Engineering (1區(qū)) I 抗癌老藥“跨界”抗MRSA：5-FU靶向嘧啶代謝，顯著增強磷霉素殺菌活性！(劉源團隊—揚州大學(xué))

2026年3月4日，揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院劉源教授團隊（揚州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院教授、副院長，博士生導(dǎo)師，國家優(yōu)秀青年科學(xué)基金獲得者（2022）。主要從事重要病原菌耐藥性調(diào)控機制和干預(yù)控制的基礎(chǔ)及應(yīng)用基礎(chǔ)研究，主持國家自然科學(xué)基金面上項目、國家重點研發(fā)計劃課題、江蘇省重點研發(fā)計劃等科研項目）、江蘇省重要動物疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心、農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全教育部聯(lián)合國際研究實驗室、揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)研究院等團隊，在Engineering發(fā)表題為 “Boosting Fosfomycin Efficacy Against Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Infections by Targeting Pyrimidine Metabolism” 的研究論文。該文于2025年4月24日投稿，2025年12月7日修回，2026年1月5日接收，2026年3月4日在線發(fā)表。論文期刊信息顯示，Engineering 為中國工程院院刊，由中國工程院主管，中國工程院戰(zhàn)略咨詢中心和高等教育出版社主辦，并由 Elsevier 出版；LetPub 顯示該刊 2024–2025 最新影響因子為 11.6，WOS 分區(qū)為 Q1。

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）是全球公共衛(wèi)生領(lǐng)域的重要耐藥病原體。傳統(tǒng)治療高度依賴抗菌藥物，但 MRSA 傳播快、耐藥機制復(fù)雜，并與較高死亡率相關(guān)。論文指出，磷霉素（fosfomycin，F(xiàn)OS）因其獨特作用機制，近年來重新受到關(guān)注；然而，F(xiàn)OS 單藥治療效果有限，如何通過聯(lián)合用藥恢復(fù)或增強其抗菌活性，是當(dāng)前抗耐藥感染研究的重要方向。

本研究發(fā)現(xiàn)，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)的抗腫瘤藥物 5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU） 能夠顯著增強 FOS 對 MRSA 的抗菌作用。體外實驗顯示，5-FU 與 FOS 對多株 MRSA 表現(xiàn)出協(xié)同殺菌活性；在 MRSA T144 菌株中，兩藥聯(lián)合的 FICI 為 0.375，聯(lián)合處理 8 h 后，細菌負荷較單藥或未處理對照顯著下降 3–6 log10。此外，該組合還可減少 MRSA 生物膜形成，并降低成熟生物膜中的細菌負荷。

機制方面，研究團隊通過轉(zhuǎn)錄組測序、耐藥突變株單核苷酸多態(tài)性（SNP）分析、基因敲除和分子對接等實驗，確定 CTP 合成酶 是 5-FU 的關(guān)鍵作用靶點。5-FU 靶向 CTP 合成酶后，可擾動細菌嘧啶代謝；而嘧啶代謝紊亂進一步引發(fā)細菌膜損傷、質(zhì)子動力勢（PMF）耗散、ATP 合成增強以及活性氧（ROS）累積，最終導(dǎo)致細菌死亡。尤其值得注意的是，敲除 pyrG 基因后，5-FU 與 FOS 的協(xié)同作用被消除，說明 CTP 合成酶及其相關(guān)嘧啶代謝通路是兩藥協(xié)同的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

在體內(nèi)驗證方面，研究者進一步采用大蠟螟感染模型和小鼠腹膜炎感染模型評估聯(lián)合治療效果。結(jié)果顯示，5-FU 與 FOS 聯(lián)合治療顯著提高感染宿主的生存率，并降低心、肝、脾、肺、腎等器官中的細菌負荷。研究同時對 40 mg/kg 5-FU 的安全性進行了初步評估，在實驗觀察期內(nèi)未發(fā)現(xiàn)明顯宿主毒性。

總體來看，該研究提出了一種“抗生素 + 非抗生素輔助藥物”的抗 MRSA 思路：利用 5-FU 擾動 MRSA 嘧啶代謝，從代謝層面削弱細菌耐受狀態(tài)，并顯著增強 FOS 的抗菌效果。該發(fā)現(xiàn)不僅拓展了 5-FU 這一經(jīng)典抗腫瘤藥物在抗感染領(lǐng)域的潛在應(yīng)用，也提示靶向細菌代謝通路可能成為恢復(fù)抗生素敏感性的重要策略。需要強調(diào)的是，該研究主要基于體外實驗和動物感染模型，仍不能直接等同于人體臨床療效，后續(xù)還需進一步開展藥代動力學(xué)、安全性和臨床轉(zhuǎn)化研究。

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【摘要】

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）是全球公共衛(wèi)生領(lǐng)域面臨的重要威脅。聯(lián)合治療，尤其是抗生素與非抗生素類藥物的聯(lián)合應(yīng)用，已成為應(yīng)對抗生素耐藥性危機的一種有前景策略。磷霉素（fosfomycin，F(xiàn)OS）目前越來越多地用于耐藥細菌感染治療，但單藥應(yīng)用時療效有限。

本研究發(fā)現(xiàn)，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)的抗腫瘤藥物 5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）能夠有效增強 FOS 對 MRSA 的抗菌活性，包括對生物膜內(nèi) MRSA 細胞的作用。機制上，5-FU 靶向胞苷三磷酸（cytidine triphosphate，CTP）合成酶，該酶是催化尿苷三磷酸（uridine triphosphate，UTP）在三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）依賴條件下轉(zhuǎn)化為 CTP 的限速酶。

進一步研究表明，5-FU 與 FOS 的協(xié)同作用源于對嘧啶代謝的擾動。這種代謝擾動可誘導(dǎo)細菌膜損傷、質(zhì)子動力勢（proton motive force，PMF）耗散、ATP 合成增強以及活性氧（reactive oxygen species，ROS）累積，最終導(dǎo)致細菌死亡。在大蠟螟（Galleria mellonella）和小鼠感染模型中，5-FU 與 FOS 聯(lián)合用藥顯著提高了宿主生存率，并降低了細菌負荷。總體而言，本研究證明了 5-FU 聯(lián)合 FOS 應(yīng)對 MRSA 感染的治療潛力，并強調(diào)了擾動嘧啶代謝在恢復(fù)抗生素敏感性中的關(guān)鍵作用。

01

研究背景及科學(xué)問題

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. aureus）是一種革蘭陽性病原菌，是醫(yī)院獲得性感染和社區(qū)獲得性感染的重要病因之一，可造成嚴(yán)重臨床后果。令人擔(dān)憂的是，該菌已經(jīng)對多類抗生素產(chǎn)生耐藥性。其中，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）是典型代表，其最早于 20 世紀(jì) 60 年代初在臨床中被發(fā)現(xiàn)。MRSA 菌株在全球范圍內(nèi)快速傳播，對公共衛(wèi)生安全構(gòu)成嚴(yán)峻威脅。

目前，MRSA 是導(dǎo)致危及生命甚至致死性感染的重要病原體之一。傳統(tǒng) MRSA 治療高度依賴抗菌藥物，但抗生素的廣泛使用推動了 MRSA 多重耐藥性的形成。臨床 MRSA 感染傳播速度快、耐藥機制復(fù)雜，并與較高死亡率相關(guān)。在歐盟，每年報告的 MRSA 感染接近 15 萬例，導(dǎo)致超過 7000 例死亡。在中國，根據(jù)中國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)（CHINET）的監(jiān)測數(shù)據(jù)，過去五年 MRSA 感染率一直保持在 30% 以上。

盡管新型抗菌藥物研發(fā)投入巨大，但近幾十年獲批的新抗生素數(shù)量有限，因此亟需發(fā)展新的抗感染策略。藥物聯(lián)合應(yīng)用，特別是抗生素與輔助藥物的組合，是一種有前景且成本相對可控的策略，有助于突破新藥發(fā)現(xiàn)停滯局面，并使耐藥細菌重新對抗生素敏感。抗生素與輔助藥物聯(lián)用不僅可以增強抗生素療效，還可能延長現(xiàn)有抗生素的使用壽命，延緩耐藥菌株的出現(xiàn)。此外，協(xié)同治療還可能降低抗生素毒性、縮短治療時間并減少用藥劑量。

在耐藥性日益嚴(yán)峻的背景下，一些老抗生素重新受到關(guān)注，例如多黏菌素和磷霉素（FOS）。FOS 于 40 多年前被發(fā)現(xiàn)，是一種強效殺菌藥物，對革蘭陰性菌和革蘭陽性菌均具有活性，包括多重耐藥菌株。由于其獨特的化學(xué)結(jié)構(gòu)和作用機制，F(xiàn)OS 在 β-內(nèi)酰胺類抗生素作用之前的階段抑制肽聚糖合成，因此與其他抗菌藥物發(fā)生交叉耐藥的可能性較低。基于這些特點，F(xiàn)OS 被認為是治療系統(tǒng)性感染的潛在候選藥物。然而，盡管其臨床應(yīng)用逐漸增加，F(xiàn)OS 在聯(lián)合治療中的使用仍然較少，這一方向值得進一步探索，以充分發(fā)揮其治療潛力。

5-氟尿嘧啶（5-FU）是一種 FDA 批準(zhǔn)的抗腫瘤藥物，主要通過抑制脫氧胸苷酸（deoxythymidine monophosphate，dTMP）合成發(fā)揮作用，而 dTMP 是 DNA 復(fù)制所必需的核苷酸。此外，涂覆 5-FU 的中心靜脈導(dǎo)管被認為是氯己定和磺胺嘧啶銀涂層導(dǎo)管的一種安全有效替代方案，尤其適用于危重患者。既往研究顯示，5-FU 對大腸桿菌（Escherichia coli，E. coli）和豬鏈球菌（Streptococcus suis，S. suis）等病原體具有潛在抗菌作用，并可抑制 E. coli 生物膜形成、降低細菌毒力。還有研究表明，5-FU 能夠逆轉(zhuǎn)耐碳青霉烯革蘭陰性病原菌對美羅培南的耐藥性。然而，5-FU 是否能夠增強 FOS 對 MRSA 的抗菌效力，此前尚未得到探索。

本研究證明，5-FU 可在體外和體內(nèi)有效增強 FOS 對 MRSA 的作用。通過結(jié)合耐藥突變株的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）分析和基因敲除實驗，研究者鑒定出 CTP 合成酶是 5-FU 的關(guān)鍵作用靶點。進一步的轉(zhuǎn)錄組分析揭示了 5-FU 與 FOS 協(xié)同作用的機制：嘧啶代謝擾動是兩者協(xié)同的核心，可引發(fā)細菌膜損傷、PMF 耗散、ATP 合成增強以及氧化損傷增加，最終導(dǎo)致細菌死亡。這些發(fā)現(xiàn)提示，5-FU 與 FOS 聯(lián)合應(yīng)用具有治療 MRSA 相關(guān)感染的潛在價值。

02

重要發(fā)現(xiàn)及亮點

5-FU 顯著增強 FOS 對 MRSA 的抗菌活性

為篩選能夠增強 FOS 對多重耐藥革蘭陽性菌作用的化合物，研究者檢測了 FOS 與 30 種抗生素或非抗生素藥物的協(xié)同活性，測試對象包括糞腸球菌（Enterococcus faecium）A4（VRE，VanA）、金黃色葡萄球菌 G16（RIFR）和 MRSA 1530。棋盤法實驗顯示，F(xiàn)OS 與多種化合物對 MRSA 表現(xiàn)出協(xié)同作用，其中包括利奈唑胺、莫西沙星和 5-FU。值得注意的是，5-FU 與 FOS 對 S. aureus G16 和 MRSA 1530 均表現(xiàn)出較強協(xié)同作用，F(xiàn)ICI 分別為 0.3125 和 0.375，而在 E. faecium A4 中未觀察到協(xié)同作用，提示該效應(yīng)可能具有菌種特異性。進一步在臨床相關(guān) MRSA T144 菌株中驗證，5-FU 也能增強 FOS 活性，F(xiàn)ICI 為 0.375。

時間殺菌曲線顯示，F(xiàn)OS 或 5-FU 單藥對 MRSA T144 生長影響有限；而聯(lián)合處理 8 h 后，與單藥或未處理對照相比，細菌負荷顯著下降 3–6 log10。流式細胞術(shù)檢測也顯示，聯(lián)合處理后細菌存活率降至約 65%，而對照組和 FOS 單藥組約為 98%，5-FU 單藥組約為 80%。這些結(jié)果說明，5-FU 本身抗菌活性有限，但與 FOS 聯(lián)用后可誘導(dǎo)明顯的細菌死亡。

共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）進一步觀察細菌活/死狀態(tài)。與 FOS 單藥相比，聯(lián)合處理組綠色熒光減少、紅色熒光增加，提示細胞死亡增加。掃描電子顯微鏡（SEM）顯示，對照組和單藥組細菌表面規(guī)則完整；而 FOS 與 5-FU 聯(lián)合處理后，細胞出現(xiàn)嚴(yán)重損傷，表面不規(guī)則并塌陷。透射電子顯微鏡（TEM）也證實，對照組和單藥組細胞仍保持較光滑的圓形形態(tài)和完整細胞壁，而聯(lián)合處理組細菌細胞壁和細胞膜完整性受損。

生物膜形成是 MRSA 感染中的重要毒力因素，可保護細菌抵抗抗菌治療。研究者通過 CLSM 和結(jié)晶紫染色評估 FOS（1 μg/mL）、5-FU（16 μg/mL）及兩者聯(lián)合對生物膜的影響。結(jié)果顯示，F(xiàn)OS 與 5-FU 聯(lián)合顯著減少生物膜形成；對于已經(jīng)形成的成熟生物膜，聯(lián)合處理也顯著降低了生物膜內(nèi)細菌負荷。這說明 5-FU 與 FOS 對 MRSA，包括生物膜包埋狀態(tài)下的 MRSA 細胞，具有良好的協(xié)同抗菌活性。

圖1：5-FU 增強 FOS 對 MRSA 的抗菌活性。（a）5-FU 與 FOS 抑制 S. aureus G16 和 MRSA 1530 生長的棋盤法實驗。37 °C 孵育 18 h 后檢測 OD600，并計算 FICI 值。協(xié)同作用：FICI ≤ 0.5；無相互作用：0.5 < FICI ≤ 4；拮抗作用：FICI > 4。實驗進行了兩次獨立重復(fù)。（b）FOS 與 5-FU 對 MRSA T144 的協(xié)同活性，F(xiàn)ICI 為 0.375。（c）5-FU 與 FOS 對 MRSA T144 的時間殺菌曲線。（d）5-FU 與 FOS 單獨或聯(lián)合處理 6 h 后，通過流式細胞術(shù)分析細菌活/死比例。活菌和死菌分別染成綠色和紅色。LL：左下象限；UL：左上象限；LR：右下象限；UR：右上象限。（e）通過流式細胞術(shù)定量細菌存活率。（f）CLSM 分析 5-FU 與 FOS 單獨或聯(lián)合處理后的 MRSA T144；圖中活菌為綠色，死菌為紅色，標(biāo)尺為 5 μm。（g）MRSA T144 經(jīng)單藥或聯(lián)合處理 24 h 后，通過 SEM/TEM 觀察的顯微圖像；SEM 圖像標(biāo)尺為 2 μm，TEM 圖像標(biāo)尺為 1 μm。數(shù)據(jù)以均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。P 值在（c）中通過非配對 t 檢驗確定，在（e）中通過單因素方差分析（ANOVA）確定。FOS（1）：FOS 濃度為 1 μg/mL；5-FU（16）：5-FU 濃度為 16 μg/mL。**P < 0.01，****P < 0.0001。

5-FU 靶向細菌 CTP 合成酶

為探索 5-FU 的作用機制，研究者對是否接受 5-FU 處理的 MRSA 細胞進行了 RNA 測序。京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析顯示，上調(diào)的差異表達基因主要與核糖體、同源重組、錯配修復(fù)、DNA 復(fù)制、RNA 聚合酶和嘧啶代謝相關(guān)；而下調(diào)的差異表達基因則與 S. aureus 感染、陽離子抗菌肽（cationic antimicrobial peptide，CAMP）耐受、雙組分系統(tǒng)、脂肪酸降解、磷壁酸生物合成和硫代謝相關(guān)。這些結(jié)果提示，5-FU 可能通過影響 DNA 合成，尤其是嘧啶代謝相關(guān)通路，發(fā)揮針對 S. aureus 相關(guān)感染的潛在作用。

為進一步尋找 5-FU 的潛在靶點，研究者將 MRSA T144 連續(xù)暴露于亞最低抑菌濃度（sub-MIC）的 5-FU 15 d。結(jié)果顯示，5-FU 的 MIC 從 64 μg/mL 增加到 512 μg/mL，即升高 8 倍。與此同時，長期 5-FU 與 FOS 聯(lián)合處理能夠有效防止細菌對任一藥物產(chǎn)生耐藥。全基因組 SNP 分析發(fā)現(xiàn)多個基因出現(xiàn)突變，包括編碼黏附素的 sdrC、編碼 23S rRNA 甲基轉(zhuǎn)移酶的 erm(C)、編碼纖連蛋白結(jié)合蛋白的 fnbA/B、編碼解離酶/整合酶的 bin，以及多個參與代謝過程的基因。基于這些發(fā)現(xiàn)，研究者重點關(guān)注了 CTP 合成酶，該酶由 pyrG 基因編碼，參與核酸和磷脂生物合成。

為驗證這一靶點，研究者在 S. aureus 中敲除了 pyrG 基因，并檢測 MIC 的變化。與野生型（wild-type，WT）菌株相比，ΔpyrG 菌株對 5-FU 的 MIC 升高 2 倍。在 5-FU 存在條件下監(jiān)測 WT 和 ΔpyrG 的生長曲線也顯示，ΔpyrG 對 5-FU 具有更高耐受性，提示 CTP 合成酶可能是 5-FU 的潛在抗菌靶點。分子對接進一步顯示，5-FU 可通過范德華力、氫鍵以及 Pi–Pi T 型相互作用，與 CTP 合成酶關(guān)鍵氨基酸殘基結(jié)合，例如 GLU510、HIS508、VAL59 和 ARG461。

考慮到 CTP 合成酶在嘧啶代謝中的重要作用，研究者推測 5-FU 可能通過抑制 DNA 合成誘導(dǎo)細菌死亡。靶向代謝組學(xué)分析顯示，經(jīng) 5-FU 處理的 MRSA T144 細胞中，嘧啶代謝通路顯著富集。尤其是 5-FU 處理后胸腺嘧啶水平顯著下降，而外源性補充胸腺嘧啶可降低 5-FU 對 MRSA 的抑制作用。進一步通過補充 CTP 合成酶直接產(chǎn)物胞苷進行“救援實驗”發(fā)現(xiàn)，胞苷補充使 5-FU 的 MIC 升高 2 倍，而 FOS 的 MIC 不變；棋盤法實驗顯示 FICI 從 0.375 升高至 0.5，提示協(xié)同作用減弱。這些結(jié)果表明，抑制 CTP 合成酶是 5-FU 抗菌活性及其增強 FOS 作用的關(guān)鍵因素，但并非唯一因素。

圖2：5-FU 靶向細菌 CTP 合成酶。（a，b）聯(lián)合處理組與對照組比較的 KEGG 通路富集分析。縱坐標(biāo)表示顯著富集通路。（c）MRSA T144 對 5-FU 的耐藥性發(fā)展。（d）CTP 合成酶（pyrG）的 SNP 分析。（e）基因敲除流程示意圖。藍色箭頭表示用于 PCR 驗證編輯效率的引物，紅色箭頭表示用于測序的引物。（f）在 S. aureus RN4220 中通過 pCasSA 介導(dǎo)敲除 pyrG 基因。標(biāo)記為“ck”的泳道為 WT 菌株 PCR 產(chǎn)物，用作對照。（g）突變菌株中 5-FU 的 MIC 變化。（h）在 64 或 128 μg/mL 5-FU 存在條件下，S. aureus RN4220 和 S. aureus RN4220-ΔpyrG 的生長曲線。（i）CTP 合成酶與 5-FU 的分子對接分析，二維圖展示相互作用模式和結(jié)合位點。GLU：谷氨酸；HIS：組氨酸；ARG：精氨酸；PHE：苯丙氨酸；GLY：甘氨酸；PRO：脯氨酸；TYR：酪氨酸；ALA：丙氨酸；VAL：纈氨酸。數(shù)據(jù)以均值 ± SD 表示。P 值在（h、m、n）中通過非配對 t 檢驗確定。***P < 0.001，****P < 0.0001。

5-FU 與 FOS 聯(lián)合擾動嘧啶代謝

為更深入理解 5-FU 與 FOS 的協(xié)同機制，研究者對 PBS、FOS 或 FOS 聯(lián)合 5-FU 處理后的 MRSA 細胞進行了轉(zhuǎn)錄組分析。聯(lián)合處理組與 PBS 組比較共鑒定出 1425 個差異表達基因，其中 730 個上調(diào)、695 個下調(diào)。聚類分析和 KEGG 分析顯示，上調(diào)基因主要富集于核糖體、錯配修復(fù)和嘧啶代謝通路；下調(diào)基因則涉及雙組分系統(tǒng)和 ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白（ATP-binding cassette transporters，ABC transporters）。代表性基因的表達模式也支持這些通路受到影響。

此外，聯(lián)合處理組與 FOS 單藥組比較時，同樣觀察到嘧啶代謝通路上調(diào)。RT-qPCR 分析進一步證實，聯(lián)合處理可增加嘧啶代謝通路相關(guān)基因表達，尤其是 pyrG 和 ndk 基因。這些結(jié)果提示，在聯(lián)合治療后，嘧啶代謝是 MRSA T144 中受到主要影響的通路。

為進一步確認聯(lián)合處理對嘧啶生物合成的影響，研究者檢測了二氫乳清酸脫氫酶（dihydroorotate dehydrogenase，DHODH）的變化。DHODH 是嘧啶合成中的關(guān)鍵酶，可催化二氫乳清酸（dihydroorotate，DHO）轉(zhuǎn)化為乳清酸（orotate，ORO）。檢測結(jié)果顯示，5-FU 與 FOS 聯(lián)合處理顯著降低了細菌中 DHODH 水平，提示該組合擾亂了嘧啶生物合成。

考慮到嘧啶代謝對 DNA 合成和修復(fù)的重要性，研究者進一步檢測了 8-羥基-2′-脫氧鳥苷（8-hydroxy-2′-deoxyguanosine，8-OHdG）含量，以評估細菌 DNA 損傷。結(jié)果顯示，聯(lián)合處理顯著升高細胞內(nèi) 8-OHdG 水平，提示該組合可誘導(dǎo)明顯的細菌 DNA 損傷。這些結(jié)果表明，5-FU 與 FOS 聯(lián)合可擾動 MRSA 嘧啶代謝，并導(dǎo)致 DNA 損傷。

為驗證嘧啶代謝擾動在 5-FU 與 FOS 協(xié)同抗菌中的作用，研究者敲除了 ndk 基因。該基因編碼核苷二磷酸激酶，可促進核苷三磷酸向核苷二磷酸可逆轉(zhuǎn)移 γ-磷酸。隨后，研究者在 ΔpyrG 和 Δndk 兩種突變株中檢測 5-FU 與 FOS 的協(xié)同效應(yīng)。結(jié)果顯示，ndk 缺失輕度削弱了該組合的協(xié)同作用，而 pyrG 缺失則完全消除了兩者的協(xié)同活性，說明 5-FU 對 CTP 合成酶的靶向作用是其增強 FOS 活性的必要條件。

圖3：5-FU 與 FOS 聯(lián)合擾動嘧啶代謝。（a）火山圖顯示差異表達基因（DEGs）的分布。下調(diào)和上調(diào)基因分別以藍色和紅色點表示。NoDiff：無差異。（b）選定 DEGs 的聚類熱圖。（c）KEGG 通路富集分析。縱坐標(biāo)顯示顯著富集通路，表明嘧啶代謝、錯配修復(fù)、雙組分系統(tǒng)和 ABC 轉(zhuǎn)運蛋白相關(guān)通路受到明顯影響。（d）與上述 KEGG 通路相關(guān)的代表性基因表達模式。（e）單藥組和聯(lián)合組中 ndk 與 pyrG 基因的差異表達水平。（f，g）MRSA T144 經(jīng) 5-FU、FOS 或兩者聯(lián)合處理后，（f）DHODH 和（g）8-OHdG 的水平。（h）比較 5-FU 聯(lián)合 FOS 對三種 S. aureus（RN4220、RN4220-ΔpyrG 和 RN4220-Δndk）的協(xié)同作用。數(shù)據(jù)以均值 ± SD 表示。（e–g）中的 P 值通過單因素 ANOVA 確定。***P < 0.001，****P < 0.0001，ns：無統(tǒng)計學(xué)意義。

外源性嘧啶代謝物削弱 5-FU 與 FOS 的協(xié)同作用

鑒于 pyrG 和 ndk 在嘧啶代謝中的關(guān)鍵作用，研究者進一步評估外源性補充嘧啶代謝物，包括胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶，是否會影響 5-FU 與 FOS 在 WT 及其突變株（ΔpyrG 和 Δndk）中的協(xié)同作用。棋盤法實驗顯示，在三種菌株中補充這些代謝物均可降低協(xié)同效應(yīng)。與此一致，時間殺菌實驗表明，嘧啶代謝物補充可削弱甚至消除 5-FU 與 FOS 的協(xié)同殺菌作用。總體來看，這些結(jié)果說明 5-FU 與 FOS 的協(xié)同抗菌活性高度依賴于嘧啶代謝通路的擾動。

圖4：外源性嘧啶代謝物削弱 5-FU 與 FOS 的協(xié)同作用。（a）嘧啶代謝通路示意圖。PRPP：磷酸核糖焦磷酸；UMP：尿苷一磷酸；UDP：尿苷二磷酸；UTP：尿苷三磷酸；dCMP：脫氧胞苷一磷酸；dCDP：脫氧胞苷二磷酸；dCTP：脫氧胞苷三磷酸；dUMP：脫氧尿苷一磷酸；dUDP：脫氧尿苷二磷酸；dUTP：脫氧尿苷三磷酸；dTDP：脫氧胸苷二磷酸；dTTP：脫氧胸苷三磷酸。（b–d）加入胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶后，5-FU 與 FOS 聯(lián)合對（b）S. aureus RN4220、（c）S. aureus RN4220-Δndk 和（d）S. aureus RN4220-ΔpyrG 的協(xié)同抗菌作用，以及對應(yīng) CFU 變化。（e）補充嘧啶代謝物后 5-FU 與 FOS 的時間殺菌曲線。數(shù)據(jù)以均值 ± SD 表示。P 值通過非配對 t 檢驗確定。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001，ns：無統(tǒng)計學(xué)意義。

5-FU 與 FOS 聯(lián)合誘導(dǎo)膜功能障礙和氧化損傷

接下來，研究者進一步探索 5-FU 與 FOS 聯(lián)合最終導(dǎo)致細菌死亡的過程。首先，研究者使用碘化丙啶（propidium iodide，PI）評估 MRSA T144 的膜通透性。PI 是一種紅色熒光染料，通常只能進入死亡或受損細胞。與 FOS 或 5-FU 單藥相比，聯(lián)合處理顯著增強熒光強度，說明膜通透性增加。蛋白泄漏實驗也證實，與單藥或?qū)φ战M相比，聯(lián)合處理造成更明顯的膜損傷。

細菌 PMF 由電子傳遞鏈活動產(chǎn)生，對細菌存活至關(guān)重要。研究者使用 DiSC3(5) 探針評估聯(lián)合處理對 PMF 的影響。該探針會根據(jù) PMF 中的膜電位（ΔΨ）成分在細胞質(zhì)膜中積累；當(dāng) ΔΨ 被破壞時，探針釋放至細胞外環(huán)境，導(dǎo)致熒光增強。結(jié)果顯示，與單藥相比，5-FU 與 FOS 聯(lián)合處理引起更強熒光信號，說明聯(lián)合用藥加劇了 PMF 耗散。同時，研究者使用 BCECF-AM 熒光探針檢測跨膜質(zhì)子梯度（ΔpH），發(fā)現(xiàn)聯(lián)合處理導(dǎo)致 ΔpH 增加，與 ΔΨ 耗散結(jié)果一致，反映出兩者存在互補機制。

轉(zhuǎn)錄組證據(jù)提示，聯(lián)合處理會干擾能量代謝。進一步檢測顯示，聯(lián)合處理降低了 NAD+/NADH 比值，同時升高了 MRSA T144 細胞內(nèi) ATP 水平。PMF 耗散與 ATP 生成增加看似矛盾，因此研究者進一步開展轉(zhuǎn)錄組和 RT-qPCR 分析，發(fā)現(xiàn)氧化磷酸化相關(guān)基因（如 atpA/C/D/F/G）和脂肪酸生物合成基因（accA/B/C）上調(diào)，提示細菌可能通過增強呼吸活性來補償能量和膜完整性損傷。此外，L-乳酸水平升高提示底物水平磷酸化增強，可能作為快速供能的替代途徑。使用糖酵解抑制劑 2-脫氧-D-葡萄糖（2-deoxy-D-glucose，2-DG）后，ATP 水平顯著下降，說明在 5-FU 與 FOS 聯(lián)合處理下，糖酵解成為主要 ATP 生成途徑。

NAD+/NADH 比值失衡可觸發(fā) ROS 產(chǎn)生。研究者使用 DCFH-DA 熒光探針發(fā)現(xiàn)，5-FU 與 FOS 聯(lián)合顯著提高細胞內(nèi) ROS 水平。相反，加入 ROS 清除劑 N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）可劑量依賴性減輕 5-FU 誘導(dǎo)的 ROS 升高，并消除 5-FU 與 FOS 的協(xié)同作用。高濃度 NAC（10 mmol/L）還可使 FOS 和 5-FU 的 MIC 均升高 2 倍，但 NAC 不影響 FOS 與利奈唑胺或莫西沙星的協(xié)同作用。這些結(jié)果提示，ROS 生成對 5-FU 與 FOS 的協(xié)同活性至關(guān)重要。

為進一步探索 CTP 合成酶抑制與 ROS 產(chǎn)生之間的聯(lián)系，研究者檢測了 ΔpyrG 菌株的 ROS 水平。與 WT 菌株相比，pyrG 缺失顯著增加 ROS 生成，說明 5-FU 介導(dǎo)的 CTP 合成酶抑制會加重細菌氧化損傷。相反，加入 NAC 可顯著降低 ΔpyrG 菌株中的 ROS 水平，進一步強調(diào)了嘧啶代謝在調(diào)控 ROS 累積中的作用。整體機制研究表明，5-FU 與 FOS 聯(lián)合可擾亂細菌嘧啶代謝，并進一步引起膜損傷、ATP 合成增加和 ROS 生成，最終導(dǎo)致細菌死亡。

圖5：5-FU 與 FOS 聯(lián)合耗散 PMF 并加劇氧化損傷。（a）5-FU 與 FOS 聯(lián)合處理后，MRSA T144 的膜通透性發(fā)生改變；（b）膜電位也發(fā)生變化。（c）5-FU 與 FOS 聯(lián)合對 MRSA T144 中 ΔpH 的影響。（d）MRSA T144 經(jīng) 5-FU 和 FOS 單獨或聯(lián)合處理后的 NAD+/NADH 比值。（e）MRSA T144 在不同處理條件下的細胞內(nèi) ATP 水平，通過監(jiān)測相應(yīng)發(fā)光信號進行測定。（f）檢測 MRSA T144 細胞內(nèi) ROS 生成。（g，h）通過棋盤法實驗和時間殺菌曲線評估外源性加入 NAC（2.5、5 和 10 mmol/L）對兩者協(xié)同效應(yīng)的影響。數(shù)據(jù)以均值 ± SD 表示。（a–e）中的 P 值通過單因素 ANOVA 確定，（h）中的 P 值通過 t 檢驗確定。*P < 0.05，***P < 0.001，****P < 0.0001，ns：無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖6：5-FU 與 FOS 聯(lián)合抗 MRSA 的協(xié)同機制示意圖。5-FU 與 FOS 聯(lián)合擾動細菌嘧啶代謝，導(dǎo)致膜損傷、PMF 耗散、ATP 和 ROS 產(chǎn)生升高，最終引起細菌死亡。NCS1：神經(jīng)元鈣傳感器 1；GlpT：糖脂轉(zhuǎn)運蛋白；UhpT：糖磷酸轉(zhuǎn)運蛋白。

5-FU 與 FOS 聯(lián)合在體內(nèi)感染模型中顯示抗感染效果

鑒于 5-FU 與 FOS 在體外對 MRSA 表現(xiàn)出明顯協(xié)同作用，研究者進一步在兩種動物感染模型中評估其體內(nèi)效果。在正式感染實驗前，研究者首先評估了 5-FU 的安全性，以確保給藥劑量不會引發(fā)潛在毒性。研究者向大蠟螟和小鼠給予 40 mg/kg 5-FU。在 7 d 觀察期內(nèi)，PBS 對照組和 5-FU 處理組個體均存活。5-FU 處理小鼠體重正常增長。進一步對血清生化指標(biāo)以及肝、腎組織病理切片進行分析，使用蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin，H&E）染色，結(jié)果顯示 PBS 組和 5-FU 組之間無顯著差異，提示 40 mg/kg 5-FU 在真核宿主中未誘導(dǎo)可檢測毒性。這些結(jié)果說明，后續(xù)體內(nèi)感染模型結(jié)果不太可能受到 5-FU 宿主毒性的干擾。

隨后，研究者在大蠟螟和小鼠感染模型中評估 5-FU 與 FOS 聯(lián)合用藥效果。在大蠟螟感染模型中，MRSA T144 感染后 PBS 處理組幼蟲在 48 h 內(nèi)全部死亡；單藥處理組 5 d 后存活率僅為 37.5%。相比之下，聯(lián)合處理組存活率達到 100%（P < 0.0001）。在小鼠腹膜炎感染模型中，F(xiàn)OS 與 5-FU 聯(lián)合組相比單藥組也顯示出生存獲益（P = 0.0071）。對小鼠器官中的細菌負荷進行檢測發(fā)現(xiàn)，與單藥組相比，聯(lián)合處理組心、肝、脾、肺和腎中的 CFU 下降 2–3 log10。這些結(jié)果表明，5-FU 與 FOS 聯(lián)合在 MRSA 相關(guān)感染動物模型中具有體內(nèi)有效性。

圖7：5-FU 與 FOS 聯(lián)合的體內(nèi)效果。（a）大蠟螟和小鼠腹膜炎-膿毒癥感染模型的實驗設(shè)計示意圖。（b，c）感染 MRSA T144 并接受 5-FU 與 FOS 聯(lián)合處理后，（b）大蠟螟幼蟲和（c）小鼠的生存曲線（每組 n = 8）。P 值通過雙側(cè) log-rank（Mantel-Cox）檢驗確定。（d）接受不同治療方案后，MRSA 感染小鼠心、肝、脾、肺和腎中的細菌負荷（每組 n = 6）。數(shù)據(jù)以調(diào)整后的 P 值表示，并通過雙因素 ANOVA 結(jié)合 Sidak 多重比較檢驗確定。**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001。

【貢獻】★★★★★

本研究表明，EgE 可通過激活 IRE1α/XBP1s 信號軸，糾正肝臟糖脂代謝紊亂，從而在 HFD 和 MCD 誘導(dǎo)的 MASLD 小鼠模型中改善疾病表型。其主要成分 MA 是首個經(jīng)驗證能夠結(jié)合 IRE1α h1 口袋的配體。這些發(fā)現(xiàn)強調(diào)了激活 IRE1α/XBP1s 軸在不同病理背景 MASLD 中的治療潛力，也提示藍桉果實提取物有望成為 MASLD 干預(yù)的植物來源候選物。

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