原子的 RMSD 如圖 7A 所示。約 40 ns 后 RMSD 值達到平臺期，說明體系達到平衡，并確認復(fù)合物收斂（表 S5）。作為甾體類 FXR 激動劑，化合物 27 完全占據(jù) FXR 配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的 S1 口袋（圖 7E）。3α-OH 基團與 Tyr358 和 His444 形成穩(wěn)定氫鍵，而 7α-OH 基團與 Ser329 和 Tyr366 形成雙重氫鍵網(wǎng)絡(luò)。化合物 27 的噁二唑部分精確替代 OCA 的羧酸片段，并與 Arg328 形成氫鍵。同時，Arg328 質(zhì)子化胍基與噁二唑環(huán)之間形成陽離子—π 相互作用。

研究者通過結(jié)合自由能分解解析各殘基對能量的貢獻，以闡明關(guān)鍵相互作用位點。在 FXR-OCA 復(fù)合物中，Met262、Thr267、Leu284、Met287、Ala288、Met325、Arg328、Ser329、Ile332、Leu345、Ile349、Tyr358、Met362 和 Phe363 等殘基表現(xiàn)出顯著能量貢獻（圖 7F），提示 OCA 通過疏水相互作用、氫鍵和靜電作用穩(wěn)定復(fù)合物。Arg328 的顯著能量貢獻（?2.18 ± 0.99 kcal/mol）主要來自其側(cè)鏈與 OCA 羧基之間的靜電相互作用。相比之下，F(xiàn)XR-27 復(fù)合物中 Met262、Thr267、Leu284、Met287、Ala288、Met325、Ser329、Ile332、Leu345、Ile349、Tyr358、Met362、Phe363、His444 和 Met447 表現(xiàn)出明顯能量貢獻（圖 7F）。然而，Arg328 的貢獻降低（?1.49 ± 0.68 kcal/mol），說明化合物 27 通過去除羧酸基團降低了對精氨酸的依賴。同時，其與 Met262、Met287、Phe363、Ile332 和 Met447 的疏水相互作用顯著增強。

研究者還構(gòu)建了 OCA 和化合物 27 與 MRGPRX4 的結(jié)合模式，并進行 100 ns MD 模擬，以表征其結(jié)合特征。在 MRGPRX4-OCA 復(fù)合物中，甾體核心插入由 Val99、Trp158、Ile239、Tyr240、Leu246、Glu247 和 Leu249 形成的受體結(jié)合口袋（圖 7H）。OCA 的 7α-OH 與 Lys96 形成氫鍵，而其羧基與 Arg82、Arg95、Tyr250 和 Tyr254 形成多殘基氫鍵網(wǎng)絡(luò)。此外，羧基與 Arg82 和 Arg95 之間形成的鹽橋相互作用顯著增強復(fù)合物穩(wěn)定性。軌跡分析顯示，在 20—90 ns 時間范圍內(nèi)，該復(fù)合物 RMSD 穩(wěn)定在 0.35—0.40 nm（圖 7D），提示 OCA 在 MRGPRX4-OCA 復(fù)合物中具有穩(wěn)定結(jié)合構(gòu)象。相比之下，在化合物 27 中以噁二唑部分替代羧基會誘導(dǎo)側(cè)鏈構(gòu)象變化（圖 7G），從而阻止其與 Arg82 或 Arg95 形成鹽橋相互作用。噁二唑環(huán)僅與 Arg82 的胍基形成陽離子—π 相互作用。在 MD 模擬過程中，MRGPRX4-27 復(fù)合物 RMSD 軌跡表現(xiàn)出顯著不穩(wěn)定性（圖 7C 和表 S5），說明配體結(jié)合姿勢發(fā)生較大動態(tài)波動，導(dǎo)致其無法與受體形成穩(wěn)定復(fù)合物。

研究者采用 MM/PBSA 方法計算 OCA 結(jié)合和化合物 27 結(jié)合復(fù)合物的結(jié)合自由能，為基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計提供關(guān)鍵能量學(xué)信息。如表 10 所示，與 FXR-OCA 復(fù)合物（ΔE_TOTAL = ?53.57 ± 4.00 kcal/mol）相比，F(xiàn)XR-27 復(fù)合物具有更低的總結(jié)合自由能（ΔE_TOTAL = ?60.61 ± 6.69 kcal/mol），表明化合物 27 與 FXR 的結(jié)合穩(wěn)定性更強。化合物 27 對 FXR 的高親和力主要來源于優(yōu)化后的疏水互補性（ΔE_VDWAALS = ?64.36 ± 1.10 kcal/mol），這與其在細胞熒光素酶報告基因?qū)嶒炛性鰪姷墓δ苄Яο嘁恢拢ɑ衔?27：EC?? = 128 ± 9 nM；OCA：EC?? = 668 ± 10 nM）。相比之下，MRGPRX4-27 復(fù)合物的 ΔE_TOTAL（?21.71 ± 7.02 kcal/mol）高于 MRGPRX4-OCA 復(fù)合物（?32.64 ± 13.80 kcal/mol），提示化合物 27 與 MRGPRX4 的結(jié)合親和力較弱，這與其較低的受體激活效力一致。此外，OCA 的羧基與 MRGPRX4 結(jié)合口袋中帶正電的靜電勢表面發(fā)生強靜電相互作用（ΔE_EL = ?24.86 ± 8.63 kcal/mol）。相比之下，化合物 27 的靜電穩(wěn)定作用顯著較弱（ΔE_EL = ?10.14 ± 0.77 kcal/mol），這與其在該受體上的激動活性降低一致。

圖 7. 化合物 27 和 OCA 與 FXR（PDB ID：1OSV）及 MRGPRX4（PDB ID：7S8P）結(jié)合穩(wěn)定性和相互作用特征的分子動力學(xué)模擬分析：（A—D）FXR-27（A）、FXR-OCA（B）、MRGPRX4-27（C）和 MRGPRX4-OCA（D）復(fù)合物在三次獨立 100 ns MD 模擬中的 RMSD 曲線；（E）化合物 27 與 FXR 關(guān)鍵殘基的相互作用；（F）FXR-OCA 和 FXR-27 復(fù)合物結(jié)合自由能分解；（G）化合物 27 與 MRGPRX4 關(guān)鍵殘基的相互作用；（H）MRGPRX4-OCA 和 MRGPRX4-27 復(fù)合物結(jié)合自由能分解。數(shù)據(jù)以均值 ± SD 表示，n = 3。

2.15. 局限性與未來展望

本研究目前的范圍尚未允許對 FXR 和 TGR5 信號通路之間潛在協(xié)同作用進行詳細探索。雙重激動劑活性背后的整合藥理學(xué)機制仍有待全面闡明，這也是未來研究的重要方向。此外，研究者明確承認，盡管體外選擇性特征強烈提示瘙癢風(fēng)險降低，但最終仍需通過體內(nèi)實驗加以確認，這是后續(xù)研究的關(guān)鍵目標(biāo)。因此，MRGPRX4 活性的降低應(yīng)被視為一種可能拓寬治療窗口的特征，而其最終驗證將是該化合物繼續(xù)開發(fā)路徑中的必要下一步。

【Citation】:Zhang Z, Zheng X, Dong C, et al. Discovery of Non-Carboxylic Steroidal FXR Agonist as a Promising Preclinical Candidate for Metabolic Dysfunction-Associated Steatohepatitis.J Med Chem. Published online May 8,2026.

【貢獻】★★★★★

本研究通過基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計（SBDD）策略開發(fā)了一系列非羧酸甾體類 FXR 激動劑，并系統(tǒng)探索了其構(gòu)效關(guān)系。在合成的 50 個化合物中，化合物 27 是細胞熒光素酶報告基因?qū)嶒炛凶钣行У?FXR 激動劑（EC?? = 128 ± 9 nM）。其較有前景的開發(fā)價值還得到藥代動力學(xué)特征支持，包括較高口服生物利用度（F = 70.30%）。值得注意的是，化合物 27 對 MRGPRX4 的非期望激活作用很低，其選擇性指數(shù)（SI = 201）比 OCA（SI = 8）高 25 倍。在 WD + CCl? 共誘導(dǎo)的 MASH 模型中，化合物 27 顯著改善組織病理學(xué)指標(biāo)和纖維化指標(biāo)，效果優(yōu)于 OCA。總體而言，化合物 27 通過優(yōu)化有益的 FXR/TGR5 活性與 MRGPRX4 相關(guān)安全風(fēng)險之間的平衡，兼顧療效和安全性，為代謝性肝病提供了一種具有明確機制優(yōu)勢、具備臨床轉(zhuǎn)化潛力的候選化合物。

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