Advanced Science (IF=14.1) I 破解潰瘍性結(jié)腸炎新機(jī)制：SCP 調(diào)菌促生 12-HEPE，強(qiáng)力抑制 TLR4 炎癥軸！(謝建華...

2026年5月，南昌大學(xué)食品科學(xué)與資源全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室謝建華、申明月等，聯(lián)合海南大學(xué)、空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院、加拿大英屬哥倫比亞大學(xué)等，在Advanced Science（JCR Q1，Impact Factor=14.1）在線發(fā)表題為“Sulfated Cyclocarya Paliurus Polysaccharide Sorchestrates the Gut Microbiome to Mobilize a Host-Derived 12-HEPE Against Ulcerative Colitis”的研究論文。該文于2025年12月12日投稿，2026年4月20日修回，2026年5月7日接收。

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是一種反復(fù)發(fā)作的慢性炎癥性腸病，典型表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、便血和腸道免疫過(guò)度激活。長(zhǎng)期 UC 不僅嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，還會(huì)增加結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)。雖然目前已有 5-氨基水楊酸、生物制劑、免疫抑制劑等治療手段，但仍有相當(dāng)一部分患者療效有限或容易復(fù)發(fā)。因此，如何從疾病機(jī)制出發(fā)，尋找更安全、更精準(zhǔn)的干預(yù)策略，是 UC 研究的重要方向。

本研究聚焦于一種來(lái)源于青錢(qián)柳的天然多糖。青錢(qián)柳在我國(guó)南方分布較廣，其葉片長(zhǎng)期作為草本茶飲使用，具有調(diào)節(jié)血糖、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等傳統(tǒng)應(yīng)用基礎(chǔ)。青錢(qián)柳多糖（CP）是其中重要活性成分之一，但天然多糖在理化性質(zhì)和藥物開(kāi)發(fā)方面存在一定局限。為提高其生物活性，作者對(duì)青錢(qián)柳多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，并比較了多種修飾產(chǎn)物在 DSS 誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型中的作用。結(jié)果顯示，硫酸化青錢(qián)柳多糖（SCP）表現(xiàn)出最強(qiáng)的抗結(jié)腸炎效果。

圖片來(lái)源：doi.org/10.3390/su151310690

研究首先從疾病表型層面證明了 SCP 的保護(hù)作用。DSS 誘導(dǎo)的小鼠出現(xiàn)明顯體重下降、稀便、結(jié)腸縮短、疾病活動(dòng)指數(shù)升高以及結(jié)腸組織損傷；而 SCP 干預(yù)后，這些典型結(jié)腸炎表現(xiàn)均明顯緩解。組織學(xué)結(jié)果顯示，模型組小鼠結(jié)腸存在炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、隱窩破壞和腸道結(jié)構(gòu)紊亂，而 SCP 能顯著改善這些病理?yè)p傷。同時(shí)，SCP 還能降低 TNF-α、IL-1β 等炎癥因子水平，恢復(fù) Occludin、Claudin-1、ZO-1、MUC-2 等腸道屏障相關(guān)蛋白表達(dá)，提示其不僅能減輕炎癥，還能修復(fù)受損的腸道屏障。

機(jī)制上，本文最核心的發(fā)現(xiàn)是：SCP 并不是簡(jiǎn)單直接抑制炎癥，而是通過(guò)重塑腸道菌群，動(dòng)員宿主自身產(chǎn)生抗炎脂質(zhì)代謝物 12-HEPE，從而抑制 TLR4 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，SCP 可顯著改善 DSS 造成的腸道菌群失衡，使菌群結(jié)構(gòu)向正常狀態(tài)恢復(fù)，尤其表現(xiàn)為有益的擬桿菌門(mén)菌群增加，同時(shí)短鏈脂肪酸（SCFAs）水平升高。由于 SCFAs 對(duì)維持腸上皮能量代謝、緊密連接和免疫穩(wěn)態(tài)具有重要作用，這說(shuō)明 SCP 具有典型的“菌群導(dǎo)向型”調(diào)節(jié)特征。

為了驗(yàn)證腸道菌群是否是 SCP 發(fā)揮作用的關(guān)鍵，作者進(jìn)一步設(shè)計(jì)了抗生素清除菌群實(shí)驗(yàn)和糞菌移植實(shí)驗(yàn)。結(jié)果非常關(guān)鍵：當(dāng)小鼠腸道菌群被抗生素清除后，SCP 的抗結(jié)腸炎作用基本消失；而將 SCP 處理小鼠的糞菌移植給結(jié)腸炎小鼠后，即使不直接給予 SCP，也能模擬 SCP 的保護(hù)效果。這說(shuō)明 SCP 的治療作用高度依賴(lài)腸道菌群，SCP 更像是通過(guò)“調(diào)菌”來(lái)啟動(dòng)宿主保護(hù)機(jī)制，而不是單純作為一個(gè)直接抗炎藥物發(fā)揮作用。

隨后，作者通過(guò)靶向代謝組學(xué)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，經(jīng) SCP 重塑后的腸道菌群能夠促進(jìn)宿主來(lái)源的12-羥基二十碳五烯酸（12-HEPE）升高。12-HEPE 是一種脂質(zhì)代謝物，在 SCP 處理小鼠和 SCP 糞菌移植小鼠的血清及肝臟中均明顯升高；而在抗生素處理組和結(jié)腸炎模型組中則顯著降低。相關(guān)性分析顯示，擬桿菌門(mén)與 12-HEPE 水平呈顯著正相關(guān)，提示擬桿菌門(mén)可能是促進(jìn)宿主產(chǎn)生 12-HEPE 的關(guān)鍵菌群。

為了確認(rèn) 12-HEPE 是否真正具有抗結(jié)腸炎作用，研究者直接給 DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠補(bǔ)充 12-HEPE。結(jié)果顯示，12-HEPE 能夠明顯緩解體重下降、結(jié)腸縮短、糞便異常和組織損傷，并降低炎癥因子表達(dá)，恢復(fù)腸道屏障功能。進(jìn)一步的分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬顯示，12-HEPE 能夠與 TLR4 穩(wěn)定結(jié)合；Western blot 結(jié)果也顯示，12-HEPE 主要抑制 TLR4 介導(dǎo)的 NF-κB/NLRP3 炎癥信號(hào)通路。也就是說(shuō)，12-HEPE 是 SCP 通過(guò)腸道菌群誘導(dǎo)出的關(guān)鍵宿主抗炎分子。

更有說(shuō)服力的是，作者使用 TLR4 激動(dòng)劑進(jìn)行反向驗(yàn)證。當(dāng) TLR4 被激動(dòng)劑重新激活后，12-HEPE 的保護(hù)作用被明顯削弱甚至消除，無(wú)法再有效改善小鼠結(jié)腸炎癥狀、炎癥因子表達(dá)和腸道屏障損傷。這一結(jié)果說(shuō)明，TLR4 是 12-HEPE 發(fā)揮抗炎作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)，也進(jìn)一步閉合了本文的機(jī)制鏈條：SCP 調(diào)節(jié)菌群，菌群促進(jìn) 12-HEPE 產(chǎn)生，12-HEPE 靶向抑制 TLR4，最終減輕結(jié)腸炎。

值得注意的是，研究還在人類(lèi) UC 隊(duì)列中檢測(cè)到活動(dòng)性 UC 患者血清 12-HEPE 水平升高。作者認(rèn)為，這并不一定說(shuō)明 12-HEPE 具有致病作用，反而可能代表機(jī)體在持續(xù)炎癥狀態(tài)下啟動(dòng)的一種代償性保護(hù)反應(yīng)。換句話說(shuō)，患者體內(nèi) 12-HEPE 升高，可能是身體試圖“自我滅火”的一種表現(xiàn)，但這種內(nèi)源性保護(hù)反應(yīng)是否足夠、是否可被外源性干預(yù)放大，還需要進(jìn)一步研究。

總體來(lái)看，本文建立了一條清晰而完整的作用軸：
SCP → 重塑腸道菌群 → 富集擬桿菌門(mén)并促進(jìn) SCFAs 生成 → 動(dòng)員宿主產(chǎn)生 12-HEPE → 抑制 TLR4/NF-κB/NLRP3 炎癥信號(hào) → 修復(fù)腸道屏障并緩解 UC。

這項(xiàng)研究的創(chuàng)新性主要體現(xiàn)在三個(gè)方面。第一，它從結(jié)構(gòu)修飾角度證明，硫酸化修飾可以顯著增強(qiáng)青錢(qián)柳多糖的抗結(jié)腸炎活性。第二，它通過(guò)抗生素清除和糞菌移植實(shí)驗(yàn)，證明 SCP 的保護(hù)作用依賴(lài)腸道菌群，而不是簡(jiǎn)單的直接抗炎效應(yīng)。第三，它發(fā)現(xiàn)了“菌群—宿主 12-HEPE—TLR4”這一新的免疫代謝調(diào)控軸，為 UC 治療提供了新的機(jī)制靶點(diǎn)和干預(yù)思路。

總體而言，該研究不僅揭示了 SCP 改善潰瘍性結(jié)腸炎的關(guān)鍵機(jī)制，也提出了一種新的治療理念：通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群，激活宿主自身的抗炎脂質(zhì)代謝物，從而抑制關(guān)鍵炎癥通路。SCP 因此有望成為一種以腸道菌群為導(dǎo)向的 UC 候選干預(yù)物，而 12-HEPE–TLR4 軸也可能成為未來(lái)炎癥性腸病治療和機(jī)制研究中的重要方向。

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【摘要】

盡管已有大量證據(jù)支持天然產(chǎn)物來(lái)源化合物在潰瘍性結(jié)腸炎（UC）治療中的潛力，但其精確作用機(jī)制仍未完全闡明。本研究在葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)的 UC 小鼠模型中，評(píng)價(jià)了結(jié)構(gòu)修飾后的青錢(qián)柳多糖（CP）衍生物。在所測(cè)試的多種變體中，硫酸化青錢(qián)柳多糖（SCP）表現(xiàn)出最強(qiáng)的治療效果。SCP 給藥可顯著減輕結(jié)腸炎嚴(yán)重程度，具體表現(xiàn)為疾病癥狀緩解和腸道屏障功能增強(qiáng)。

機(jī)制上，SCP 通過(guò)富集有益的擬桿菌門(mén)菌群并增強(qiáng)短鏈脂肪酸（SCFAs）生成，恢復(fù)腸道菌群穩(wěn)態(tài)。這一被重塑的微生物生態(tài)系統(tǒng)進(jìn)一步促進(jìn)宿主來(lái)源的 12-羥基二十碳五烯酸（12-HEPE）上調(diào)，而 12-HEPE 可通過(guò)直接抑制 Toll 樣受體 4（TLR4）信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用。糞菌移植和抗生素介導(dǎo)的菌群耗竭實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了腸道菌群在該過(guò)程中的功能重要性。值得注意的是，當(dāng)聯(lián)合使用 TLR4 激動(dòng)劑時(shí)，12-HEPE 的治療獲益被消除，證實(shí)其靶向特異性。在人類(lèi) UC 隊(duì)列中，研究還觀察到血清 12-HEPE 水平升高，提示其可能代表一種潛在的代償性免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)。

本研究揭示了一條新的“腸道菌群—宿主”互作軸：SCP 通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群增強(qiáng)內(nèi)源性 12-HEPE 生成，從而抑制 TLR4 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)并緩解 UC。

01

研究背景及科學(xué)問(wèn)題

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是一種反復(fù)發(fā)作的炎癥性疾病，全球約有近 1000 萬(wàn)人受其影響，其典型特征包括嚴(yán)重腹痛和免疫過(guò)度反應(yīng)。長(zhǎng)期病程會(huì)使結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)呈階梯式上升：病程 10 年、20 年和 30 年后的風(fēng)險(xiǎn)分別為 1.6%、8.3% 和 18.4%。目前治療方法僅能使部分患者達(dá)到緩解，這凸顯了開(kāi)發(fā)基于機(jī)制的干預(yù)策略的必要性。如今，腸道—免疫軸已成為 UC 發(fā)病機(jī)制研究的核心。UC 中包括厚壁菌門(mén)在內(nèi)的致病菌及其他有害菌豐度升高，腸道菌群也被認(rèn)為是推動(dòng) UC 發(fā)生發(fā)展的重要因素。

青錢(qián)柳（Cyclocarya paliurus）主要分布于中國(guó)南方，并被廣泛用于傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)。其葉片長(zhǎng)期以來(lái)作為草本茶飲使用，用于緩解高血糖和炎癥。青錢(qián)柳多糖（CP）是其主要活性成分之一，具有抗氧化、抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。然而，其較差的理化性質(zhì)限制了其藥物開(kāi)發(fā)應(yīng)用。化學(xué)修飾為改變天然多糖結(jié)構(gòu)提供了一種新的有效策略，從而能夠根據(jù)需要調(diào)節(jié)其性質(zhì)，并拓展其在食品和藥物領(lǐng)域的應(yīng)用。硫酸化青錢(qián)柳多糖（SCP）相較于 CP，對(duì)免疫抑制小鼠具有更好的保護(hù)作用。SCP 還可通過(guò)抑制 TLR4/NF-κB 通路減輕腸道損傷，從而增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。因此，本研究假設(shè)，SCP 可通過(guò)重構(gòu)“腸道菌群—宿主代謝物—TLR4”網(wǎng)絡(luò)來(lái)改善 UC。

腸道菌群失調(diào)已被證實(shí)是潰瘍性結(jié)腸炎的重要驅(qū)動(dòng)因素。促炎性厚壁菌門(mén)擴(kuò)張，而具有保護(hù)作用的擬桿菌門(mén)和 Akkermansia 減少，表現(xiàn)為厚壁菌門(mén)/擬桿菌門(mén)比例升高，這與疾病活動(dòng)度相關(guān)，并可通過(guò)脂多糖（LPS）及其他微生物相關(guān)分子模式促進(jìn)基因毒性應(yīng)激。由這些微生物誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞 DNA 損傷，既可能來(lái)自 LPS 產(chǎn)生等直接機(jī)制，也可能來(lái)自微生物代謝物參與的間接機(jī)制。腸道微生物代謝物在菌群—宿主互作中具有關(guān)鍵作用，可對(duì)宿主生理產(chǎn)生廣泛影響。

在炎癥性腸病患者中，短鏈脂肪酸（SCFAs）、膽汁酸和吲哚衍生物等微生物代謝物普遍減少；這種減少會(huì)損害上皮細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)、緊密連接完整性和花生酸類(lèi)脂質(zhì)介質(zhì)平衡，從而推動(dòng)慢性炎癥。與健康人相比，炎癥性腸病患者中產(chǎn)生 SCFAs 的微生物顯著減少，并在腸道內(nèi)出現(xiàn)耗竭，提示其在 UC 發(fā)生和進(jìn)展中具有重要作用。SCFAs 通常能夠限制花生酸類(lèi)脂質(zhì)介質(zhì)級(jí)聯(lián)反應(yīng)；當(dāng)其減少時(shí)，會(huì)增強(qiáng)促脂質(zhì)介質(zhì)信號(hào)，促進(jìn)中性粒細(xì)胞募集并激活 NF-κB。這些由代謝物驅(qū)動(dòng)的效應(yīng)最終匯聚于模式識(shí)別受體，其中 TLR4 是菌群失調(diào)推動(dòng)結(jié)腸炎癥的主要感知受體。

本研究旨在明確 SCP 的精細(xì)結(jié)構(gòu)，并利用無(wú)菌動(dòng)物、抗生素菌群耗竭和糞菌移植模型證明 SCP 主要通過(guò)腸道菌群逆轉(zhuǎn) DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎。研究表明，SCP 可通過(guò)間接靶向 TLR4 減輕腸道炎癥。進(jìn)一步地，本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng) SCP 重塑后的腸道菌群可促進(jìn)宿主來(lái)源生物活性脂質(zhì) 12-HEPE 上調(diào)；12-HEPE 是介導(dǎo) SCP 保護(hù)作用的關(guān)鍵分子，主要通過(guò)抑制 TLR4 介導(dǎo)的 NF-κB/NLRP3 信號(hào)通路發(fā)揮作用。本研究闡明了一條新的菌群—宿主互作通路，并提示 SCP 是一種有前景的菌群靶向治療藥物。

02

重要發(fā)現(xiàn)及亮點(diǎn)

2.1 多糖結(jié)構(gòu)鑒定

為獲得準(zhǔn)確的多糖結(jié)構(gòu)信息，研究使用 H?O? 和 DE-52 柱對(duì) CP 進(jìn)行純化，以去除雜質(zhì)并消除干擾，最終獲得高純度多糖 CP1。CP1 的總糖含量為 82.14% ± 1.13%。CP1 主要由葡萄糖（Glc，53.57%）、半乳糖（Gal，26.70%）、阿拉伯糖（Ara，10.23%）和甘露糖（Man，9.50%）組成，其表面相對(duì)光滑，并呈蜂窩狀孔隙結(jié)構(gòu)。GC-MS 結(jié)果顯示，CP1 由 T-Araf（7.36%）、T-Glcp（11.43%）、T-Manp（5.97%）、1,3-Galp（24.17%）、1,4-Manp（4.60%）、1,2,5-Araf（3.70%）、1,6-Glcp（34.72%）和 1,2,4,6-Glcp（5.07%）組成。這些比例與單糖組成結(jié)果相近。主要分支單元為 1,6-Glcp 和 1,3-Galp，它們連接于 1,6-Glcp 殘基的 O-2 和 O-4 位點(diǎn)。

進(jìn)一步的核磁共振波譜分析驗(yàn)證了上述結(jié)構(gòu)信息，并揭示了多糖殘基之間的連接模式。結(jié)合一維 NMR 和二維 NMR 結(jié)果，研究識(shí)別出 8 個(gè) H1-H2 偶合共振信號(hào)。CP1 殘基的異頭質(zhì)子化學(xué)位移被歸屬為 δ 5.11、δ 5.31、δ 4.98、δ 5.26、δ 4.95、δ 5.15、δ 5.33 和 δ 4.58 ppm。此外，研究還通過(guò) DQF-COSY 和 HSQC 譜圖對(duì) A-H 殘基的其他化學(xué)位移進(jìn)行了歸屬。

二維 NMR HMBC 譜可用于解析 CP1 的連接方式。根據(jù)各殘基比例及上述結(jié)果，確認(rèn) 1,6-Glc 與 1,3-Gal 交替連接構(gòu)成 CP1 的主鏈。進(jìn)一步地，研究還歸屬了其他殘基之間的相關(guān)性。因此，CP1 的精細(xì)結(jié)構(gòu)得以確認(rèn)。結(jié)果表明，CP1 的骨架由 1,6-Glc 和 1,3-Gal 按 4:2 的比例組成，并且大約每?jī)蓚€(gè)重復(fù)單元中，1,6-Glc 的 O-2 和 O-6 位點(diǎn)發(fā)生取代。其側(cè)鏈由 T-Araf、T-Glcp、1,4-Manp、1,3-Araf 和 1,2,6-Manp 組成。

圖 1. 多糖結(jié)構(gòu)分析。
（A）CP1 的 1H NMR 譜圖；（B）CP1 的 1H-1H DQF-COSY 譜圖；（C）CP1 的 1H-13C HSQC 相關(guān)譜圖；（D）在 295 K 下記錄的 CP1 的 1H-13C HMBC 譜圖；（E）CP1 的主要重復(fù)單元；（F）多糖在 200× 和 500× 下的微觀結(jié)構(gòu)圖像。

2.2 SCP 顯著緩解 DSS 誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎

體重下降、稀便、結(jié)腸縮短以及結(jié)腸病理改變是結(jié)腸炎最顯著的特征。DSS 誘導(dǎo)小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重病理癥狀，包括體重下降、肝臟重量下降、脾臟增大、結(jié)腸縮短、糞便變稀、糞便 pH 升高以及疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）評(píng)分升高。然而，多糖預(yù)處理可以緩解這些變化。不同多糖的緩解程度不同，其中 SCP 在這些指標(biāo)上表現(xiàn)最佳，尤其是在結(jié)腸長(zhǎng)度指標(biāo)方面。結(jié)腸病理改變也可通過(guò)組織圖像直接觀察到。模型組出現(xiàn)嚴(yán)重病理?yè)p傷，包括炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、絨毛丟失和隱窩破壞。所有多糖組均能減輕這些癥狀，其中 SCP 組保護(hù)效果最佳。

為探索多糖緩解結(jié)腸炎的分子機(jī)制，研究進(jìn)行了 RNA 測(cè)序。結(jié)果顯示，所有組均未出現(xiàn)明顯的測(cè)序偏倚。PCA 分析能夠清晰地區(qū)分各多糖組與模型組，說(shuō)明兩者之間存在顯著差異；與其他多糖組相比，SCP 組與模型組的距離最遠(yuǎn)。Venn 圖顯示了類(lèi)似結(jié)果。與模型組相比，CP 組有 1762 個(gè)基因上調(diào)、1011 個(gè)基因下調(diào)；SCP 組有 3128 個(gè)基因上調(diào)、2060 個(gè)基因下調(diào)；ACCP 組有 391 個(gè)基因上調(diào)、184 個(gè)基因下調(diào)；CMCP 組有 1865 個(gè)基因上調(diào)、1264 個(gè)基因下調(diào)。差異表達(dá)基因的 GO 分析顯示，多糖預(yù)處理后主要變化條目包括“細(xì)胞黏附”“對(duì)刺激反應(yīng)的調(diào)節(jié)”“免疫反應(yīng)”和“炎癥反應(yīng)”。這些結(jié)果表明，炎癥和免疫失調(diào)在結(jié)腸炎中發(fā)揮核心作用，而多糖可有效緩解這些反應(yīng)。KEGG 分析發(fā)現(xiàn)，MAPK、NF-κB 和 ECM 通路顯著富集。

為驗(yàn)證免疫調(diào)節(jié)作用及杯狀細(xì)胞變化，研究對(duì) T 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞進(jìn)行了染色和計(jì)數(shù)。DSS 處理后，杯狀細(xì)胞顯著減少，而 CD4?、CD8? 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞顯著增加。然而，所有多糖組均可逆轉(zhuǎn)杯狀細(xì)胞、CD4? 細(xì)胞、CD8? 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的變化趨勢(shì)。對(duì)于炎癥因子，模型組中 TNF-α 和 IL-1β 水平升高，而多糖給藥組降低了這些水平。尤其是 SCP 顯著降低了 TNF-α 和 IL-1β 水平。此外，MPO、SIgA 和 TGF-β3 也呈現(xiàn)類(lèi)似趨勢(shì)。對(duì)于抗炎細(xì)胞因子 IL-4、IL-13、IL-17 和 IL-22，模型組中這些因子水平降低，而 SCP 給藥組能夠調(diào)節(jié)這些指標(biāo)。DAO 水平也顯示出類(lèi)似變化。結(jié)腸炎小鼠中 LBP 和 LPS 水平升高，而多糖處理降低了這種升高趨勢(shì)。與正常組相比，模型組緊密連接蛋白 zonulin、ZO-1、Occludin 和 Claudin-1 顯著減少；而多糖處理組，尤其是 SCP 組，減弱了這種下降。MUC-2 蛋白的免疫組化結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了上述腸道屏障功能結(jié)果。腸道屏障功能受損會(huì)導(dǎo)致有害物質(zhì)進(jìn)入血液，從而引起全身炎癥。與正常組相比，結(jié)腸炎小鼠肝臟中 T-AOC、CAT 和 SOD 表達(dá)顯著降低，而 MDA 生成顯著增加；SCP 組能夠逆轉(zhuǎn)這些趨勢(shì)。

為進(jìn)一步探究青錢(qián)柳多糖作用于結(jié)腸炎小鼠的機(jī)制，并驗(yàn)證 KEGG 結(jié)果，研究采用 Western blot 檢測(cè) MAPK、NF-κB 和 ECM 通路相關(guān)蛋白水平。DSS 增加了 Jnk、Erk、P38、SMAD2、SMAD3 和 NF-κB 的磷酸化水平。同時(shí)，在 DSS 影響下，TGF-β、SMAD4 和 MyD88 表達(dá)升高。然而，CP、SCP、ACCP 和 CMCP 給藥均可逆轉(zhuǎn)這一趨勢(shì)。這些結(jié)果表明，CP、SCP、ACCP 和 CMCP 可能通過(guò)類(lèi)似通路緩解小鼠結(jié)腸炎。這種共同性可能歸因于它們來(lái)源相同且化學(xué)結(jié)構(gòu)相似。

短鏈脂肪酸，包括乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸和戊酸，是多糖經(jīng)腸道菌群發(fā)酵產(chǎn)生的。與正常組相比，結(jié)腸炎小鼠盲腸中的 SCFAs 顯著降低。然而，所有多糖組中 SCFAs 水平均明顯升高。

研究還評(píng)估了多糖預(yù)處理結(jié)腸炎小鼠的腸道菌群。Rank-abundance 曲線趨于平坦，說(shuō)明樣本在物種組成上具有均一性和豐富性。基于 Bray–Curtis 距離的主坐標(biāo)分析（PCoA）顯示，正常組與模型組之間存在一定距離，說(shuō)明 DSS 處理改變了腸道菌群。喂食多糖后，所有組均向正常組靠近，其中 SCP 組最接近正常組。Venn 圖展示了各組之間共有和特有的 OTU。結(jié)果顯示，厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度占總微生物的 80% 以上，是結(jié)腸炎模型中最常見(jiàn)的菌群。DSS 飲水后，與正常組相比，厚壁菌門(mén)豐度顯著增加，而擬桿菌門(mén)顯著下降。SCP 預(yù)處理可顯著逆轉(zhuǎn)這些趨勢(shì)。在門(mén)水平上，SCP 組與正常組最為相似。

在屬和科水平上，DSS 處理后腸道菌群組成發(fā)生改變；而多糖預(yù)處理可緩解這一變化。其中，SCP 組在菌群組成或比例方面與正常組最為接近。研究進(jìn)一步通過(guò)線性判別分析效應(yīng)量（LEfSe）分析識(shí)別各組腸道菌群組成差異。Prevotella 屬和 Eubacteriaceae 科在正常組中占優(yōu)勢(shì)；厚壁菌門(mén)和 Clostridiales 綱在模型組中占優(yōu)勢(shì)；Eubacterium 屬在 SCP 組中占優(yōu)勢(shì)。總體而言，這些結(jié)果表明，SCP 對(duì)結(jié)腸炎小鼠具有最佳緩解作用，且腸道菌群可能在該過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

圖 2. CP、SCP、ACCP 和 CMCP 對(duì) DSS 誘導(dǎo)小鼠生理活動(dòng)及細(xì)胞因子的影響。
（A）多糖干預(yù) DSS 處理小鼠的實(shí)驗(yàn)流程示意圖。飼養(yǎng) 7 天后，所有小鼠被分為正常組（N）、模型組（M）、5-氨基水楊酸組（5-ASA，PC 組）、CP 組、SCP 組、ACCP 組和 CMCP 組。第 8 天至第 21 天，N 組和 M 組灌胃生理鹽水；CP、SCP、ACCP 和 CMCP 分別以 50 mg/kg 體重的劑量灌胃至相應(yīng)組；同時(shí)，PC 組給予 5-ASA，劑量為 100 mg/kg 體重。除 N 組外，其余組在最后 7 天飲水中加入 3% DSS。（B）體重；（C）第 14 天至第 7 天的體重變化率；（D）脾臟指數(shù)；（E）肝臟指數(shù)；（F）小鼠結(jié)腸代表圖；（G）結(jié)腸長(zhǎng)度；（H、I）多糖對(duì)糞便含水量和糞便 pH 的影響；（J）DAI；DAI =（體重指數(shù) + 糞便性狀評(píng)分 + 肛門(mén)出血評(píng)分）/3；（K）結(jié)腸 H&E 染色。

圖 3. CP、SCP、ACCP 和 CMCP 對(duì)腸道菌群多樣性及組成的影響。
（A）Rank-abundance 曲線；（B）基于 Bray–Curtis 距離的 PCoA 分析，置信區(qū)間為 95%；（C）Venn 圖，每個(gè)區(qū)塊代表一組，區(qū)塊重疊區(qū)域表示相應(yīng)組之間共有的 ASV/OTU，每個(gè)區(qū)塊中的數(shù)字表示該區(qū)塊包含的 ASV/OTU 數(shù)量；（D）門(mén)水平腸道菌群相對(duì)豐度，各組門(mén)水平腸道菌群相對(duì)豐度變化，數(shù)據(jù)為均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤，每種顏色代表一個(gè)菌門(mén)；（E）門(mén)水平代表性腸道菌群變化；（F）科水平腸道菌群相對(duì)豐度，各組科水平腸道菌群相對(duì)豐度變化，數(shù)據(jù)為均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤，每種顏色代表一個(gè)菌科；（G）屬水平腸道菌群相對(duì)豐度，各組屬水平腸道菌群相對(duì)豐度變化，數(shù)據(jù)為均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤，每種顏色代表一個(gè)菌屬；（H）腸道菌群分類(lèi)樹(shù)狀圖；（I）基于宏基因組分析數(shù)據(jù)通過(guò) LEfSe 生成的分類(lèi)進(jìn)化樹(shù)圖，每個(gè)圓圈大小與該分類(lèi)單元豐度成正比。

2.3 硫酸基取代位點(diǎn)確認(rèn)

進(jìn)一步地，研究對(duì) CP1 進(jìn)行硫酸化修飾，獲得 SCP1。與 CP1 相比，SCP1 在 1249 cm?1 處出現(xiàn) S─O 非對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)峰，在 819 cm?1 處出現(xiàn) C─O─S 對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)峰，而這兩個(gè)峰在 CP1 中不存在，說(shuō)明多糖硫酸化修飾成功。SCP1 的總糖含量為 80.38% ± 1.11%。CP1 和 SCP1 具有相似組成。SCP1 主要由 Glc（53.99%）、Gal（28.14%）、Ara（10.22%）和 Man（8.12%）組成。此外，SCP1 表面相對(duì)光滑，與 CP1 相似。這表明修飾過(guò)程中 CP1 主要發(fā)生基團(tuán)變化，其整體結(jié)構(gòu)未發(fā)生改變。

二維 NMR HSQC 譜顯示，在 84.71、83.82 和 80.11 ppm 處的峰明顯減弱，提示殘基 A 的 C4、殘基 A 的 C2 以及殘基 C 的 C2 位點(diǎn)主要被硫酸基取代。此外，SCP 的外觀形態(tài)與 CP 相似，說(shuō)明修飾過(guò)程對(duì) CP 的表觀結(jié)構(gòu)影響較小。

2.4 SCP 的緩解作用與腸道菌群相關(guān)

腸道菌群對(duì)抗生素較為敏感。因此，研究采用抗生素混合物處理以清除腸道菌群。為確認(rèn)腸道菌群是否是 SCP 治療結(jié)腸炎的關(guān)鍵因素，研究對(duì) DSS 誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠灌胃抗生素混合物。隨著結(jié)腸炎進(jìn)展，模型組、抗生素組和抗生素+SCP 組小鼠體重均迅速下降。然而，當(dāng)結(jié)腸炎小鼠接受抗生素混合物處理時(shí)，體重下降速度更快。抗生素處理結(jié)腸炎小鼠與普通結(jié)腸炎小鼠之間，結(jié)腸長(zhǎng)度未出現(xiàn)明顯變化。然而，研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是否灌胃多糖，抗生素處理小鼠盲腸中均出現(xiàn)大量血液積聚。與結(jié)腸炎小鼠相比，抗生素處理小鼠的糞便含水量和糞便 pH 變化均增加。DAI 結(jié)果也與上述結(jié)果一致。H&E 染色分析顯示，結(jié)腸炎小鼠存在炎癥浸潤(rùn)和腸道結(jié)構(gòu)破壞，抗生素處理進(jìn)一步加重了這些現(xiàn)象。然而，SCP 并不能緩解抗生素處理結(jié)腸炎小鼠中的這些癥狀。

為驗(yàn)證清除腸道菌群是否影響免疫調(diào)節(jié)作用，研究對(duì)杯狀細(xì)胞和 T 細(xì)胞變化進(jìn)行了染色和計(jì)算。DSS 飲水后，杯狀細(xì)胞顯著減少，CD4? 和 CD8? 細(xì)胞增加。然而，在抗生素混合物處理的結(jié)腸炎小鼠中，杯狀細(xì)胞減少以及 CD4?、CD8? 細(xì)胞增加的程度更加嚴(yán)重，且 SCP 對(duì)這些參數(shù)沒(méi)有緩解作用。對(duì)于炎癥因子 TNF-α、IL-1β 和 IFN-γ，模型組中這些因子水平顯著升高。而在結(jié)腸炎小鼠中加入抗生素混合物后，這些炎癥因子進(jìn)一步升高，尤其是 IFN-γ 和 TNF-α。此外，SCP 并不能減緩這種升高趨勢(shì)。MPO、SIgA、LPS、LBP 和 CCL2 水平也表現(xiàn)出類(lèi)似趨勢(shì)，尤其是 MPO、LPS、LBP 和 CCL2。對(duì)于抗炎細(xì)胞因子 IL-2、IL-4、IL-6、IL-13 和 IL-22，模型組中這些因子水平降低，而抗生素處理進(jìn)一步加重這種降低。DAO 也顯示出類(lèi)似趨勢(shì)。當(dāng)小鼠腸道菌群被清除后，SCP 處理無(wú)法發(fā)揮任何作用。

腸道屏障功能分析發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，結(jié)腸炎小鼠中緊密連接蛋白 Occludin 和 Claudin-1 顯著減少。然而，抗生素組和抗生素+SCP 組的腸道屏障功能受到更嚴(yán)重破壞。MUC-2 蛋白免疫組化檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了上述腸道屏障功能結(jié)果。

Western blot 結(jié)果顯示，抗生素混合物進(jìn)一步激活了結(jié)腸炎小鼠中的 NF-κB 和 ECM 通路。SCFAs 是多糖經(jīng)腸道菌群發(fā)酵產(chǎn)生的。因此，SCFAs 測(cè)定可間接證明腸道菌群是否被清除，從而驗(yàn)證上述結(jié)果的準(zhǔn)確性。結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組盲腸中的乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸和戊酸顯著降低。在加入抗生素混合物后，SCFAs 繼續(xù)下降至模型組的一半水平。

圖 4. 抗生素混合物實(shí)驗(yàn)中，SCP 的緩解作用與腸道菌群相關(guān)。
（A）多糖干預(yù) DSS 處理小鼠的實(shí)驗(yàn)流程示意圖。小鼠隨機(jī)分為四組：正常組（N）、模型組（M）、抗生素組（A）和抗生素+SCP 組（AS）。第 8 天至第 21 天，N 組和 M 組灌胃生理鹽水。A 組給予 0.2 mL 抗生素，AS 組給予 0.1 mL 抗生素 + 0.1 mL 50 mg/kg SCP 溶液。除 N 組外，其余組在最后 7 天飲水中加入 3% DSS。（B）體重；（C）第 21 天至第 14 天體重變化率；（D）小鼠結(jié)腸代表圖；（E）結(jié)腸長(zhǎng)度；（F-G）SCP 對(duì)糞便含水量和糞便 pH 的影響；（H）DAI；DAI =（體重指數(shù) + 糞便性狀評(píng)分 + 肛門(mén)出血評(píng)分）/3；（I）結(jié)腸 H&E 染色。

2.5 糞菌移植模擬了 SCP 治療的緩解作用

為驗(yàn)證腸道菌群介導(dǎo) SCP 的緩解作用，并確認(rèn) SCP 在這一過(guò)程中作為益生元發(fā)揮作用，研究使用來(lái)自 SCP 處理小鼠的糞菌對(duì) DSS 誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠進(jìn)行預(yù)處理。研究采用 16S rRNA 測(cè)序判斷糞菌移植是否成功。Rank-abundance 曲線趨于平坦，說(shuō)明樣本在物種組成上具有均一性。正如預(yù)期，在屬水平上，SCP 組和糞菌移植組的微生物組成相似，尤其是在糞菌移植小鼠中，厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)作為兩類(lèi)最豐富的菌群，其變化趨勢(shì)與 SCP 組一致。這些結(jié)果表明，糞菌移植成功。此外，SCFAs 結(jié)果也驗(yàn)證了糞菌移植成功。與模型組相比，糞菌移植組和糞菌移植+SCP 組盲腸中的 SCFAs 顯著恢復(fù)。

此外，與 SCP 組相比，糞菌移植在體重、結(jié)腸長(zhǎng)度、糞便含水量、糞便 pH 和 DAI 指數(shù)方面表現(xiàn)出相似的緩解作用。雖然糞菌移植+SCP 組相較模型組也顯著改善這些指標(biāo)，但其與糞菌移植組之間無(wú)明顯差異。這可能說(shuō)明 SCP 在該過(guò)程中主要作為益生元發(fā)揮作用，而不是通過(guò)其他方式直接緩解結(jié)腸炎。腺體排列紊亂、炎癥浸潤(rùn)和腸道結(jié)構(gòu)破壞得到恢復(fù)，證明糞菌移植可以模擬類(lèi)似 SCP 治療的緩解效果。通過(guò)觀察杯狀細(xì)胞和 T 細(xì)胞變化評(píng)估免疫調(diào)節(jié)作用，結(jié)果也證實(shí)糞菌移植可增加杯狀細(xì)胞數(shù)量，并減少 CD4? 和 CD8? 細(xì)胞。

與模型組相比，SCP 糞菌移植小鼠中 TNF-α、IL-1β、IFN-γ、MPO、SIgA、LPS、LBP 和 CCL2 表達(dá)顯著降低。與 DSS 誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠相比，糞菌移植組和糞菌移植+SCP 組中 IL-2、IL-4、IL-6、IL-13、IL-22 和 DAO 水平改善，并接近 SCP 組水平。這些結(jié)果表明，糞菌移植可抑制炎癥小體激活。對(duì)于腸道屏障功能，與 DSS 誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠相比，糞菌移植小鼠中 Occludin 和 Claudin-1 表達(dá)顯著恢復(fù)。MUC-2 蛋白免疫組化結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了上述腸道屏障功能結(jié)果。為判斷糞菌移植緩解結(jié)腸炎的機(jī)制是否與 SCP 治療相同，研究采用 Western blot 檢測(cè) NF-κB 和 ECM 通路相關(guān)蛋白。與模型組相比，糞菌移植與 SCP 治療類(lèi)似，可抑制結(jié)腸炎小鼠中 NF-κB、IκBα、SMAD2 和 SMAD3 的磷酸化，以及 TLR4、Myd88、TGF-β3 和 SMAD4 的表達(dá)。

圖 5. 糞菌移植對(duì)腸道菌群多樣性及組成的影響。
（A）Rank-abundance 曲線；（B）Venn 圖，每個(gè)區(qū)塊代表一組，區(qū)塊重疊區(qū)域表示相應(yīng)組之間共有的 ASV/OTU，每個(gè)區(qū)塊中的數(shù)字表示該區(qū)塊包含的 ASV/OTU 數(shù)量；（C）基于 Bray–Curtis 距離的 PCoA 分析，置信區(qū)間為 95%；（D）層次聚類(lèi)分析；（E）門(mén)水平腸道菌群相對(duì)豐度，各組門(mén)水平腸道菌群相對(duì)豐度變化，數(shù)據(jù)為均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤，每種顏色代表一個(gè)菌門(mén)；（F–H）門(mén)水平代表性腸道菌群變化；（I）基于 KEGG 分析的 PICRUSt 微生物功能預(yù)測(cè)。Castor 隱狀態(tài)預(yù)測(cè)算法根據(jù)進(jìn)化樹(shù)中參考序列對(duì)應(yīng)基因家族的拷貝數(shù)，預(yù)測(cè)特征序列最接近的序列物種，并獲得其基因家族拷貝數(shù)。隨后將基因家族“映射”到多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，并使用 MinPath 推斷代謝通路是否存在；（J）基于宏基因組分析數(shù)據(jù)通過(guò) LEfSe 生成的分類(lèi)進(jìn)化樹(shù)圖，每個(gè)圓圈大小與該分類(lèi)單元豐度成正比。

圖 6. 糞菌移植實(shí)驗(yàn)顯示，SCP 的緩解作用與腸道菌群相關(guān)。
（A）多糖干預(yù) DSS 處理小鼠的實(shí)驗(yàn)流程示意圖。在糞菌移植實(shí)驗(yàn)中，小鼠隨機(jī)分為五組：正常組（N）、模型組（M）、SCP 組、FMT 組（DSS 處理前移植 SCP 小鼠糞菌）和 FMT+SMP 組。第 8 天至第 21 天，N 組和 M 組灌胃生理鹽水。FMT 組給予 0.2 mL 糞菌液，F(xiàn)MT+SMP 組給予 0.1 mL 糞菌液 + 0.1 mL 50 mg/kg SCP 溶液。除 N 組外，其余組在最后 7 天飲水中加入 3% DSS。（B）體重；（C）DSS 處理后第 7 天至第 1 天體重變化率；（D）小鼠結(jié)腸代表圖；（E）結(jié)腸長(zhǎng)度；（F-G）SCP 及 SCP 糞菌移植對(duì)糞便含水量和糞便 pH 的影響；（H）DAI；DAI =（體重指數(shù) + 糞便性狀評(píng)分 + 肛門(mén)出血評(píng)分）/3；（I）結(jié)腸 H&E 染色。

2.6 SCP 重塑腸道菌群促進(jìn)宿主產(chǎn)生 12-HEPE

既往非靶向代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，花生酸類(lèi)相關(guān)代謝物在結(jié)腸炎發(fā)展中占據(jù)重要地位。為評(píng)估腸道菌群在結(jié)腸炎進(jìn)展中的影響，研究使用小鼠血清和肝臟樣本進(jìn)行靶向 UPLC-MS 代謝組學(xué)分析。有趣的是，重要代謝物 12-HEPE 在 SCP 處理小鼠的肝臟和血清中均出現(xiàn)富集。此外，在糞菌移植小鼠中，12-HEPE 信號(hào)強(qiáng)度也升高。令人注意的是，12-HEPE 在抗生素組和結(jié)腸炎小鼠的肝臟及血清中均顯著降低。綜合來(lái)看，12-HEPE 可能是一種由腸道菌群介導(dǎo)的重要宿主來(lái)源代謝物，并負(fù)責(zé) SCP 在結(jié)腸炎中的保護(hù)作用。

此外，研究使用 Spearman 相關(guān)性分析評(píng)估腸道菌群與 12-HEPE 的關(guān)系。擬桿菌門(mén)和放線菌門(mén)與 12-HEPE 呈正相關(guān)，其中只有擬桿菌門(mén)在肝臟和血清中均與 12-HEPE 呈顯著正相關(guān)。這些結(jié)果提示，擬桿菌門(mén)可能是促進(jìn)宿主產(chǎn)生 12-HEPE 的關(guān)鍵菌群。

2.7 補(bǔ)充 12-HEPE 可緩解 DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎

如上所述，SCP 處理和 SCP 小鼠糞菌移植均可提高 12-HEPE 濃度。因此，研究通過(guò)注射 12-HEPE 來(lái)驗(yàn)證其作用。正如預(yù)期，接受 12-HEPE 處理的小鼠，其結(jié)腸炎癥狀得到緩解，效果類(lèi)似于 SCP 處理和 SCP 小鼠糞菌移植處理，具體表現(xiàn)為體重、結(jié)腸長(zhǎng)度、糞便含水量、糞便 pH 和 DAI 指數(shù)改善。此外，12-HEPE 可減輕結(jié)腸中的炎癥浸潤(rùn)和腸道結(jié)構(gòu)破壞。

研究還通過(guò)觀察杯狀細(xì)胞、T 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞變化來(lái)評(píng)估免疫調(diào)節(jié)作用。結(jié)果證明，12-HEPE 可顯著增加杯狀細(xì)胞數(shù)量，并減少 CD4?、CD8? 和 F4/80 細(xì)胞數(shù)量。與模型組相比，12-HEPE 處理小鼠中 TNF-α、IL-1β、IFN-γ、MPO、SIgA、LBP 和 CCL2 表達(dá)顯著降低。與 DSS 誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠相比，12-HEPE 處理組中 IL-2、IL-4、IL-13、IL-17、IL-22 和 DAO 水平改善，其趨勢(shì)類(lèi)似于 SCP 組或 SCP 糞菌移植組，并與抗生素處理小鼠相反。對(duì)于腸道屏障功能，與 DSS 誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠相比，12-HEPE 處理小鼠中 Claudin-1 和 ZO-1 表達(dá)顯著恢復(fù)。MUC-2 蛋白免疫組化結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了上述腸道屏障功能結(jié)果。

在信號(hào)通路方面，與模型組相比，12-HEPE 抑制了結(jié)腸炎小鼠中 NF-κB、IκBα、Jnk、Erk、P38、SMAD2 和 SMAD3 的磷酸化，并抑制了 TLR4、Myd88、TGF-β3 和 SMAD4 的表達(dá)。然而，只有 TLR4 介導(dǎo)的 NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)蛋白，包括 TLR4、Myd88、NF-κB 和 IκBα，受到顯著抑制。因此，SCP 對(duì) DSS 誘導(dǎo)結(jié)腸炎的保護(hù)作用依賴(lài)于菌群介導(dǎo)的 12-HEPE 富集。

圖 7. 12-HEPE 對(duì)結(jié)腸炎的緩解作用。
（A）多糖干預(yù) DSS 處理小鼠的實(shí)驗(yàn)流程示意圖。在代謝物注射實(shí)驗(yàn)中，小鼠隨機(jī)分為三組：正常組（N）、模型組（M）和 12-HEPE 代謝物注射組（D）。第 8 天至第 21 天，N 組和 M 組每隔一天注射生理鹽水。D 組注射 0.2 mL 濃度為 100 ng/mL 的 12-HEPE。除 N 組外，其余組在最后 7 天飲水中加入 3% DSS。（B）體重；（C）第 14 天至第 7 天體重變化率；（D）小鼠結(jié)腸代表圖；（E）結(jié)腸長(zhǎng)度；（F-G）12-HEPE 對(duì)糞便含水量和糞便 pH 的影響；（H）DAI；DAI =（體重指數(shù) + 糞便性狀評(píng)分 + 肛門(mén)出血評(píng)分）/3；（I）結(jié)腸 H&E 染色。

2.8 12-HEPE 與關(guān)鍵受體 TLR4 結(jié)合的計(jì)算機(jī)對(duì)接模擬和分子動(dòng)力學(xué)分析

為進(jìn)一步驗(yàn)證 12-HEPE 是否能夠與 TLR4 受體相互作用，研究使用 Discovery Studio 分子對(duì)接模擬 12-HEPE 與 TLR4 受體之間的相互作用。結(jié)果顯示，12-HEPE 可與 TLR4 穩(wěn)定結(jié)合，結(jié)合自由能為 ?6.1 kcal/mol，說(shuō)明二者具有良好的結(jié)合活性。其中，TLR4 受體上的 HIS158 和 TYR183 殘基與 12-HEPE 形成疏水相互作用；ASP264 和 ARG233 殘基與 12-HEPE 形成不利供體—供體作用力；SER182、GLU265、PHE262 和 ALA157 殘基與 12-HEPE 形成范德華力。

均方根偏差（RMSD）通過(guò)計(jì)算原子相對(duì)于參考結(jié)構(gòu)的平均位移，量化蛋白和配體的構(gòu)象穩(wěn)定性。偏差越小，構(gòu)象穩(wěn)定性越好。因此，研究采用 RMSD 評(píng)估模擬體系的平衡狀態(tài)。復(fù)合物體系在 80 ns 后達(dá)到平衡，最終在約 5.2 ? 附近波動(dòng)，說(shuō)明小分子與靶蛋白結(jié)合過(guò)程中具有較高穩(wěn)定性。進(jìn)一步分析顯示，在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中，復(fù)合物體系的回轉(zhuǎn)半徑（Rg）和溶劑可及表面積（SASA）值僅有輕微波動(dòng)，提示小分子—靶蛋白復(fù)合物在動(dòng)態(tài)運(yùn)動(dòng)過(guò)程中發(fā)生了一定構(gòu)象變化。氫鍵是決定配體—蛋白相互作用結(jié)合親和力和特異性的關(guān)鍵因素。在動(dòng)態(tài)模擬過(guò)程中，靶蛋白與小分子之間形成了多個(gè)氫鍵，數(shù)量范圍為 0 至 4。值得注意的是，在大部分模擬時(shí)間中，復(fù)合物維持約 2 個(gè)氫鍵，表明靶蛋白與配體之間存在穩(wěn)定的氫鍵相互作用。

蛋白質(zhì)中氨基酸殘基的柔性通過(guò)均方根波動(dòng)（RMSF）反映。復(fù)合物體系的 RMSF 值相對(duì)較低，大多數(shù)低于 4 ?，說(shuō)明柔性降低、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性增強(qiáng)。綜上，12-HEPE–TLR4 體系結(jié)合穩(wěn)定，且復(fù)合物具有良好的氫鍵作用。因此，12-HEPE 對(duì)靶蛋白 TLR4 具有良好的結(jié)合效果。

圖 8. TLR4 是 12-HEPE 發(fā)揮結(jié)腸炎緩解作用的關(guān)鍵受體。
（A）NF-κB、p-NF-κB、IκBα、p-IκBα、MyD88、TLR4 和 NLRP3 的蛋白水平；（B-F）TLR4/β-actin（B）、MyD88/β-actin（C）、p-NF-κB/NF-κB（D）、p-IκBα/IκBα（E）和 NLRP3/β-actin（F）的相對(duì)強(qiáng)度；（G）TGF-β、SMAD2、p-SMAD2、SMAD3、p-SMAD3 和 SMAD4 的蛋白水平；（H-K）TGF-β/β-actin（H）、p-SMAD2/SMAD2（I）、p-SMAD3/SMAD3（J）和 SMAD4/β-actin（K）的相對(duì)強(qiáng)度；（L）Jnk、p-Jnk、Erk、p-Erk、P38 和 p-P38 的蛋白水平；（M-O）p-Jnk/Jnk（M）、p-Erk/Erk（N）和 p-P38/P38（O）的相對(duì)強(qiáng)度。（P-Q）12-HEPE 與 TLR4 的分子對(duì)接。（R）吉布斯能量景觀（三維）。（S）RMSD、（T）Rg、（U）SASA、（V）氫鍵數(shù)量和（W）RMSF 分析，用于評(píng)估 12-HEPE 與 TLR4 的結(jié)合。

2.9 12-HEPE 通過(guò)阻斷 TLR4 激活發(fā)揮結(jié)腸炎保護(hù)作用

TLR4 受體是結(jié)腸炎進(jìn)展的重要觸發(fā)因素。結(jié)腸炎小鼠中 TLR4 相關(guān)蛋白表達(dá)升高。抑制 TLR4 受體激活可抑制結(jié)腸炎癥狀。因此，在結(jié)腸炎小鼠中抑制 TLR4 受體是一種潛在治療靶點(diǎn)。鑒于 12-HEPE 能夠緩解結(jié)腸炎癥狀，研究進(jìn)一步探討 12-HEPE 是否通過(guò)抑制 TLR4 激活發(fā)揮抗炎作用。研究將 TLR4 激動(dòng)劑與 12-HEPE 聯(lián)合腹腔注射，以觀察 12-HEPE 是否仍能對(duì)結(jié)腸炎小鼠發(fā)揮緩解作用。

正如預(yù)期，與 TLR4 激動(dòng)劑組相比，12-HEPE 不能抑制結(jié)腸炎小鼠中 NF-κB、IκBα 的磷酸化，也不能抑制 Myd88 和 NLRP3 表達(dá)。這表明 TLR4 受體在 12-HEPE 緩解結(jié)腸炎過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。此外，在小鼠結(jié)腸炎癥狀指標(biāo)方面，包括體重、結(jié)腸長(zhǎng)度、糞便含水量、糞便 pH 和 DAI 指數(shù)，12-HEPE 也不能表現(xiàn)出緩解作用。在免疫細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞因子表達(dá)和腸道屏障完整性方面也觀察到類(lèi)似結(jié)果，即在 KS09 存在時(shí)，12-HEPE 無(wú)法抑制 TLR4。因此，這些結(jié)果表明，12-HEPE 通過(guò)阻斷 TLR4 受體在結(jié)腸炎小鼠中發(fā)揮抗炎作用。

圖 9. 12-HEPE 通過(guò)阻斷 TLR4 激活發(fā)揮結(jié)腸炎保護(hù)作用。
（A）多糖干預(yù) DSS 處理小鼠的實(shí)驗(yàn)流程示意圖。在激動(dòng)劑實(shí)驗(yàn)中，小鼠隨機(jī)分為兩組：KS09 組（Y）和 KS09+12-HEPE 組（DY）。TLR4 激動(dòng)劑 KS09 以及 KS09+12-HEPE 每隔一天注射至相應(yīng)組小鼠。除 N 組外，其余組在最后 7 天飲水中加入 3% DSS。（B）NF-κB、p-NF-κB、IκBα、p-IκBα、MyD88、TLR4 和 NLRP3 的蛋白水平；（C-G）TLR4/β-actin（C）、MyD88/β-actin（D）、p-NF-κB/NF-κB（E）、p-IκBα/IκBα（F）和 NLRP3/β-actin（G）的相對(duì)強(qiáng)度；（H）體重；（I）第 14 天至第 7 天體重變化率；（J）小鼠結(jié)腸代表圖；（K）結(jié)腸長(zhǎng)度；（L-M）TLR4 激動(dòng)劑 KS09 和 KS09+12-HEPE 對(duì)糞便含水量和糞便 pH 的影響；（N）DAI；DAI =（體重指數(shù) + 糞便性狀評(píng)分 + 肛門(mén)出血評(píng)分）/3。

2.10 UC 患者血清 12-HEPE 升高提示一種代償性反應(yīng)

為探索人類(lèi)中 12-HEPE 與結(jié)腸炎嚴(yán)重程度之間的關(guān)系，研究納入了獨(dú)立驗(yàn)證隊(duì)列。有趣的是，研究觀察到，活動(dòng)性結(jié)腸炎患者的血清 12-HEPE 水平并未降低，反而顯著高于健康對(duì)照。這一發(fā)現(xiàn)與小鼠中外源性補(bǔ)充 12-HEPE 的治療效果形成了有趣對(duì)比。研究者推測(cè)，這種升高并不代表 12-HEPE 具有致病作用，而是可能代表一種宿主來(lái)源的代償性保護(hù)反應(yīng)，用于抵抗持續(xù)炎癥。患者之間存在顯著異質(zhì)性，其中一個(gè)明顯亞群表現(xiàn)出非常高的 12-HEPE 水平，這可能反映了不同患者啟動(dòng)這種保護(hù)性反應(yīng)的能力存在差異。

圖 10. 12-HEPE 發(fā)揮結(jié)腸炎保護(hù)作用的機(jī)制。
（A）CD4?、CD8?、F4/80 和杯狀細(xì)胞的免疫組化染色。ABPAS（B）、CD4?（C）、CD8?（D）和 F4/80（E）的組裝圖定量分析；（F）TNF-α 濃度；（G）IL-1β 濃度；（H）IFN-γ 濃度；（I）IL-2 濃度；（J）IL-4 濃度；（K）IL-6 濃度；（L）IL-13 濃度；（M）IL-17 濃度；（N）IL-22 濃度；（O）MPO 濃度；（P）SIgA 濃度；（Q）DAO 濃度；（R）LBP 濃度；（S）CCL2 濃度；（T）MUC-2 的免疫組化染色及定量分析。（U）在醫(yī)院建立發(fā)現(xiàn)隊(duì)列和獨(dú)立驗(yàn)證人類(lèi) UC 隊(duì)列；（V）健康對(duì)照組（HC，n = 52）和 UC 組（n = 78）中 12-HEPE 的濃度。

【Citation】:Chen, X., Shen, M., Zhang, R., Huang, Z., Niu, H., Yu, Q., Chen, Y., Pan, X., Rong, L., Wen, H., Yang, J., & Xie, J. (2026). Sulfated Cyclocarya Paliurus Polysaccharide Sorchestrates the Gut Microbiome to Mobilize a Host-Derived 12-HEPE Against Ulcerative Colitis.Advanced science (Weinheim, Baden-Wurttemberg, Germany), e75681. Advance online publication.

【貢獻(xiàn)】★★★★★

綜上，本研究全面闡明了 SCP 抗結(jié)腸炎作用的機(jī)制，建立了多糖結(jié)構(gòu)、腸道菌群生態(tài)和宿主免疫代謝之間的因果聯(lián)系。多組學(xué)整合分析顯示，SCP 可富集產(chǎn)生 SCFAs 的擬桿菌門(mén)菌群，從而推動(dòng)結(jié)腸上皮產(chǎn)生專(zhuān)門(mén)促炎癥消退介質(zhì) 12-HEPE。12-HEPE 以納摩爾親和力結(jié)合 TLR4，阻斷 NF-κB/NLRP3 信號(hào)通路，并模擬 SCP 介導(dǎo)的保護(hù)作用。遺傳或藥理學(xué)方式重新激活 TLR4 會(huì)消除 12-HEPE 和 SCP 的療效。

總體而言，本研究確立了一條具有藥物開(kāi)發(fā)潛力的“腸道菌群—脂質(zhì)代謝物—TLR4”軸，并將 SCP 定位為一種首創(chuàng)的、以腸道菌群為導(dǎo)向的 UC 治療候選物。SCP—腸道菌群—12-HEPE—TLR4 軸的發(fā)現(xiàn)，不僅推進(jìn)了我們對(duì)宿主—微生物互作的認(rèn)識(shí)，也為通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群、動(dòng)員機(jī)體內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制治療 UC 開(kāi)辟了新的方向。

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