Phytomedicine (1區(qū)-TOP) I 紅花逍遙片破解PMS多維病機(jī)：從入血成分到腸道菌群，揭示中藥復(fù)方“雙通路”調(diào)控 (李后開-上海中醫(yī)藥大學(xué))

2026年4月5日，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)院、上海中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院李后開團(tuán)隊(duì)聯(lián)合中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所張彥瓊團(tuán)隊(duì)、上海中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院鄭寧寧團(tuán)隊(duì)、澳門大學(xué)中藥質(zhì)量研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室萬建波團(tuán)隊(duì)等在Phytomedicine（中科院1區(qū)-TOP期刊，IF=8.3）在線發(fā)表題為 “Mechanistic study on the holistic actions of Hong-Hua-Xiao-Yao Tablet in alleviating premenstrual syndrome in rats” 的研究論文。

該研究圍繞上市中成藥紅花逍遙片（Hong-Hua-Xiao-Yao Tablet, HHXYT） 改善經(jīng)前綜合征（PMS）的作用機(jī)制展開，綜合運(yùn)用血清代謝組學(xué)、組織特異性轉(zhuǎn)錄組學(xué)、16S rRNA測(cè)序、含藥血清藥效驗(yàn)證、入血成分分析、離體腸菌共培養(yǎng)及偽無菌動(dòng)物模型，系統(tǒng)闡明紅花逍遙片通過“入血成分直接發(fā)揮藥效”與“腸道菌群介導(dǎo)間接轉(zhuǎn)化”雙重機(jī)制改善PMS的整體作用模式。

經(jīng)前綜合征是一類與月經(jīng)周期密切相關(guān)的神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂性疾病，患者常表現(xiàn)為焦慮、抑郁、易怒、情緒波動(dòng)等精神癥狀，同時(shí)伴隨乳房脹痛、頭痛、腹脹、肌肉疼痛等軀體不適。由于PMS病因復(fù)雜，涉及神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫炎癥、代謝及腸道菌群等多個(gè)層面，傳統(tǒng)單一靶點(diǎn)干預(yù)往往難以全面解釋其發(fā)病機(jī)制，也難以充分體現(xiàn)中藥復(fù)方的整體調(diào)節(jié)優(yōu)勢(shì)。紅花逍遙片源于經(jīng)典方逍遙散，由竹葉柴胡、當(dāng)歸、白芍、白術(shù)、茯苓、薄荷、紅花、皂角刺、甘草等九味藥組成，臨床上已用于PMS治療，但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和系統(tǒng)作用機(jī)制長期不夠清晰。

本研究首先從整體層面對(duì)紅花逍遙片的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行解析。研究團(tuán)隊(duì)通過血清代謝組學(xué)結(jié)合卵巢、子宮和海馬組織轉(zhuǎn)錄組學(xué)發(fā)現(xiàn)，紅花逍遙片能夠顯著調(diào)節(jié)PMS大鼠體內(nèi)異常的代謝譜和靶器官基因表達(dá)譜，主要涉及葡萄糖-6-磷酸代謝、鞘脂代謝、甘油磷脂代謝等關(guān)鍵通路。這說明紅花逍遙片并非只針對(duì)某一個(gè)癥狀或單一器官發(fā)揮作用，而是通過代謝—轉(zhuǎn)錄—靶器官聯(lián)動(dòng)的方式，協(xié)同改善PMS相關(guān)的神經(jīng)內(nèi)分泌失衡、炎癥反應(yīng)和機(jī)體代謝紊亂。

在“直接藥效”層面，研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，紅花逍遙片含藥血清可特異性抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，而對(duì)其他PMS相關(guān)細(xì)胞的抑炎作用相對(duì)有限。成分分析顯示，紅花逍遙片入血成分中以甘草來源化合物占比較高，其中 甘草酸、18β-甘草次酸、甘草苷和甘草素 等成分能夠顯著抑制小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)。由于焦慮、抑郁、情緒波動(dòng)等PMS核心癥狀與神經(jīng)炎癥密切相關(guān)，這一結(jié)果提示：紅花逍遙片中的部分入血活性成分可能通過直接進(jìn)入循環(huán)并作用于中樞炎癥相關(guān)細(xì)胞，從而緩解PMS的情緒和神經(jīng)行為異常。

更值得關(guān)注的是，研究發(fā)現(xiàn)方中君藥竹葉柴胡相關(guān)入血原型成分并不明顯，這提示其療效可能并不主要依賴“直接入血”，而是通過腸道菌群代謝轉(zhuǎn)化等間接機(jī)制發(fā)揮作用。為驗(yàn)證這一假設(shè)，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步開展16S rRNA測(cè)序、偽無菌動(dòng)物模型和離體腸菌共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，紅花逍遙片能夠改善PMS大鼠腸道菌群紊亂，使菌群結(jié)構(gòu)向正常狀態(tài)回歸；當(dāng)腸道菌群被抗生素削弱后，紅花逍遙片改善雌激素水平、海馬神經(jīng)元損傷和行為學(xué)異常的效果也隨之減弱，說明腸道菌群至少部分參與了紅花逍遙片的治療作用。

在機(jī)制深化方面，研究進(jìn)一步證明，經(jīng)過腸道菌群代謝后的紅花逍遙片可在細(xì)胞層面緩解炎癥、氧化應(yīng)激和激素失衡。具體而言，菌群代謝后的紅花逍遙片能夠降低炎癥因子表達(dá)，改善KGN細(xì)胞中的氧化應(yīng)激狀態(tài)，并對(duì)FSH、LH等激素相關(guān)指標(biāo)產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。這一發(fā)現(xiàn)將紅花逍遙片的作用機(jī)制從“藥物—宿主”拓展為“藥物—菌群—宿主”三方互作模式，也更符合中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)協(xié)同干預(yù)疾病的特點(diǎn)。

該研究的亮點(diǎn)在于，它沒有簡(jiǎn)單停留在“某幾個(gè)成分對(duì)應(yīng)某幾個(gè)靶點(diǎn)”的線性解釋，而是從整體藥效出發(fā)，將入血成分、神經(jīng)炎癥、代謝重編程、靶器官轉(zhuǎn)錄調(diào)控和腸道菌群轉(zhuǎn)化整合到同一研究框架中。研究明確提出紅花逍遙片改善PMS存在兩條互補(bǔ)路徑：一方面，部分入血活性成分可直接抑制小膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)炎癥；另一方面，未被直接吸收的成分可通過調(diào)控和依賴腸道菌群，進(jìn)一步影響炎癥、氧化應(yīng)激和激素穩(wěn)態(tài)。

總體來看，這項(xiàng)研究為紅花逍遙片治療PMS提供了系統(tǒng)性的現(xiàn)代藥理學(xué)證據(jù)，也為中藥復(fù)方機(jī)制研究提供了一個(gè)較好的范式：既要關(guān)注“入血成分”的直接藥效，也不能忽視“未入血成分”經(jīng)腸道菌群轉(zhuǎn)化后的間接貢獻(xiàn)。未來，圍繞紅花逍遙片關(guān)鍵活性成分、菌群代謝產(chǎn)物以及“腸—腦—卵巢/子宮軸”的深入研究，有望進(jìn)一步推動(dòng)PMS治療從經(jīng)驗(yàn)用藥走向機(jī)制明確、靶點(diǎn)清晰、物質(zhì)基礎(chǔ)可追溯的精準(zhǔn)干預(yù)。

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【摘要】

背景：經(jīng)前綜合征（PMS）是一種周期性神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂，可對(duì)全球女性的身心健康造成不良影響。紅花逍遙片（HHXYT）是一種已上市的中成藥，臨床上對(duì)PMS具有明確治療作用。然而，由于PMS本身及HHXYT組成均極為復(fù)雜，其潛在機(jī)制仍缺乏清晰認(rèn)識(shí)。

目的：闡明HHXYT改善PMS的系統(tǒng)性作用機(jī)制。

方法：本研究采用血清代謝組學(xué)與組織特異性轉(zhuǎn)錄組學(xué)相結(jié)合的整合策略，識(shí)別HHXYT影響的關(guān)鍵代謝通路；同時(shí)利用16S rRNA基因測(cè)序評(píng)估腸道菌群組成。研究還通過體外實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)其在PMS相關(guān)細(xì)胞中的抗神經(jīng)炎癥作用，并進(jìn)一步驗(yàn)證入血成分的生物活性。腸道菌群的作用則通過離體培養(yǎng)和偽無菌模型進(jìn)一步探究。

結(jié)果：HHXYT影響血清代謝物譜及靶器官轉(zhuǎn)錄譜，主要涉及葡萄糖-6-磷酸代謝、鞘脂代謝和甘油磷脂代謝，從而改善PMS的全身性癥狀。此外，HHXYT含藥血清可特異性抑制小膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)炎癥，而不影響其他PMS相關(guān)靶細(xì)胞。隨后，研究鑒定出62種入血成分，主要來源于甘草（GC，36種化合物）。其中，4種來源于甘草的化合物——甘草酸、18β-甘草次酸、甘草苷和甘草素——顯著抑制小膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)炎癥。值得注意的是，君藥竹葉柴胡來源的入血成分未被檢測(cè)到，提示其治療作用可能通過涉及腸道菌群代謝的間接機(jī)制實(shí)現(xiàn)。通過離體培養(yǎng)和偽無菌模型，研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)腸道菌群部分介導(dǎo)了HHXYT的治療效益，且HHXYT有助于維持腸道菌群穩(wěn)態(tài)。此外，研究還觀察到經(jīng)腸道菌群代謝后的HHXYT有助于緩解炎癥、氧化應(yīng)激和激素失衡。

結(jié)論：本研究從整體層面揭示了HHXYT抗PMS作用背后的雙重機(jī)制，即直接生物活性與菌群依賴效應(yīng)，強(qiáng)調(diào)了宿主—菌群相互作用在中藥作用發(fā)揮中的重要性。

關(guān)鍵詞：紅花逍遙片；經(jīng)前綜合征；代謝組學(xué)；轉(zhuǎn)錄組學(xué)；腸道菌群；入血成分。

01

研究背景及科學(xué)問題

經(jīng)前綜合征（PMS）是一種影響育齡女性的周期性神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂，主要表現(xiàn)為情緒波動(dòng)、焦慮、易怒和抑郁等情緒癥狀，同時(shí)伴有乳房脹痛、頭痛、腹脹和肌肉疼痛等軀體表現(xiàn)。這些癥狀通常出現(xiàn)在黃體期，并在月經(jīng)來潮后緩解。PMS的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明。因此，常規(guī)治療多集中于激素調(diào)節(jié)，但其療效往往難以持續(xù)。紅花逍遙片（HHXYT）是在經(jīng)典方逍遙散基礎(chǔ)上優(yōu)化形成的制劑，由九味中藥組成，包括竹葉柴胡、當(dāng)歸、白芍、白術(shù)、茯苓、薄荷、紅花、皂角刺和甘草。該藥是臨床批準(zhǔn)用于PMS管理的中成藥。盡管臨床證據(jù)支持其有效性和安全性，但其藥理機(jī)制與藥效物質(zhì)基礎(chǔ)仍不清楚。

中藥復(fù)方的作用通常由多成分之間的相互作用介導(dǎo)，并通過多種通路發(fā)揮效應(yīng)。口服中藥既可通過被吸收入血的成分發(fā)揮藥理作用，例如進(jìn)入體循環(huán)后直接調(diào)節(jié)宿主生理功能的黃酮類和萜類化合物；也可通過難以吸收的成分發(fā)揮作用，例如皂苷和多糖等。這類成分可能通過與腸道菌群相互作用而產(chǎn)生效應(yīng)。一方面，未被吸收的成分可調(diào)節(jié)腸道菌群的組成和代謝活性；另一方面，其中部分成分也可被腸道菌群代謝，生成新的生物活性分子，或促進(jìn)其吸收。鑒于中藥、腸道菌群和宿主之間存在復(fù)雜互作，闡明中藥整體作用需要采用多維度策略，同時(shí)考慮吸收成分的直接作用，以及未吸收成分在腸道中的作用。

鑒于PMS機(jī)制和HHXYT成分均具有高度復(fù)雜性，本研究在前期已經(jīng)驗(yàn)證HHXYT對(duì)PMS模型療效的基礎(chǔ)上，采用多組學(xué)方法系統(tǒng)解析HHXYT治療PMS的整體機(jī)制。研究首先進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和16S rRNA基因測(cè)序，系統(tǒng)評(píng)估HHXYT處理后PMS大鼠血清代謝、組織特異性轉(zhuǎn)錄改變以及腸道菌群組成變化。隨后，研究在相關(guān)靶細(xì)胞中檢測(cè)HHXYT代表性入血成分的直接作用，并通過腸道菌群與HHXYT成分的離體共培養(yǎng)探索微生物生物轉(zhuǎn)化的作用。結(jié)果表明，HHXYT通過多維方式緩解PMS癥狀，包括調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌通路、炎癥反應(yīng)以及部分依賴腸道菌群的生物轉(zhuǎn)化，突出體現(xiàn)了HHXYT對(duì)PMS綜合征的整體調(diào)控作用。

02

重要發(fā)現(xiàn)及亮點(diǎn)

HHXYT通過改變代謝組學(xué)和多組織轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征改善PMS

HHXYT改善大鼠PMS的療效已經(jīng)得到驗(yàn)證。為覆蓋PMS癥狀的廣泛譜系，研究對(duì)血清樣本進(jìn)行代謝組學(xué)分析，并對(duì)卵巢、子宮和海馬組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。該策略用于刻畫PMS大鼠在有無HHXYT干預(yù)條件下的綜合變化，實(shí)驗(yàn)流程見圖1A。

基于LC-MS和GC-MS的非靶向代謝組學(xué)整合分析顯示，血清樣本中存在六類主要代謝物，包括溶血磷脂酰膽堿（LPC）、磷脂酰膽堿（PC）、氨基酸、有機(jī)酸、胺類和碳水化合物。偏最小二乘判別分析（PLS-DA）顯示，各組之間的代謝譜存在可辨別差異。值得注意的是，HHXYT處理組呈現(xiàn)向?qū)φ战M代謝模式移動(dòng)的趨勢(shì)，提示PMS誘導(dǎo)的代謝紊亂得到部分恢復(fù)。對(duì)照組與模型組之間共鑒定出114種差異代謝物，其中49種上調(diào)、65種下調(diào)；模型組與HHXYT組之間鑒定出42種差異代謝物，其中37種上調(diào)、5種下調(diào)。差異代謝物富集的主要功能通路涉及氮代謝，以及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成。對(duì)組織轉(zhuǎn)錄組譜（卵巢、子宮和海馬）的Venn分析顯示，不同組之間既存在共享表達(dá)基因，也存在特異表達(dá)基因，提示治療引發(fā)了組織特異性反應(yīng)。

為系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物，研究進(jìn)一步對(duì)代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行整合差異分析。火山圖顯示，模型組與對(duì)照組之間，以及HHXYT處理組與模型組之間均存在不同的代謝模式。HHXYT干預(yù)顯著逆轉(zhuǎn)了模型組中膽酰絲氨酸、lysoPA(i-20:0/0:0)和甘氨鵝脫氧膽酸水平下降的趨勢(shì)。進(jìn)一步的平行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明，卵巢、子宮和海馬組織存在組織特異性的差異表達(dá)模式。與對(duì)照組相比，模型組在卵巢、子宮和海馬組織中分別檢測(cè)到1036個(gè)、404個(gè)和156個(gè)差異表達(dá)基因，其中卵巢為80個(gè)上調(diào)、956個(gè)下調(diào)，子宮為319個(gè)上調(diào)、85個(gè)下調(diào)，海馬為75個(gè)上調(diào)、81個(gè)下調(diào)。HHXYT處理則分別顯著調(diào)節(jié)這些組織中的629個(gè)、162個(gè)和249個(gè)差異表達(dá)基因，其中卵巢為497個(gè)上調(diào)、122個(gè)下調(diào)，子宮為85個(gè)上調(diào)、77個(gè)下調(diào)，海馬為209個(gè)上調(diào)、40個(gè)下調(diào)。

HHXYT逆轉(zhuǎn)的關(guān)鍵差異表達(dá)基因包括與卵巢功能相關(guān)的Cuzd1（細(xì)胞外基質(zhì)重塑）、Gad2（GABA能信號(hào)）和Themis3（T細(xì)胞調(diào)節(jié)），子宮中表達(dá)的Anlnl1（細(xì)胞骨架組織），以及海馬中的Selenow（抗氧化反應(yīng)）。這些靶點(diǎn)的協(xié)同正常化提示，HHXYT可能通過多組織層面的神經(jīng)內(nèi)分泌—免疫串?dāng)_調(diào)節(jié)改善PMS癥狀。

代謝組學(xué)與多器官轉(zhuǎn)錄組學(xué)譜的整合顯示，HHXYT干預(yù)后神經(jīng)酰胺代謝過程、鞘脂代謝過程和膜脂生物合成過程發(fā)生富集。對(duì)前50個(gè)差異基因構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖后發(fā)現(xiàn)，葡萄糖-6-磷酸代謝、鞘脂代謝和甘油磷脂代謝出現(xiàn)顯著改變。這些結(jié)果提示，HHXYT影響血清代謝譜和靶器官轉(zhuǎn)錄譜，從而改善PMS的全身性癥狀。

為進(jìn)一步闡明循環(huán)代謝物與組織特異性基因表達(dá)之間的分子聯(lián)系，研究構(gòu)建Sankey圖，以可視化特定代謝物、共享通路及靶組織相應(yīng)基因之間的連接關(guān)系。例如，鳥氨酸和天冬酰胺分別與谷胱甘肽代謝以及丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代謝相關(guān)，并進(jìn)一步影響海馬和子宮中的Gstm2以及海馬和子宮中的Il4i1。鞘氨醇和二氫神經(jīng)酰胺通過海馬和子宮中的Mapk13與鞘脂信號(hào)相連，而多種溶血磷脂（LysoPC、LysoPE）則通過Etnk2匯聚于甘油磷脂代謝。這些發(fā)現(xiàn)從系統(tǒng)層面展示了HHXYT如何通過相互連接的代謝和轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)協(xié)調(diào)多組織反應(yīng)。

圖1 多組織代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析揭示PMS大鼠對(duì)HHXYT治療反應(yīng)中的代謝與基因表達(dá)變化。（A）大鼠組織取樣、組學(xué)測(cè)序和整合分析的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖。（B）對(duì)照組、模型組和HHXYT組的PLS-DA代謝組譜（對(duì)照組n=7，模型組n=8，HHXYT組n=7）。（C）PMS相關(guān)靶器官（卵巢、子宮和海馬）中所有表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)Venn分析（每組n=3）。（D）血清差異表達(dá)代謝物以及卵巢、子宮和海馬差異表達(dá)基因的火山圖。紅框中的數(shù)字表示上調(diào)的差異代謝物/差異表達(dá)基因數(shù)量，藍(lán)框中的數(shù)字表示下調(diào)的差異代謝物/差異表達(dá)基因數(shù)量；各組樣本量與B和C相同。

圖2 整合代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析揭示HHXYT調(diào)節(jié)PMS大鼠相關(guān)通路。（A）模型組與HHXYT組之間前50個(gè)差異表達(dá)代謝物和差異表達(dá)基因的生物過程（Gene Ontology）富集分析。（B）模型組與HHXYT組之間前50個(gè)差異表達(dá)基因的蛋白—蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)使用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建，第一層相互作用因子數(shù)量限制為50，并采用高置信度閾值（0.700）。各組樣本量與圖1相同。

HHXYT含藥血清及其活性成分改善小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥

PMS中的失調(diào)基因主要參與神經(jīng)系統(tǒng)功能、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)、血液循環(huán)以及免疫炎癥平衡，這與抑郁、焦慮和血瘀等臨床表現(xiàn)相對(duì)應(yīng)。神經(jīng)炎癥被認(rèn)為是抑郁和焦慮的重要促發(fā)因素，外周炎癥也會(huì)調(diào)節(jié)疾病進(jìn)展。既往體內(nèi)結(jié)果也支持這一點(diǎn)，即PMS大鼠模型中子宮炎癥因子升高，而HHXYT處理可有效逆轉(zhuǎn)該變化。因此，為探索HHXYT在體外的藥效作用，研究使用LPS刺激PMS相關(guān)細(xì)胞（BV-2細(xì)胞、RAW 264.7細(xì)胞、大鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和KGN細(xì)胞），建立神經(jīng)和外周炎癥模型。由于中藥成分通常通過系統(tǒng)吸收后的成分發(fā)揮作用，研究制備HHXYT含藥血清，并評(píng)估其在LPS刺激下對(duì)上述四類細(xì)胞的抗炎作用。

在BV-2細(xì)胞中，LPS顯著增加炎癥因子表達(dá)；相比之下，20% HHXYT含藥血清相較模型組顯著降低Tnfα、Il1β和Inos水平。然而，該含藥血清對(duì)另外三類細(xì)胞未顯示顯著作用。研究進(jìn)一步確認(rèn)，20% HHXYT含藥血清可通過TLR4/NF-κB通路緩解LPS誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞神經(jīng)炎癥。

為識(shí)別具體的抗神經(jīng)炎癥成分，研究分析了HHXYT提取物和HHXYT含藥血清的化學(xué)譜。提取物中共鑒定出126種化合物，并進(jìn)一步解析其結(jié)構(gòu)分類和植物來源。值得注意的是，檢測(cè)到72種入血成分，包括24種三萜、18種黃酮、10種有機(jī)酸、6種單萜、4種酞內(nèi)酯以及其他成分。對(duì)各味藥對(duì)這些成分的貢獻(xiàn)進(jìn)行量化后發(fā)現(xiàn)，甘草（GC）來源成分最多，共36種化合物，其次為白芍（BS，17種）及其他藥味（如DG、ZYCH）。

隨后，研究評(píng)估了來自白芍和甘草的7種潛在活性成分在BV-2細(xì)胞中的抗神經(jīng)炎癥作用。與對(duì)照組相比，LPS刺激（模型組）顯著升高Tnfα、Il1β和Inos表達(dá)；而甘草酸、18β-甘草次酸、甘草苷和甘草素顯著降低Tnfα和Il1β mRNA水平。此外，甘草酸、甘草苷、甘草素和芒柄花素顯著抑制Inos表達(dá)。為進(jìn)一步表征這些活性成分在體內(nèi)的暴露情況，研究對(duì)代表性成分開展藥代動(dòng)力學(xué)研究。在7種可檢測(cè)化合物（芍藥苷、Z-藁本內(nèi)酯、芒柄花素、甘草素、甘草苷、甘草酸和18β-甘草次酸）中，建立了濃度—時(shí)間曲線及關(guān)鍵藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。重要的是，藥代動(dòng)力學(xué)分析證實(shí)了4種甘草來源化合物（甘草酸、18β-甘草次酸、甘草苷和甘草素）能夠進(jìn)入腦內(nèi)，強(qiáng)調(diào)其作為直接中樞神經(jīng)系統(tǒng)活性成分的潛力。

圖3 HHXYT含藥血清緩解小膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)炎癥并表征其生物活性成分。（A）HHXYT含藥血清作用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的流程圖。（B-E）20% HHXYT含藥血清對(duì)LPS誘導(dǎo)的PMS相關(guān)靶細(xì)胞炎癥因子表達(dá)水平的影響（B：BV-2細(xì)胞；C：RAW 264.7細(xì)胞；D：大鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞；E：KGN細(xì)胞）。（F）HHXYT入血成分的化合物結(jié)構(gòu)分類。（G）各味藥所含化學(xué)成分?jǐn)?shù)量。（H）HHXYT的7種入血原型成分對(duì)LPS誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞炎癥因子表達(dá)水平的影響。各成分測(cè)試濃度如下：芍藥苷100 μM；白芍苷100 μM；甘草酸50 μM；18β-甘草次酸10 μM；甘草苷50 μM；甘草素10 μM；芒柄花素1 μM。結(jié)果以均值±SEM表示（每組n=3），多組比較采用單因素方差分析評(píng)估統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。

HHXYT緩解PMS大鼠腸道菌群紊亂

在確認(rèn)HHXYT具有直接抗神經(jīng)炎癥作用后，研究進(jìn)一步關(guān)注未被吸收入血成分的潛在作用。對(duì)HHXYT成分在入血前后的分析顯示，部分中藥質(zhì)量標(biāo)志物成分未被檢測(cè)到，尤其是來源于君藥竹葉柴胡的成分。這一發(fā)現(xiàn)提示，腸道菌群可能介導(dǎo)未吸收成分的治療作用。

因此，研究采用16S rRNA基因測(cè)序評(píng)估HHXYT對(duì)PMS大鼠腸道菌群的影響。α多樣性分析（Sobs和Shannon指數(shù)）顯示，各組之間無顯著差異。然而，PCoA分析顯示，對(duì)照組與模型組明顯分離，而HHXYT組更接近對(duì)照組，提示HHXYT可調(diào)節(jié)菌群結(jié)構(gòu)。組成分析表明，HHXYT干預(yù)逆轉(zhuǎn)了模型誘導(dǎo)的若干菌科變化，包括Eggerthellaceae、Bifidobacteriaceae、Christensenellaceae和Eubacterium_coprostanoligenes_group。LEfSe分析顯示，在屬水平上，模型組和HHXYT組分別存在9個(gè)和6個(gè)差異豐度分支。多組比較進(jìn)一步顯示，HHXYT給藥顯著調(diào)節(jié)多個(gè)菌種的豐度，包括Lactobacillus_johnsonii、Lactobacillus_murinus、Corynebacterium_stationis、Streptococcus_hyointestinalis、Corynebacterium_glutamicum、metagenome_g_Lachnospiraceae_ND3007_group和Akkermansia_muciniphila，且不同菌種呈現(xiàn)不同響應(yīng)模式。

隨后，微生物代謝功能預(yù)測(cè)顯示，類固醇激素生物合成、甲狀旁腺激素合成以及甲苯降解等通路在模型組中顯著降低，而在HHXYT給藥后升高。此外，Spearman相關(guān)性分析揭示了HHXYT影響的特定腸道微生物與血清代謝物之間存在顯著關(guān)聯(lián)。值得注意的是，Akkermansia豐度與神經(jīng)肽cortistatin A和脂質(zhì)信號(hào)分子鞘氨醇呈正相關(guān)，而Corynebacterium與脂質(zhì)化合物呈負(fù)相關(guān)，并與抗炎化合物青蒿素呈正相關(guān)。總體而言，這些發(fā)現(xiàn)表明HHXYT可改善PMS大鼠腸道菌群紊亂。

有趣的是，上述多個(gè)菌群相關(guān)代謝物（例如鞘氨醇、鳥氨酸、溶血磷脂）也是整合代謝組—轉(zhuǎn)錄組網(wǎng)絡(luò)中的核心節(jié)點(diǎn)，提示腸道菌群可能通過相關(guān)軸線影響宿主基因表達(dá)。例如，與Akkermansia正相關(guān)的鞘氨醇與鞘脂信號(hào)通路及海馬、子宮中的Mapk13表達(dá)相連。類似地，與多個(gè)細(xì)菌屬相關(guān)的鳥氨酸連接到谷胱甘肽代謝以及靶組織中的Gstm2表達(dá)。這些發(fā)現(xiàn)表明，HHXYT可改善PMS大鼠腸道菌群紊亂，并揭示了可能參與其治療作用的菌群—代謝物—宿主基因軸。

圖4 HHXYT調(diào)節(jié)PMS大鼠腸道微生物組結(jié)構(gòu)和功能。（A）以Sobs和Shannon指數(shù)表示的α多樣性。（B）基于Bray-Curtis距離的屬水平PCoA分析。（C）科水平腸道菌群組成（群落柱狀圖分析）。（D）LEfSe分析。（E）物種水平腸道菌群差異分析（Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)柱狀圖）。（F）基于16S rRNA基因測(cè)序數(shù)據(jù)并由PICRUSt2預(yù)測(cè)的PMS大鼠HHXYT干預(yù)相關(guān)腸道微生物群功能變化熱圖。推斷微生物功能譜后，對(duì)各組KEGG第3層級(jí)通路進(jìn)行比較（粉色表示上調(diào)，綠色表示下調(diào)）。（G）HHXYT干預(yù)改變的代謝物與微生物之間的Spearman相關(guān)性分析。數(shù)據(jù)以均值±SEM表示（每組n=5），*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

腸道菌群部分介導(dǎo)HHXYT對(duì)PMS的治療效益

為確定HHXYT的治療效益是否依賴腸道菌群，研究在偽無菌大鼠模型中評(píng)估其療效。卵巢組織病理學(xué)分析和凝血參數(shù)顯示，各組之間無顯著差異。與對(duì)照組相比，模型組大鼠血清和卵巢組織中的E2水平均顯著降低。HHXYT處理可有效逆轉(zhuǎn)這些變化；然而，在腸道菌群耗竭后，其治療效果減弱。模型組血清孕酮水平顯著升高，而HHXYT處理可有效逆轉(zhuǎn)該變化；但卵巢孕酮水平在各組之間無顯著差異。

Nissl染色顯示，模型組海馬CA1和CA3區(qū)域存在神經(jīng)元損傷，表現(xiàn)為結(jié)構(gòu)萎縮和變形，并伴隨CA3區(qū)域神經(jīng)元數(shù)量顯著減少。HHXYT干預(yù)改善了這些形態(tài)學(xué)異常，并部分恢復(fù)CA3區(qū)神經(jīng)元密度；而在菌群耗竭大鼠中，這些改善減弱。開放場(chǎng)實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠運(yùn)動(dòng)參數(shù)降低，包括中心區(qū)停留時(shí)間、移動(dòng)距離以及進(jìn)入中心區(qū)次數(shù)。HHXYT處理有效改善運(yùn)動(dòng)參數(shù)，但在ABX_HHXYT組中未顯示明顯作用。綜上，這些結(jié)果表明，腸道菌群部分介導(dǎo)了HHXYT對(duì)PMS的治療作用。

圖5 腸道菌群部分介導(dǎo)HHXYT對(duì)PMS的治療作用。（A）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。（B-E）HHXYT調(diào)節(jié)性激素水平的作用（B：血清E2；C：血清PROG；D：卵巢E2；E：卵巢PROG）。（F）大鼠海馬Nissl染色代表性圖像以及CA1、CA3區(qū)域神經(jīng)元數(shù)量。CA1為海馬角1區(qū)，CA3為海馬角3區(qū)。（G）開放場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中的代表性運(yùn)動(dòng)軌跡、移動(dòng)距離、中心區(qū)停留時(shí)間及進(jìn)入中心區(qū)次數(shù)。結(jié)果以均值±SEM表示（每組n=6），兩組比較采用非配對(duì)Student t檢驗(yàn)評(píng)估統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。

HHXYT在離體條件下調(diào)節(jié)腸道菌群生長并維持其組成穩(wěn)定性

為進(jìn)一步探究HHXYT如何直接影響腸道菌群，研究對(duì)大鼠盲腸內(nèi)容物進(jìn)行離體培養(yǎng)，以評(píng)估其對(duì)微生物生長和組成的影響。與對(duì)照組相比，10 mg/ml HHXYT在6 h至18 h期間促進(jìn)腸道菌群生長，尤其是在12 h時(shí)最為明顯。然而，10 mg/ml HHXYT在24 h至48 h期間抑制腸道菌群生長，尤其是在36 h時(shí)更明顯。總體而言，10 mg/ml HHXYT對(duì)離體腸道菌群生長表現(xiàn)出先促進(jìn)后抑制的作用。

隨后，研究利用16S rRNA測(cè)序分析兩個(gè)關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)（12 h和36 h）的共培養(yǎng)樣本。在對(duì)照組中，α多樣性和β多樣性隨時(shí)間增加，而HHXYT_12h組與HHXYT_36h組之間這兩項(xiàng)指標(biāo)保持穩(wěn)定，提示HHXYT有助于維持菌群結(jié)構(gòu)連續(xù)性。這種穩(wěn)定化伴隨著微生物組成改變。HHXYT暴露36 h后，與Control_36h組相比，Enterococcaceae、Lactobacillaceae和Streptococcaceae的相對(duì)豐度升高，而Bifidobacteriaceae、Morganellaceae、Veillonellaceae、Bacteroidaceae和Tannerellaceae降低。隨后，屬水平熱圖分析直觀展示了這些分類學(xué)變化。

此外，LEfSe分析在四組之間鑒定出顯著的腸道菌群組成差異，并在不同分類層級(jí)上揭示了28個(gè)具有分類學(xué)差異的特征。對(duì)照組顯著富集Lactobacillus、Bacteroides和Bifidobacterium等屬。相比之下，HHXYT組顯著富集常與腸道菌群失衡相關(guān)的屬，尤其是Enterococcus和Streptococcus。物種差異分析進(jìn)一步驗(yàn)證了上述微生物群落差異。總體而言，這些發(fā)現(xiàn)表明，HHXYT可在離體條件下調(diào)節(jié)腸道菌群的生長和組成，促進(jìn)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，并選擇性富集特定細(xì)菌類群。這種調(diào)節(jié)作用可能有助于其在體內(nèi)恢復(fù)腸道菌群穩(wěn)態(tài)，并部分介導(dǎo)其治療PMS的效應(yīng)。

圖6 HHXYT在離體條件下調(diào)節(jié)腸道菌群生長并穩(wěn)定其組成。（A）HHXYT與腸道菌群體外交互實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)流程圖。（B）不同濃度HHXYT處理后大鼠腸道菌群生長曲線。（C）以Sobs和Shannon指數(shù)表示的α多樣性。組間差異采用單因素方差分析判定（*p<0.05，***p<0.001）。（D）OTU水平PCA分析。（E）科水平腸道菌群變化（群落柱狀圖分析）。（F）屬水平群落熱圖分析。（G）LEfSe分析。分析范圍從門到種水平，LDA>2。柱狀圖顯示各組中LDA得分最高的前10個(gè)特征。（H）物種差異分析（Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)柱狀圖）。數(shù)據(jù)以均值±SEM表示（每組n=3），*p<0.05，***p<0.001。

經(jīng)腸道菌群代謝的HHXYT有助于緩解炎癥、氧化應(yīng)激和激素失衡

為研究腸道菌群對(duì)HHXYT體外藥效的影響，研究采用經(jīng)腸道菌群代謝的HHXYT處理PMS相關(guān)靶細(xì)胞。細(xì)胞分為對(duì)照組、模型組、Bac組和HHXYT_Bac.組。LPS刺激顯著升高模型組炎癥因子Tnfα、Il1β以及催化NO生成的Inos的mRNA表達(dá)水平。有趣的是，經(jīng)腸道菌群代謝的HHXYT顯著降低BV-2細(xì)胞和RAW 264.7細(xì)胞中上述mRNA水平；而在KGN細(xì)胞和大鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中，僅Inos mRNA水平在Bac組與HHXYT_Bac.組之間存在顯著差異。

由于卵巢顆粒細(xì)胞中的氧化應(yīng)激和炎癥會(huì)影響卵巢功能，研究進(jìn)一步采用CTX誘導(dǎo)的KGN細(xì)胞氧化應(yīng)激模型探索HHXYT作用。在模型組中，與對(duì)照組相比，SOD活性和GSH含量顯著降低，而ROS mRNA水平升高。經(jīng)腸道菌群代謝的HHXYT顯著提高KGN細(xì)胞中的GSH水平，并降低ROS mRNA水平。研究還發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，模型組FSH水平較低、LH水平較高，提示該模型中出現(xiàn)激素失衡；HHXYT_Bac.組則顯示這兩種激素呈逆轉(zhuǎn)趨勢(shì)。

為進(jìn)一步闡明觀察到的治療作用所對(duì)應(yīng)的生物活性成分，研究對(duì)腸道菌群與HHXYT共培養(yǎng)所得上清液進(jìn)行化學(xué)成分分析。共鑒定出101種化合物，包括35種三萜、32種黃酮、10種有機(jī)酸、9種單萜、8種酞內(nèi)酯以及其他成分。值得注意的是，雖然竹葉柴胡來源成分在入血原型成分中缺失，但在共培養(yǎng)上清液中檢測(cè)到該藥味來源成分，提示微生物生物轉(zhuǎn)化可能增強(qiáng)其生物利用度。

為識(shí)別腸道菌群產(chǎn)生的具體生物活性代謝物，研究采用Q-TOF-MS/MS分析比較HHXYT在離體共培養(yǎng)前后的化學(xué)譜。通過與標(biāo)準(zhǔn)品匹配保留時(shí)間、MS1以及MS/MS碎片模式，明確鑒定出三種來源于竹葉柴胡的化合物：原柴胡皂苷元A、原柴胡皂苷元F和柴胡皂苷元F。這些柴胡皂苷代謝物由親代柴胡皂苷在腸道微生物酶作用下脫糖基形成。

隨后，研究在LPS刺激下的四種PMS相關(guān)細(xì)胞模型中評(píng)估這三種化合物的抗炎作用。在BV-2細(xì)胞中，10 nM原柴胡皂苷元A、10和100 nM原柴胡皂苷元F以及10和100 nM柴胡皂苷元F均顯著降低LPS誘導(dǎo)的Tnfα mRNA表達(dá)；三種化合物在10和100 nM濃度下均顯著降低Inos表達(dá)。在RAW264.7細(xì)胞中，100 nM原柴胡皂苷元F和10 nM柴胡皂苷元F顯著降低LPS誘導(dǎo)的Inos表達(dá)。在大鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中，100 nM原柴胡皂苷元F顯著降低LPS誘導(dǎo)的Tnfα表達(dá)。在KGN細(xì)胞中，100 nM原柴胡皂苷元F顯著降低LPS誘導(dǎo)的NOS2表達(dá)。在三種代謝物中，原柴胡皂苷元F在多種細(xì)胞類型中表現(xiàn)出最一致的抗炎活性，提示其可能是HHXYT經(jīng)腸道菌群代謝生成的關(guān)鍵生物活性代謝物之一。盡管這些結(jié)果突出了可能負(fù)責(zé)抗炎和激素調(diào)節(jié)作用的候選代謝物，但仍需進(jìn)一步開展靶向定量和藥理學(xué)驗(yàn)證，以確立因果性的結(jié)構(gòu)—活性關(guān)系。

圖7 經(jīng)腸道菌群代謝的HHXYT有助于緩解炎癥、氧化應(yīng)激和激素失衡。（A）HHXYT與腸道菌群相互作用產(chǎn)生的代謝物作用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的流程圖。（B-E）HHXYT與腸道菌群相互作用產(chǎn)生的代謝物對(duì)PMS相關(guān)靶細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)炎癥因子表達(dá)水平的影響（B：BV-2細(xì)胞；C：RAW 264.7細(xì)胞；D：大鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞；E：KGN細(xì)胞）。（F-H）HHXYT與腸道菌群相互作用產(chǎn)生的代謝物對(duì)KGN細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響（F：SOD活性；G：GSH含量；H：ROS相對(duì)表達(dá)水平）。（I-J）HHXYT與腸道菌群相互作用產(chǎn)生的代謝物對(duì)KGN細(xì)胞激素紊亂的影響（I：FSH含量；J：LH含量）。數(shù)據(jù)以均值±SEM表示（每組n=3），多組比較采用單因素方差分析評(píng)估統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001：對(duì)照組與模型組比較；<0.05，#<0.01，##<0.001：HHXYT_Bac.組與Bac.組比較）。

【Citation】:Wei W, Li M, Chen K, et al. Mechanistic study on the holistic actions of Hong-Hua-Xiao-Yao Tablet in alleviating premenstrual syndrome in rats.Phytomedicine. Published online April 5,2026.

【貢獻(xiàn)】★★★★★

本研究表明，HHXYT通過系統(tǒng)性機(jī)制和微生物組介導(dǎo)機(jī)制的整合緩解PMS。入血成分，尤其是甘草來源成分，可直接降低神經(jīng)炎癥。與此同時(shí)，HHXYT可恢復(fù)腸道菌群穩(wěn)態(tài)，從而產(chǎn)生經(jīng)菌群代謝的代謝物，緩解外周炎癥、氧化應(yīng)激和激素失衡。總體而言，這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了宿主—菌群相互作用對(duì)HHXYT整體療效的重要貢獻(xiàn)，并為中藥作用機(jī)制提供了整體性視角。此外，本研究所采用的多組學(xué)方法也為解析中藥復(fù)方復(fù)雜機(jī)制提供了可參考的策略。

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