如何檢測CAR-T、CAR-NK等療法中的低頻免疫細胞？

在CAR-T、CAR-NK等細胞治療開發過程中，始終要回答一個問題：免疫細胞是否真正發揮了作用？

在CAR-T研究中，CAR分子在T細胞表面成功表達，并不代表著細胞具有理想的殺傷能力。細胞的數量、活率、純度等指標也不能完全說明產品具有穩定的生物學效價。CAR-T細胞能不能被激活、識別靶點，并產生有效的T細胞免疫應答是細胞治療的核心。這也是ELISpot技術在細胞治療領域被關注的原因。

ELISpot（即酶聯免疫斑點檢測）在ELISA基礎上結合細胞培養技術衍生出的高靈敏度免疫檢測方法。它能夠在單細胞水平檢測分泌細胞因子的細胞頻率。分泌靶因子的陽性細胞會在膜上形成可計數的斑點，反映出有多少個細胞參與了免疫應答。

一、ELISpot在CAR-T研發中的應用

CAR-T細胞療法是通過基因修飾技術，將帶有抗原識別結構域和T細胞激活信號的CAR導入T細胞，使其能夠識別腫瘤細胞表面抗原，并通過釋放穿孔素、顆粒酶B以及細胞因子等方式發揮抗腫瘤作用。

不同scFv、鉸鏈區、跨膜區、共刺激結構域，都會影響CAR-T細胞的激活能力、細胞因子分泌譜、殺傷效率和持久性。研究人員將CAR-T細胞與靶癌細胞或靶抗原共培養，通過ELISpot檢測CAR-T在受到抗原刺激后，是否分泌IFN-γ、IL-2、TNF-α等細胞因子，為CAR-T臨床治療評估提供數據支撐。

Hu等人在開發靶向CD19的CAR-T療法過程中，利用IFN-γ ELISpot分析11名患者外周血免疫反應情況，結果顯示雙敲除DKO和低免疫原性HIP的CAR-T細胞未激活T細胞，而野生型WT細胞強烈激活T細胞，并在第28天達到峰值。證實HIP CAR-T細胞不會引發免疫反應，有效逃避免疫系統的排斥反應。

ELISpot檢測患者外周血的結果（源自文獻：doi: 10.1016/j.stem.2025.07.009）

二、橫向比較：ELISpot vs. ELISA及流式細胞術

ELISA用于免疫反應的定性和定量檢測，利用酶標儀測定吸光度，通過標準曲線定量可溶性蛋白含量。流式細胞術（FCM）反映細胞某個瞬間的“靜態快照”，是細胞通過固定和通透后檢測到的細胞內部儲存的蛋白量。ELISpot關注活細胞分泌蛋白總量隨時間的累積結果，在檢測低頻細胞表達上比FCM靈敏。

ELISpot、ELISA、FCM怎么選？

在項目開發過程中，ELISpot可與ELISA、FCM形成互補，而不失相互替代。需要檢測細胞因子總體分泌水平時，直接選用ELISA。如果需要了解細胞亞群與多參數信息，可能流式細胞術更合適。在檢測低頻抗原特異性功能應答時，就要優先考慮ELISpot了。

ELISpot

ELISA

流式細胞術

檢測對象

分泌功能細胞

總體可溶性分子濃度

細胞表型、胞內分子、多參數特征

讀出形式

離散斑點（SFU）

吸光度、濃度

細胞比例、熒光強度

單細胞分辨率

低頻應答檢測

優勢明顯

較弱

取決于總細胞數、目標細胞比例、信噪比

核心優勢

靈敏、直觀、適合功能評估

操作成熟、適合批量定量

信息維度高、可做亞群分析

主要局限

通量與多參數信息有限

缺少單細胞信息

儀器與分析門檻較高

三、ELISpot斑點如何分析？

“一個陽性細胞對應一個ELISpot斑點”，這是ELISpot檢測的理論前提。并非所有斑點都可用于數據統計，符合標準的斑點有其自身特征。

1.圓形，有核暈結構

如示意圖所示，標準的斑點呈圓形，中心顏色較深，邊緣顏色逐漸變淺，類似“核暈效應”。ELISpot板孔中的細胞處于懸浮狀態，分泌的細胞因子均勻的向四面八方擴散，沒有方向性。擴散到孔底部的PVDF膜上時會被包被抗體捕獲。路徑越短，到達該點的細胞因子越多，斑點顏色就會越深。因此以垂直距離為中心點，以同心圓向外擴散，濃度和顏色逐步降低。

斑點的核暈結構

2.大小不均一，呈正態分布

ELISpot斑點的直徑通常50-150μm。盡管在同一個孔中，陽性細胞培養條件和受到的刺激相同，但每個細胞分泌細胞因子或抗體的時間和能力不一定相同，因此產生的斑點也會大小不完全相同。如果對這些斑點的直徑進行統計，會發現它們呈正態分布。當然，不同細胞、不同刺激物、不同分泌物形成的斑點（平均直徑）也會存在差異，如IFN-γ、IL-4等細胞因子的斑點直徑比IL-10、IL-12之類的大。

斑點大小不一，呈正態分布

假斑點或非特異性斑點一般形狀不規則，顏色深淺不一，無核暈結構。凋亡細胞、細胞膜碎片、灰塵、纖維等可能會形成假斑點。在孵育和顯色反應過程中洗板徹底會減少假斑點出現的頻率。

四、義翹神州ELISpot試劑盒

ELISpot實驗體系需要標準化。細胞活率、抗原刺激條件、陰性與陽性對照、洗板強度、顯色時間、讀板參數、背景扣除方式等都有可能影響讀板結果（SFU值）。

義翹神州ELISpot檢測試劑盒正是圍繞這一痛點設計。其預包被ELISpot檢測試劑盒經PVDF板包被、無菌干燥、真空密封包裝等流程制備，可檢測IFN-γ、IL-2、IL-4等多種關鍵細胞因子。試劑盒即用型預包被，具有重復性高、檢測流程簡單、超高靈敏度等特點，是檢測人源或鼠源細胞因子優先考慮的標準化方案。

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