Cell Metab｜瞄準(zhǔn)MASH膜鞘脂代謝新靶點(diǎn)：SMPD3驅(qū)動(dòng)脂質(zhì)攝取與炎癥纖維化，雙功能分子DC17顯示干預(yù)潛力！（謝岑/劉雅萌/柳紅/謝青團(tuán)隊(duì)）

2025年2月26日，中國科學(xué)院上海藥物研究所謝岑、劉雅萌、柳紅團(tuán)隊(duì)，聯(lián)合上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院謝青團(tuán)隊(duì)，并與上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院、臨港實(shí)驗(yàn)室、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院、上海科技大學(xué)、南京中醫(yī)藥大學(xué)、美國國家癌癥研究所等單位合作，在Cell Metabolism（中科院1區(qū)，2024 Impact Factor=30.9）在線發(fā)表題為“Hepatic sphingomyelin phosphodiesterase 3 promotes steatohepatitis by disrupting membrane sphingolipid metabolism”的研究論文。該文于2024年7月15日投稿，2024年12月16日修回，2025年1月17日接收，2025年2月26日在線發(fā)表，并發(fā)表于2025年5月6日刊期。

代謝功能障礙相關(guān)脂肪性肝炎（MASH）是代謝功能障礙相關(guān)脂肪性肝病（MASLD）進(jìn)展中的關(guān)鍵階段，其特征包括肝細(xì)胞脂肪變性、氣球樣變、炎癥和纖維化。目前，如何從單純脂肪變性進(jìn)展到MASH，尤其是哪些脂毒性分子真正驅(qū)動(dòng)炎癥和纖維化，仍是該領(lǐng)域的重要科學(xué)問題。

該研究聚焦肝臟膜鞘脂代謝，發(fā)現(xiàn)鞘磷脂磷酸二酯酶3（SMPD3）介導(dǎo)的細(xì)胞膜鞘磷脂水解，是MASH階段神經(jīng)酰胺積累的重要來源。研究顯示，肝細(xì)胞特異性敲除Smpd3或藥理學(xué)抑制SMPD3均可緩解MASH，而重新表達(dá)SMPD3則會(huì)逆轉(zhuǎn)保護(hù)作用，提示SMPD3并非單純的伴隨性改變，而是推動(dòng)疾病進(jìn)展的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。

機(jī)制上，脂毒性可誘導(dǎo)DNA損傷，激活PARP并消耗NAD+，繼而抑制沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）活性，最終導(dǎo)致SMPD3轉(zhuǎn)錄上調(diào)。升高的SMPD3破壞質(zhì)膜上鞘磷脂-神經(jīng)酰胺平衡，一方面增強(qiáng)小窩依賴性脂質(zhì)攝取，促進(jìn)肝細(xì)胞脂質(zhì)積累；另一方面促進(jìn)脂肪變性肝細(xì)胞釋放攜帶促炎、促纖維化信號(hào)的胞外囊泡，加重巨噬細(xì)胞炎癥極化和肝星狀細(xì)胞活化。

更值得關(guān)注的是，研究者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)雙功能分子DC17，可同時(shí)激活SIRT1并抑制SMPD3。在飲食誘導(dǎo)的MASH模型中，DC17較單一SIRT1激活劑或SMPD3抑制劑顯示出更優(yōu)的干預(yù)效果。該研究不僅提出了“脂毒性-DNA損傷-PARP-SIRT1-SMPD3”這一新的MASH病理軸，也提示靶向肝臟SMPD3、恢復(fù)膜鞘脂代謝穩(wěn)態(tài)，可能成為進(jìn)展期MASH治療的新方向。

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【摘要】

代謝功能障礙相關(guān)脂肪性肝炎（MASH）仍然是重要的健康挑戰(zhàn)。本研究發(fā)現(xiàn)，鞘磷脂磷酸二酯酶3（SMPD3）可通過增強(qiáng)細(xì)胞膜上的鞘磷脂水解，促進(jìn)肝臟神經(jīng)酰胺積累，是推動(dòng)MASH進(jìn)展的關(guān)鍵因素。

在肝細(xì)胞中特異性破壞 Smpd3 基因，或通過藥物抑制 SMPD3，均可緩解MASH；而重新引入 SMPD3 則會(huì)逆轉(zhuǎn)這種改善作用。健康肝臟中 SMPD3 表達(dá)水平較低，但在MASH過程中，脂毒性誘導(dǎo)的DNA損傷會(huì)抑制沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1），進(jìn)而觸發(fā) SMPD3 上調(diào)。SMPD3升高會(huì)破壞膜上鞘磷脂與神經(jīng)酰胺之間的平衡，并通過增強(qiáng)小窩依賴性脂質(zhì)攝取，以及促進(jìn)脂肪變性肝細(xì)胞釋放胞外囊泡，加重炎癥和纖維化，從而推動(dòng)疾病進(jìn)展。

因此，SMPD3可作為整合MASH多個(gè)關(guān)鍵病理特征的中心節(jié)點(diǎn)。值得注意的是，研究者還發(fā)現(xiàn)了一種雙功能小分子，可同時(shí)激活SIRT1并抑制SMPD3，在MASH治療中顯示出較好的潛在應(yīng)用價(jià)值。上述發(fā)現(xiàn)提示，抑制肝臟SMPD3有助于恢復(fù)膜鞘脂代謝平衡，并為開發(fā)新的MASH治療策略提供了重要依據(jù)。

01

研究背景及科學(xué)問題

代謝功能障礙相關(guān)脂肪性肝病（MASLD），既往被稱為非酒精性脂肪性肝病（NAFLD），是導(dǎo)致肝硬化、肝癌和肝移植的重要原因之一，影響全球約四分之一成年人。代謝功能障礙相關(guān)脂肪性肝炎（MASH）的典型病理特征包括脂肪變性、肝細(xì)胞氣球樣變、炎癥和纖維化。MASH是疾病進(jìn)入需要積極干預(yù)階段的重要節(jié)點(diǎn)，但目前有效治療手段仍然有限。

從單純脂肪變性進(jìn)展為MASH的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素之一是脂毒性。脂毒性可引發(fā)細(xì)胞應(yīng)激、肝損傷、炎癥反應(yīng)和纖維生成。然而，究竟哪些脂毒性分子在其中發(fā)揮核心作用，以及這些分子如何觸發(fā)下游病理事件，目前仍未完全明確。

鞘脂在細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和細(xì)胞功能調(diào)控中具有多重作用。肝臟是鞘脂合成的重要部位，因此也更容易受到脂毒性鞘脂的影響。鞘脂代謝失衡與MASLD發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其中神經(jīng)酰胺被認(rèn)為是脂毒性的重要參與者。神經(jīng)酰胺處于鞘脂代謝網(wǎng)絡(luò)的核心，主要通過兩條途徑產(chǎn)生：一是從頭合成，涉及SPTLCs、CERSs和DEGSs等酶；二是鞘磷脂水解。關(guān)于從頭合成途徑在肥胖、糖尿病和MASLD中的作用，已有較多研究。神經(jīng)酰胺形成后還能進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為鞘磷脂，因此理論上MASLD中鞘磷脂也應(yīng)明顯增加。值得注意的是，MASLD患者常表現(xiàn)為神經(jīng)酰胺水平升高，而鞘磷脂變化相對(duì)較小，這提示鞘磷脂水解可能在MASLD進(jìn)展中具有重要但尚未充分研究的作用。

鞘磷脂磷酸二酯酶（SMPDs）可在多種刺激下，切除膜結(jié)合鞘磷脂中的磷酸膽堿基團(tuán)，快速生成神經(jīng)酰胺。根據(jù)最適pH以及在不同細(xì)胞器、細(xì)胞和組織中的分布，SMPDs可分為酸性、中性和堿性家族。對(duì)多個(gè)MASLD數(shù)據(jù)集的分析顯示，SMPD3，也稱中性鞘磷脂酶2（nSMase2），在MASLD肝臟中顯著升高。SMPD3主要定位于質(zhì)膜（PM）內(nèi)側(cè)小葉和高爾基體，并參與細(xì)胞凋亡、應(yīng)激反應(yīng)、炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及胞外囊泡（EV）介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊。由于這些過程與MASLD尤其是MASH的發(fā)生機(jī)制密切相關(guān)，本研究進(jìn)一步探討了SMPD3及鞘磷脂水解途徑在MASLD/MASH進(jìn)展中的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，MASH患者血清神經(jīng)酰胺升高主要來源于SMPD3介導(dǎo)的鞘磷脂水解，而非從頭合成途徑。盡管健康人肝臟中SMPD3表達(dá)很低，但在脂肪變性向MASH進(jìn)展過程中，脂毒性可觸發(fā)SIRT1依賴的SMPD3上調(diào)，尤其是在質(zhì)膜部位。這一變化進(jìn)一步增強(qiáng)小窩依賴性脂質(zhì)攝取，并促進(jìn)促炎、促纖維化胞外囊泡釋放。肝臟Smpd3基因破壞或SMPD3抑制可顯著改善MASH。研究者還發(fā)現(xiàn)了DC17這一可同時(shí)激活SIRT1并抑制SMPD3的雙功能分子，其在MASH模型中顯示出明顯治療潛力。總體而言，本研究揭示了質(zhì)膜鞘磷脂-神經(jīng)酰胺失衡是MASH的特征性代謝改變，并提示SMPD3可能成為有前景的治療靶點(diǎn)。

02

重要發(fā)現(xiàn)及亮點(diǎn)

MASH階段肝臟鞘磷脂水解與SMPD3表達(dá)升高

研究者首先分析了87名受試者的鞘脂譜，包括健康對(duì)照者、經(jīng)肝活檢確認(rèn)的代謝功能障礙相關(guān)單純脂肪變性（MASL）患者和MASH患者。結(jié)果顯示，血清神經(jīng)酰胺和二氫神經(jīng)酰胺在MASL和MASH階段均明顯升高，其中神經(jīng)酰胺在MASH階段進(jìn)一步增加。鞘磷脂也有升高，但其積累程度不及神經(jīng)酰胺。

為了判斷神經(jīng)酰胺積累主要來自從頭合成還是鞘磷脂水解，研究者進(jìn)一步檢測(cè)了神經(jīng)酰胺/二氫神經(jīng)酰胺（Cer/DhCer）比值和神經(jīng)酰胺/鞘磷脂（Cer/SM）比值。結(jié)果顯示，Cer/SM比值隨血清神經(jīng)酰胺水平升高而顯著增加，尤其在MASH階段更明顯；相反，Cer/DhCer比值下降。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)酰胺和Cer/SM比值與疾病嚴(yán)重程度指標(biāo)呈正相關(guān)，包括NAFLD活動(dòng)評(píng)分（NAS）、血清甘油三酯（TG）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、胰島素和穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）。而鞘磷脂本身以及Cer/DhCer比值并未顯示出同樣的相關(guān)性。

在另一個(gè)包含168名受試者的驗(yàn)證隊(duì)列中，研究者也觀察到血清神經(jīng)酰胺和Cer/SM比值在MASLD中升高，并與血清TG、ALT和AST呈正相關(guān)。這些結(jié)果提示，在MASLD進(jìn)展過程中，鞘磷脂水解增強(qiáng)可能是導(dǎo)致神經(jīng)酰胺積累的重要代謝改變。

為了尋找驅(qū)動(dòng)這一變化的具體酶，研究者分析了多個(gè)人類MASLD數(shù)據(jù)集中鞘脂代謝酶的mRNA表達(dá)譜。雖然編碼鞘磷脂酶的多個(gè)基因在MASH進(jìn)展中有所上調(diào)，但SMPD3在MASLD不同階段均呈持續(xù)升高，并與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。相比之下，參與神經(jīng)酰胺從頭合成的酶并未表現(xiàn)出一致變化。MASLD患者肝組織切片進(jìn)一步證實(shí)，健康肝臟中SMPD3蛋白表達(dá)較低，而從健康對(duì)照到MASH階段，SMPD3表達(dá)逐漸升高。

在膽堿缺乏高脂飲食（CD-HFD）誘導(dǎo)的MASH小鼠肝臟中，研究者也觀察到類似趨勢(shì)：Cer/SM比值升高比Cer/DhCer比值變化更明顯，同時(shí)SMPD3表達(dá)上調(diào)，而SPTLC2未發(fā)生明顯變化。在Gubra-amylin MASH飲食（GAN）模型和高脂蛋氨酸/膽堿缺乏飲食（HFMCD）模型中，結(jié)果同樣一致。MASH階段的Cer/SM比值高于MASL階段，且SMPD3上調(diào)與MASLD進(jìn)展同步。值得注意的是，與胞質(zhì)組分相比，質(zhì)膜組分中SMPD3表達(dá)增強(qiáng)更明顯，Cer/SM比值升高也更突出，進(jìn)一步支持MASH過程中肝臟特定膜結(jié)構(gòu)發(fā)生鞘磷脂-神經(jīng)酰胺失衡。

總體來看，雖然神經(jīng)酰胺從頭合成途徑在MASLD不同階段均有活性，但本研究揭示出一個(gè)更具有MASH階段特征的代謝信號(hào)：SMPD3介導(dǎo)的鞘磷脂水解明顯增強(qiáng)，尤其發(fā)生在質(zhì)膜結(jié)構(gòu)中，并將MASLD進(jìn)展與鞘脂代謝紊亂聯(lián)系起來。

圖1：MASH階段肝臟中SMPD3介導(dǎo)的鞘磷脂-神經(jīng)酰胺代謝被激活。（A）臨床隊(duì)列1的分組。（B）血清鞘脂熱圖。（C）血清Cer/DhCer和Cer/SM比值。（D）Cer/DhCer和Cer/SM比值與臨床指標(biāo)之間的相關(guān)性。（E）臨床隊(duì)列2的分組、血清神經(jīng)酰胺、Cer/SM比值，以及神經(jīng)酰胺與臨床指標(biāo)之間的相關(guān)性。（F）GEO數(shù)據(jù)集中SMPD3表達(dá)與臨床指標(biāo)之間的相關(guān)性。（G）肝活檢樣本中SMPD3代表性染色及定量分析；比例尺，50 μm。（H）MASLD小鼠模型示意圖。（I）肝臟SMPD3表達(dá)的免疫印跡結(jié)果，n = 3/組。（J和K）肝臟樣本膜組分（J）和胞質(zhì)組分（K）中SMPD3免疫印跡，以及神經(jīng)酰胺、SM和Cer/SM比值豐度分析，n = 5–10/組。數(shù)據(jù)以均值 ± SEM表示。兩組之間采用非配對(duì)Student’s t檢驗(yàn)；多組之間采用單因素方差分析。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。另見圖S1。

肝細(xì)胞SMPD3缺失緩解MASH，而重新表達(dá)SMPD3會(huì)逆轉(zhuǎn)保護(hù)作用

考慮到肝臟微環(huán)境由肝細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞（NPCs）共同組成，研究者利用MASLD患者單核測(cè)序數(shù)據(jù)分析SMPD3表達(dá)來源。結(jié)果顯示，SMPD3主要表達(dá)于肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞。由于肝細(xì)胞在肝臟中占比高，可能對(duì)肝臟總體SMPD3表達(dá)水平貢獻(xiàn)更大。值得注意的是，隨著MASLD進(jìn)展，肝細(xì)胞中SMPD3表達(dá)逐步升高，而膽管細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定。

基于這一結(jié)果，研究者構(gòu)建了肝細(xì)胞特異性SMPD3敲除小鼠（HKO）。與對(duì)照Smpd3fl/fl（FLOX）小鼠相比，HKO小鼠肝臟和血清中的神經(jīng)酰胺水平及Cer/SM比值明顯下降。在低脂飲食（LFD）條件下，由于SMPD3本身在肝臟中表達(dá)較低，SMPD3缺失并未影響小鼠基礎(chǔ)代謝特征和肝功能，表現(xiàn)為不同基因型小鼠肝重、ALT、AST、肝臟TG、總膽固醇（TC）和羥脯氨酸（HYP，纖維化標(biāo)志物）水平相近。

然而，當(dāng)小鼠接受可誘導(dǎo)MASH的GAN飲食后，HKO小鼠較FLOX對(duì)照小鼠表現(xiàn)出明顯更輕的疾病表型，提示其對(duì)MASH發(fā)生具有抵抗作用。盡管低脂飲食下HKO小鼠非酯化脂肪酸（NEFA）水平高于FLOX小鼠，但這些水平仍遠(yuǎn)低于GAN飲食小鼠；在GAN飲食條件下，不同基因型之間NEFA無明顯差異。考慮到衰老會(huì)增加人群MASH風(fēng)險(xiǎn)，研究者還讓老年小鼠接受GAN飲食，以模擬人類疾病進(jìn)展。結(jié)果顯示，老年HKO小鼠同樣表現(xiàn)出較輕的MASH癥狀，并且肝臟中細(xì)胞衰老標(biāo)志物p16和p21表達(dá)較低。HFMCD飲食模型中也觀察到類似保護(hù)作用，提示SMPD3在MASH中的作用并不局限于肥胖相關(guān)背景。

進(jìn)一步地，研究者通過AAV-Smpd3注射建立肝細(xì)胞特異性Smpd3過表達(dá)模型。出乎意料的是，盡管強(qiáng)制過表達(dá)SMPD3可增加肝臟神經(jīng)酰胺和Cer/SM比值，但并未顯著加重MASH病理。這可能提示在特定質(zhì)膜區(qū)域存在“飽和效應(yīng)”，即SMPD3結(jié)合位點(diǎn)有限。為了支持這一可能性，研究者在HKO小鼠中重新引入SMPD3，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其完全逆轉(zhuǎn)了SMPD3缺失帶來的保護(hù)作用，使MASH嚴(yán)重程度接近FLOX小鼠。即便重新引入SMPD3組的神經(jīng)酰胺和Cer/SM比值高于FLOX組，其疾病嚴(yán)重程度仍與FLOX相當(dāng)。為了判斷SMPD3的水解活性是否必要，研究者又在HKO小鼠中重新引入失活型SMPD3突變體（D428A,K433A）。與野生型SMPD3不同，該突變體明顯削弱了逆轉(zhuǎn)保護(hù)作用的能力。

這些結(jié)果說明，肝細(xì)胞特異性SMPD3缺失可在多個(gè)小鼠模型中改善MASH；而重新表達(dá)SMPD3則通過質(zhì)膜鞘磷脂水解加重疾病進(jìn)展。

為了將小鼠結(jié)果與人類MASH聯(lián)系起來，研究者比較了小鼠模型中的基因表達(dá)模式與人類MASLD嚴(yán)重程度特征基因。該特征基因可反映從健康狀態(tài)、相對(duì)良性階段（MASL和F0-F1）到纖維化/肝硬化階段（F2-F4）的疾病進(jìn)展。層次聚類顯示，GAN飲食和HFMCD飲食下的FLOX小鼠均與人類纖維化樣本（F2-F3）聚類，而GAN飲食下HKO小鼠更接近較輕的人類疾病階段（MASL/F0-F1），HFMCD飲食下HKO小鼠則接近F2階段。這提示SMPD3缺失可使疾病表達(dá)譜向較早階段轉(zhuǎn)變。

圖2：肝臟SMPD3缺失可保護(hù)小鼠免于MASH進(jìn)展，而在敲除小鼠中重新表達(dá)SMPD3會(huì)加重疾病。（A）實(shí)驗(yàn)示意圖，n = 5–7/組。（B）肝臟重量。（C）血清ALT、AST、TG和NEFA。（D）肝臟TG、NEFA、TC和HYP。（E）肝組織切片代表性H&E、油紅O和天狼星紅染色，以及NAS評(píng)分；比例尺，100 μm。（F）實(shí)驗(yàn)示意圖，n = 5–8/組。（G）肝臟Cer/SM比值。（H）肝臟重量。（I）血清ALT、AST、TG和NEFA。（J）肝臟TG、NEFA、TC和HYP。（K）肝組織切片代表性H&E組織學(xué)、油紅O和天狼星紅染色，以及NAS評(píng)分；比例尺，100 μm。（L）實(shí)驗(yàn)示意圖，n = 5–8/組。（M）肝臟Cer/SM比值。（N）血清ALT、AST和TG。（O）肝臟TG、TC和HYP。（P）肝組織切片代表性H&E組織學(xué)、油紅O和天狼星紅染色，以及NAS評(píng)分；比例尺，100 μm。數(shù)據(jù)以均值 ± SEM表示。兩組之間采用非配對(duì)Student’s t檢驗(yàn)；多組之間采用單因素方差分析。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。另見圖S2和圖S3。

SMPD3缺失限制MASH發(fā)展過程中的肝細(xì)胞脂質(zhì)攝取

為了進(jìn)一步解釋肝細(xì)胞特異性SMPD3敲除如何改善MASH，研究者對(duì)GAN和HFMCD兩種模型的肝臟RNA測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行了通路富集分析。基因本體（GO）分析顯示，SMPD3缺失小鼠肝臟中的脂質(zhì)和固醇代謝過程增強(qiáng)，而炎癥和纖維化相關(guān)通路下降。基因集富集分析（GSEA）進(jìn)一步證實(shí)，與FLOX對(duì)照相比，HKO小鼠的脂質(zhì)儲(chǔ)存、炎癥和細(xì)胞外基質(zhì)組織相關(guān)通路降低。

隨后，研究者檢測(cè)SMPD3如何影響細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量。結(jié)果顯示，在基礎(chǔ)條件下，SMPD3敲低或缺失影響較小；但在脂肪酸刺激下，SMPD3缺失可顯著減少脂質(zhì)積累，而SMPD3過表達(dá)則產(chǎn)生相反效果。值得注意的是，在GAN和HFMCD誘導(dǎo)模型中，SMPD3缺失后肝臟從頭脂肪生成（DNL）通路并未發(fā)生明顯改變。這與既往觀察一致，即MASLD中肝臟TG僅約26%來源于DNL，大部分來自脂肪動(dòng)員和飲食來源。

為探索其他途徑，研究者進(jìn)一步測(cè)定了脂質(zhì)攝取、DNL和脂肪酸氧化。結(jié)果顯示，SMPD3缺失的原代肝細(xì)胞脂質(zhì)攝取明顯降低，而DNL和脂肪酸氧化不受影響。Huh-7細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也得到一致結(jié)果：SMPD3敲低抑制脂質(zhì)攝取速率，SMPD3過表達(dá)則增強(qiáng)脂質(zhì)攝取。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，HKO小鼠肝臟對(duì)脂肪示蹤劑C12-BODIPY的攝取減少；重新引入野生型SMPD3可逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象，而引入水解失活型SMPD3D428A,K433A突變體則不能逆轉(zhuǎn)。重要的是，各組血清C12-BODIPY水平并未受到影響，提示肝臟脂質(zhì)攝取下降并不會(huì)改變系統(tǒng)性脂質(zhì)分布。此外，補(bǔ)充神經(jīng)酰胺可恢復(fù)HKO小鼠原代肝細(xì)胞和肝臟中的脂質(zhì)攝取。上述結(jié)果表明，SMPD3通過增強(qiáng)脂質(zhì)攝取促進(jìn)脂質(zhì)積累。

SMPD3通過改變質(zhì)膜鞘磷脂/神經(jīng)酰胺平衡調(diào)控小窩內(nèi)吞

SMPD3是一種定位于質(zhì)膜的酶，可在細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)下將鞘磷脂水解為神經(jīng)酰胺。與此一致，研究者觀察到，與胞質(zhì)組分相比，SMPD3在膜組分中特異性富集。Smpd3敲除肝臟RNA測(cè)序和原代肝細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，SMPD3破壞主要影響質(zhì)膜相關(guān)蛋白和結(jié)構(gòu)區(qū)域，例如微結(jié)構(gòu)域、細(xì)胞囊泡和內(nèi)體。

為了明確SMPD3在質(zhì)膜上的功能，研究者對(duì)SMPD3共免疫沉淀產(chǎn)物進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其與膜蛋白復(fù)合體和膜筏存在相互作用，尤其是在肝細(xì)胞中與小窩結(jié)構(gòu)蛋白caveolin-1（CAV1）和caveolin-2（CAV2）相互作用。免疫熒光染色進(jìn)一步證實(shí)，棕櫚酸（PA）誘導(dǎo)的脂毒性可增強(qiáng)SMPD3表達(dá)，并促進(jìn)SMPD3與質(zhì)膜小窩共定位。在過表達(dá)帶標(biāo)簽SMPD3、CAV1和CAV2的HEK 293T細(xì)胞中，研究者進(jìn)一步驗(yàn)證了這些相互作用。類似相互作用也存在于MASH肝臟樣本中。

小窩是質(zhì)膜上富含膽固醇和鞘脂的小型內(nèi)陷結(jié)構(gòu)，參與小窩介導(dǎo)的內(nèi)吞和脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。透射電鏡（TEM）和RAB5A染色顯示，脂質(zhì)負(fù)荷可顯著增加小窩和內(nèi)吞囊泡數(shù)量，而SMPD3敲低可減少這一變化。這提示SMPD3可能通過調(diào)控小窩介導(dǎo)的內(nèi)吞，進(jìn)而影響肝細(xì)胞脂質(zhì)攝取。

為了驗(yàn)證這一假設(shè)，研究者進(jìn)行了脂肪酸攝取實(shí)驗(yàn)。首先，使用dynasore抑制內(nèi)吞后，SMPD3缺失肝細(xì)胞中脂質(zhì)攝取下降的現(xiàn)象被消除，支持其機(jī)制依賴內(nèi)吞過程。其次，通過過表達(dá)CAV1、CAV2或二者同時(shí)過表達(dá)來增加小窩數(shù)量，可顯著增強(qiáng)脂質(zhì)攝取；但這一作用可被SMPD3敲低或SMPD3抑制劑DPTIP完全消除。相反，SMPD3過表達(dá)促進(jìn)脂質(zhì)攝取，而敲低CAV1或CAV2則抑制這一作用。這些結(jié)果表明，SMPD3在小窩依賴性脂質(zhì)攝取中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

研究者隨后進(jìn)一步探討SMPD3的質(zhì)膜定位和酶活性是否為該過程所必需。截短SMPD3的N端膜錨定結(jié)構(gòu)域會(huì)破壞其與CAV1和CAV2的相互作用，削弱鞘磷脂水解，并減少脂質(zhì)攝取。此外，人源SMPD3催化位點(diǎn)突變（K435A）雖然保留了與CAVs的相互作用，但阻礙了有效脂質(zhì)攝取。以上結(jié)果提示，SMPD3的酶活性和質(zhì)膜定位對(duì)于調(diào)控小窩依賴性脂質(zhì)攝取都是必要的。通過改變小窩中的鞘磷脂-神經(jīng)酰胺平衡，SMPD3促進(jìn)內(nèi)吞囊泡從質(zhì)膜彎曲并脫離，從而推動(dòng)脂質(zhì)攝取。

圖3：SMPD3通過改變肝細(xì)胞質(zhì)膜原位脂質(zhì)組成，調(diào)控小窩內(nèi)吞并促進(jìn)脂質(zhì)攝取。（A和I）實(shí)驗(yàn)示意圖。（B）C12-BODIPY攝取；比例尺，10 μm。（C）[1-14C]-PA攝取速率，n = 4/組。（D）原代肝細(xì)胞DNL和脂肪酸氧化速率，n = 4/組。（E–G）SMPD3敲低（E）或過表達(dá)（F）后Huh-7細(xì)胞攝取C12-BODIPY的熒光強(qiáng)度，n = 4/組；以及MASH小鼠血清和肝臟中C12-BODIPY攝取的熒光強(qiáng)度（G），n = 3/組。（H）從MASH小鼠分離的肝細(xì)胞膜組分和胞質(zhì)組分中SMPD3的代表性免疫印跡，n = 3/組。（J和K）在6×His-SMPD3組相對(duì)于載體組中，強(qiáng)度位于前50%且倍數(shù)變化（FC）≥ 2的蛋白，其最顯著富集的GO細(xì)胞組分（GO-CC）通路（J）及蛋白（K）。（L）Huh-7細(xì)胞質(zhì)膜上SMPD3與小窩的共定位，小窩以CAV1標(biāo)記；比例尺，10 μm。（M）肝臟裂解液中SMPD3共免疫沉淀（coIP）實(shí)驗(yàn)。（N）Huh-7細(xì)胞頂端膜小窩的透射電鏡（TEM）圖像；比例尺，0.5 μm，n = 3–5/組。（O）Huh-7細(xì)胞中RAB5A早期內(nèi)體標(biāo)志物的免疫熒光染色；比例尺，10 μm。（P）經(jīng)或未經(jīng)dynasore處理的原代肝細(xì)胞攝取C12-BODIPY的熒光強(qiáng)度，n = 3/組。（Q）在轉(zhuǎn)染載體或SMPD3質(zhì)粒并伴隨CAV1或CAV2敲低的Huh-7細(xì)胞中，C12-BODIPY攝取情況；比例尺，10 μm。（R）SMPD3截短和突變示意圖。（S和T）表達(dá)全長、截短型或突變型SMPD3的Huh-7細(xì)胞中C12-BODIPY攝取情況；比例尺，10 μm。（U）機(jī)制示意總結(jié)。數(shù)據(jù)以均值 ± SEM表示。兩組之間采用非配對(duì)Student’s t檢驗(yàn)；多組之間采用單因素方差分析。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。另見圖S4。

SMPD3通過調(diào)控胞外囊泡釋放促進(jìn)肝纖維化和炎癥

脂毒性是MASL進(jìn)展為MASH的重要標(biāo)志，可觸發(fā)肝內(nèi)炎癥和纖維化。在代謝應(yīng)激下，脂肪變性肝細(xì)胞會(huì)釋放具有病理作用的胞外囊泡（EVs），并通過這些囊泡與非實(shí)質(zhì)細(xì)胞溝通，包括巨噬細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞（HSCs），進(jìn)而啟動(dòng)炎癥和纖維化反應(yīng)。SMPD3可生成錐形脂質(zhì)神經(jīng)酰胺，促進(jìn)膜出芽和腔內(nèi)囊泡形成，因此對(duì)EV生物發(fā)生非常關(guān)鍵。與這一功能一致，RNA測(cè)序數(shù)據(jù)顯示，SMPD3缺失可抑制肝臟炎癥和纖維化。

細(xì)胞類型解卷積分析進(jìn)一步顯示，HKO可顯著減少M(fèi)ASH肝臟中的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞。為了檢測(cè)SMPD3缺失是否影響MASH過程中的EV產(chǎn)生，研究者從GAN飲食小鼠肝臟中分離EV。結(jié)果顯示，與FLOX對(duì)照相比，HKO小鼠肝源性EV產(chǎn)生顯著減少，無論是小EV群體（<200 nm）還是中/大EV群體（>200 nm）均下降。HKO小鼠來源EV中，EV標(biāo)志物CD63和肝細(xì)胞標(biāo)志物白蛋白水平降低，進(jìn)一步證實(shí)肝源性EV減少。脂質(zhì)刺激Huh-7細(xì)胞后的TEM結(jié)果也支持這一觀察，即SMPD3敲低可減少EV產(chǎn)生。

為了明確SMPD3如何影響肝細(xì)胞與非實(shí)質(zhì)細(xì)胞之間的通訊，研究者首先用PA刺激FLOX或HKO肝細(xì)胞，并收集條件培養(yǎng)基（CM），再處理小鼠原代HSC和骨髓來源巨噬細(xì)胞（BMDMs）。與FLOX-CM相比，HKO-CM削弱了HSC活化，表現(xiàn)為Acta2 mRNA表達(dá)下降。Acta2編碼HSC活化標(biāo)志物α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）。同時(shí)，HKO-CM促使巨噬細(xì)胞向抗炎M2表型偏移。流式細(xì)胞術(shù)也顯示，HKO-CM降低M1/M2巨噬細(xì)胞比例，提示促炎巨噬細(xì)胞減少而抗炎巨噬細(xì)胞增加。

體內(nèi)結(jié)果與體外實(shí)驗(yàn)一致。GAN飲食HKO小鼠肝臟中α-SMA陽性HSC減少，CD80陽性M1巨噬細(xì)胞減少，CD206陽性M2巨噬細(xì)胞增多。重新引入SMPD3可逆轉(zhuǎn)這些變化，提示肝細(xì)胞中的SMPD3在影響肝臟微環(huán)境中巨噬細(xì)胞極化和HSC活化方面具有重要作用。

為了判斷這些效應(yīng)是否由肝細(xì)胞分泌的EV介導(dǎo)，研究者分別分離肝源性和肝細(xì)胞來源EV，并直接刺激BMDMs和JS-1細(xì)胞（一種小鼠HSC細(xì)胞系）。結(jié)果與條件培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)一致：與FLOX-EVs相比，來自肝細(xì)胞培養(yǎng)物或肝臟的HKO-EVs均可明顯降低JS-1細(xì)胞中纖維化相關(guān)基因及α-SMA蛋白表達(dá)，并抑制BMDMs中的M1/M2巨噬細(xì)胞極化。去除EV的條件培養(yǎng)基不能影響巨噬細(xì)胞極化或HSC活化，進(jìn)一步確認(rèn)這些作用由EV介導(dǎo)。重要的是，使用Proteinase K（PK）消化FLOX-EVs中的蛋白成分后，其促炎和促纖維化作用消失，同時(shí)FLOX來源EV與HKO來源EV之間的差異也被消除。這提示SMPD3通過肝細(xì)胞來源EV中的蛋白貨物促進(jìn)肝纖維化和炎癥。

進(jìn)一步分析脂肪變性肝細(xì)胞相關(guān)分泌組基因后，研究者發(fā)現(xiàn)Smpd3敲除后有12個(gè)分泌因子下調(diào)。其中，編碼骨形態(tài)發(fā)生蛋白8B（BMP8B）的基因下降最顯著。值得注意的是，HKO小鼠肝細(xì)胞來源EV和肝源性EV中的BMP8B水平也明顯降低。BMP8B屬于轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）超家族，既往研究提示其可通過BMP-TGF-β通路使HSC轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞，從而加重MASH進(jìn)展。重要的是，在TGF-β超家族成員中，BMP8B是唯一一個(gè)由脂毒性誘導(dǎo)，并在HKO小鼠肝細(xì)胞或肝臟中持續(xù)降低的成員。總體而言，這些結(jié)果表明，脂肪變性肝細(xì)胞中SMPD3上調(diào)，可通過EV攜帶包括BMP8B在內(nèi)的促炎、促纖維化貨物，促進(jìn)其與鄰近細(xì)胞通訊，從而加重MASH微環(huán)境改變。

圖4：肝細(xì)胞中SMPD3缺失削弱EV介導(dǎo)的纖維化和炎癥。（A）從MASH肝臟分離的EV蛋白濃度，n = 6–8/組。（B）從FLOX和HKO小鼠血清中分離EV后，檢測(cè)CD63、calnexin和白蛋白的免疫印跡。（C）SMPD3敲低后Huh-7細(xì)胞分泌EV的透射電鏡圖像。（D、H和L）實(shí)驗(yàn)示意圖。（E和F）纖維化相關(guān)基因（E）和炎癥相關(guān)基因（F），n = 3–4/組；通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BMDMs中M1/M2巨噬細(xì)胞極化比例，n = 3/組。（G）肝組織切片中α-SMA、CD80和CD206的代表性染色；α-SMA比例尺，100 μm；CD80和CD206比例尺，40 μm。（I、J、M和N）JS-1細(xì)胞中纖維化相關(guān)基因表達(dá)及α-SMA免疫印跡。（K和O）BMDMs培養(yǎng)基中的細(xì)胞因子水平。（P–R）原代肝細(xì)胞（Q）或MASH肝臟（R）中與肝臟分泌因子相關(guān)差異表達(dá)基因的韋恩圖（P）和熱圖。（S）肝細(xì)胞來源EV和肝源性EV中BMP8B貨物裝載的免疫印跡。（T）機(jī)制示意總結(jié)。數(shù)據(jù)以均值 ± SEM表示。采用非配對(duì)Student’s t檢驗(yàn)。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。另見圖S5。

藥理學(xué)抑制SMPD3改善飲食誘導(dǎo)的MASH

在遺傳學(xué)證據(jù)的基礎(chǔ)上，研究者進(jìn)一步評(píng)估了藥理學(xué)靶向SMPD3的治療潛力。DPTIP是一種可口服的SMPD3抑制劑，已顯示可劑量依賴性阻斷細(xì)胞EV釋放。當(dāng)DPTIP用于已經(jīng)建立MASH的小鼠時(shí)，可顯著抑制肝臟SMPD3活性，表現(xiàn)為Cer/SM比值和EV釋放下降。DPTIP干預(yù)后，小鼠MASH病理得到明顯改善。組織學(xué)分析進(jìn)一步證實(shí)了其作用，包括NAS評(píng)分下降、M1/M2巨噬細(xì)胞極化降低，以及肝纖維化明顯緩解。

為了評(píng)估DPTIP處理結(jié)果與人類MASH嚴(yán)重程度之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，研究者將DPTIP處理小鼠的基因表達(dá)譜與人類MASH數(shù)據(jù)集進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，DPTIP可顯著改善小鼠MASH嚴(yán)重程度，使其表達(dá)譜從較進(jìn)展階段（F2-F3）轉(zhuǎn)向較早的纖維化前階段（F0-F1），甚至接近MASL。通路分析顯示，DPTIP下調(diào)炎癥和纖維化相關(guān)通路，同時(shí)影響與膜筏和微結(jié)構(gòu)域相關(guān)的細(xì)胞功能。此外，DPTIP還降低了參與MASH進(jìn)展的多類非實(shí)質(zhì)細(xì)胞豐度，包括巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞。總體來看，這些結(jié)果支持SMPD3作為MASH治療潛在靶點(diǎn)。

圖5：DPTIP藥理學(xué)抑制SMPD3可改善MASH。（A）實(shí)驗(yàn)示意圖，n = 5–10/組。（B）肝臟中神經(jīng)酰胺、SM和Cer/SM比值。（C）DPTIP處理小鼠肝臟分離EV的相對(duì)數(shù)量，n = 4/組。（D）肝臟重量。（E）血清ALT和AST。（F）肝臟TG、TC和HYP。（G）肝組織切片代表性H&E、油紅O、天狼星紅、α-SMA、CD80和CD206染色，以及NAS評(píng)分；α-SMA比例尺，100 μm；CD80和CD206比例尺，20 μm。（H）基于20個(gè)人類MASH嚴(yán)重程度同源特征基因表達(dá)，通過PCA和聚類分析展示患者M(jìn)ASLD進(jìn)展以及DPTIP處理MASH小鼠的疾病狀態(tài)；所有聚類均采用歐氏距離。（I和J）小鼠肝臟GO生物過程（GO-BP）和GO細(xì)胞組分（GO-CC）富集分析。（K）肝臟NPCs的ssGSEA評(píng)分。數(shù)據(jù)以均值 ± SEM表示。兩組之間采用非配對(duì)Student’s t檢驗(yàn)；多組之間采用單因素方差分析。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。

脂毒性誘導(dǎo)的DNA損傷通過抑制SIRT1上調(diào)SMPD3

鑒于SMPD3缺失可改善MASH，研究者進(jìn)一步追問：在疾病進(jìn)展過程中，是什么因素驅(qū)動(dòng)SMPD3上調(diào)？為模擬MASH相關(guān)應(yīng)激，研究者使用多種與MASH病理相關(guān)的葡萄糖、脂質(zhì)和應(yīng)激刺激處理肝細(xì)胞。結(jié)果顯示，脂毒性棕櫚酸（PA）和DNA損傷誘導(dǎo)劑阿霉素（Dox）最明顯地增加細(xì)胞死亡，并誘導(dǎo)SMPD3 mRNA和蛋白水平升高。公共GEO數(shù)據(jù)集的GSEA結(jié)果顯示，人類MASLD肝臟中DNA損傷和修復(fù)相關(guān)通路富集，提示DNA損傷可能參與MASH進(jìn)展。

以磷酸化γH2A.X（p-γH2A.X）增強(qiáng)作為DNA損傷標(biāo)志，研究者發(fā)現(xiàn)PA和Dox處理均可在肝細(xì)胞中觸發(fā)鞘磷脂水解，這可能與SMPD3表達(dá)升高有關(guān)。其他DNA損傷誘導(dǎo)劑，包括phenazine（Phen）、順鉑（Cis）和博來霉素（Bleo），同樣可升高SMPD3 mRNA表達(dá)。在肝細(xì)胞和MASH小鼠肝臟樣本中，DNA損傷與質(zhì)膜結(jié)合型SMPD3上調(diào)之間的關(guān)聯(lián)也得到確認(rèn)，提示脂毒性相關(guān)DNA損傷可能是MASH中SMPD3轉(zhuǎn)錄激活的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素。

DNA損傷會(huì)激活多聚ADP核糖聚合酶1（PARP1），該酶是重要DNA修復(fù)酶，但會(huì)快速消耗NAD+。與此一致，PA和Dox處理可提高肝細(xì)胞PARP活性，并顯著降低NAD+水平。PARP抑制劑可逆轉(zhuǎn)這些效應(yīng)，并降低SMPD3表達(dá)。由于PARP1和SIRTs共同依賴NAD+作為輔因子，并在細(xì)胞應(yīng)激下調(diào)節(jié)生存與死亡通路，研究者提出假設(shè)：PARP誘導(dǎo)的NAD+消耗可能抑制SIRT活性。

通過熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)，研究者發(fā)現(xiàn)SIRT1是SMPD3轉(zhuǎn)錄的重要抑制因子。使用SIRT1激動(dòng)劑SRT可下調(diào)SMPD3表達(dá)，而使用SIRT1抑制劑煙酰胺（NAM）則促進(jìn)SMPD3表達(dá)。與此一致，PA和Dox處理可降低肝細(xì)胞NAD+水平和SIRT1活性，這與MASL和MASH小鼠中的觀察相吻合；其中，SIRT1抑制特異性出現(xiàn)在MASH階段。MASH肝臟樣本中H3K9和H4K16乙酰化增加，也支持SIRT1活性下降。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)顯示，過表達(dá)野生型SIRT1可抑制SMPD3表達(dá)，而失活突變體H363Y無此作用。染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)證實(shí)，SIRT1可降低SMPD3啟動(dòng)子上H3K9Ac和H4K16Ac富集，提示其具有直接轉(zhuǎn)錄抑制作用。在體內(nèi)，抑制SIRT1會(huì)加重肝損傷并上調(diào)SMPD3，而激活SIRT1則可逆轉(zhuǎn)這些效應(yīng)。

這些發(fā)現(xiàn)共同揭示了一條新的病理級(jí)聯(lián)反應(yīng)：脂毒性誘導(dǎo)DNA損傷，激活PARP，消耗NAD+，繼而抑制SIRT1活性，最終導(dǎo)致SMPD3上調(diào)并促進(jìn)MASH進(jìn)展。

圖6：脂毒性誘導(dǎo)的DNA損傷通過抑制SIRT1導(dǎo)致SMPD3轉(zhuǎn)錄上調(diào)。（A–C）原代肝細(xì)胞中SMPD3和p-γH2A.X的免疫印跡。（D）原代肝細(xì)胞中神經(jīng)酰胺和Cer/SM比值，n = 3/組。（E）Huh-7細(xì)胞膜組分和胞質(zhì)組分中SMPD3的免疫印跡。（F）小鼠肝臟中SMPD3和p-γH2A.X的免疫印跡，n = 4/組。（G–J）在PA和Dox刺激并聯(lián)合PARP抑制劑AIQ和PJ34處理的Huh-7細(xì)胞中，檢測(cè)SMPD3 mRNA、細(xì)胞NAD+以及PAR和SMPD3表達(dá)，n = 3/組。（K）不同SIRTs對(duì)HEK 293T細(xì)胞中SMPD3啟動(dòng)子活性的影響，n = 4/組。（L）SRT1720和NAM對(duì)Huh-7細(xì)胞、原代肝細(xì)胞和L02細(xì)胞中SMPD3轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，n = 3/組。（M和N）Huh-7細(xì)胞中的NAD+水平和SIRT1活性（M，n = 4/組），以及MASH小鼠肝臟中的NAD+水平和SIRT1活性（N，n = 6–7/組）。（O）小鼠肝臟中SIRT1、SMPD3、H4K16Ac和H3K9Ac的免疫印跡，n = 3/組。（P和Q）L02細(xì)胞中SIRT1活性和SMPD3 mRNA表達(dá)，n = 3/組，以及SIRT1和SMPD3的免疫印跡。（R）Huh-7細(xì)胞中SMPD3啟動(dòng)子區(qū)域H3K9Ac和H4K16Ac富集的ChIP-qPCR分析，n = 3/組。（S）機(jī)制示意總結(jié)。數(shù)據(jù)以均值 ± SEM表示。兩組之間采用非配對(duì)Student’s t檢驗(yàn)；多組之間采用單因素方差分析。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。另見圖S6和圖S7。

靶向SIRT1-SMPD3軸的雙功能分子DC17緩解MASH

SIRT1缺失與MASH密切相關(guān)，而激活SIRT1可緩解疾病。由于SIRT1活性下降是MASH中SMPD3上調(diào)的重要驅(qū)動(dòng)因素，研究者提出，若能設(shè)計(jì)一種同時(shí)靶向SIRT1-SMPD3軸的雙功能分子，充分阻斷SMPD3的致病作用，可能成為MASH治療的新策略。

DPTIP和SIRT1激活劑20b具有相似的結(jié)構(gòu)框架，均由疏水尾部、連接臂和極性頭部三個(gè)關(guān)鍵部分組成。分子對(duì)接分析顯示，疏水尾部可有效占據(jù)P1口袋，含氮連接臂形成氫鍵，而極性頭部深入富含極性氨基酸的P2口袋。基于這些相似性，研究者設(shè)計(jì)了一系列預(yù)計(jì)可同時(shí)激活SIRT1并抑制SMPD3的化合物。對(duì)DC系列化合物進(jìn)行SMPD3抑制活性篩選后，DC17被確定為最強(qiáng)抑制劑。與20b和DPTIP的結(jié)合模式一致，DC17可充分占據(jù)極性P1口袋和疏水P2口袋，并通過連接臂形成氫鍵。值得注意的是，DC17對(duì)SMPD3的抑制效力強(qiáng)于陽性對(duì)照GW4869，同時(shí)也能顯著激活SIRT1。

為了評(píng)估DC17對(duì)MASH的治療效果，并判斷其獲益來源于雙功能特性，還是主要來自SIRT1激動(dòng)或SMPD3抑制中的某一方面，研究者在已建立的MASH模型中比較了DC17、20b和DPTIP。20b和DC17均可降低肝臟SMPD3表達(dá)，但DC17還能進(jìn)一步抑制殘余SMPD3酶活性。因此，在改善MASH關(guān)鍵表型方面，DC17優(yōu)于20b和DPTIP。這些結(jié)果說明，同時(shí)靶向兩個(gè)通路具有協(xié)同獲益。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證DC17是否通過SIRT1-SMPD3軸發(fā)揮作用，研究者在SMPD3 FLOX和HKO小鼠中檢測(cè)DC17效應(yīng)。在DC17處理的HKO小鼠中，MASH表型相較于載體處理HKO小鼠并未進(jìn)一步改善，提示SMPD3活性對(duì)于DC17治療MASH的作用是不可或缺的。值得注意的是，在該實(shí)驗(yàn)中，小鼠接受GAN飲食34周以建立進(jìn)展期MASH后才開始DC17治療。DC17顯示出較強(qiáng)療效，并有效逆轉(zhuǎn)了MASH相關(guān)病理改變，進(jìn)一步支持SIRT1-SMPD3軸是晚期MASH潛在治療靶點(diǎn)。

圖7：靶向SIRT1-SMPD3軸的雙功能分子DC17可緩解MASH。（A）雙功能DC系列化合物的設(shè)計(jì)策略。（B）以GW4869作為陽性對(duì)照，檢測(cè)所選分子對(duì)SMPD3的抑制作用，n = 3–4/組。（C）DC17與SMPD3（PDB: 5UVG）和SIRT1（PDB: 4I5I）的預(yù)測(cè)結(jié)合模式。（D）DC17對(duì)SMPD3的抑制作用，并以GW4869作為陽性對(duì)照，n = 3/組；DC17對(duì)SIRT1的激活活性，以SRT501和20b作為陽性對(duì)照，以DPTIP作為陰性對(duì)照，n = 3/組。（E）實(shí)驗(yàn)示意圖，n = 7/組。（F）肝臟SMPD3、H4K16Ac和H3K9Ac的免疫印跡。（G）肝臟中神經(jīng)酰胺、SM和Cer/SM比值。（H）血清ALT和TG。（I）肝臟TG、TC和HYP。（J和K）肝組織切片代表性H&E、油紅O、天狼星紅，以及α-SMA、CD80和CD206染色，并進(jìn)行NAS評(píng)分；α-SMA比例尺，100 μm；CD80和CD206比例尺，25 μm。數(shù)據(jù)以均值 ± SEM表示。采用非配對(duì)Student’s t檢驗(yàn)。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。另見圖S7。

【貢獻(xiàn)】★★★★★

目前針對(duì)MASH的治療，尤其是以降低總體脂肪積累為目標(biāo)的策略，在阻止MASL向MASH進(jìn)展方面效果仍有限。本研究確定SMPD3是連接脂毒性與MASH的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，它整合了脂毒性、炎癥和纖維化等重要疾病特征。通過介導(dǎo)質(zhì)膜鞘磷脂水解，SMPD3促進(jìn)脂質(zhì)攝取和胞外囊泡釋放，從而驅(qū)動(dòng)MASH進(jìn)展。

抑制SMPD3，尤其是通過DC17這類雙靶向化合物進(jìn)行干預(yù)，為進(jìn)展期MASH提供了一種有前景的治療思路，也回應(yīng)了當(dāng)前臨床中尚未滿足的重要需求。未來，進(jìn)一步開發(fā)同工型特異性、肝臟靶向、代謝穩(wěn)定性更好的SMPD3抑制劑，或探索多靶點(diǎn)干預(yù)藥物，將有助于推動(dòng)有效MASH治療策略的發(fā)展。

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