Int J Biol Sci I 靶向CPT1A，誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞鐵死亡：茜草天然產(chǎn)物Rubimaillin破解肝纖維化新機(jī)制！(尹航/蔣云瑤/徐英-清華...

2026年1月22日，清華大學(xué)藥學(xué)院/膜生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室尹航、蔣云瑤團(tuán)隊(duì)聯(lián)合上海中醫(yī)藥大學(xué)徐英團(tuán)隊(duì)、上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院等，在International Journal of Biological Sciences（中科院1區(qū)，IF=10.0）在線發(fā)表題為 “Rubimaillin ameliorates liver fibrosis by triggering the ferroptosis of activated hepatic stellate cells through targeting CPT1A” 的研究論文。該研究聚焦肝纖維化進(jìn)展中活化肝星狀細(xì)胞（HSCs）鐵死亡不足與代謝重編程異常這一關(guān)鍵問(wèn)題，首次系統(tǒng)揭示中藥茜草來(lái)源天然產(chǎn)物 Rubimaillin（Rub）可直接靶向 CPT1A，誘導(dǎo)活化 HSCs 發(fā)生鐵死亡，從而顯著改善肝損傷與肝纖維化，為肝纖維化治療提供了新的天然產(chǎn)物候選物和潛在分子靶點(diǎn)。

▼編者按:

肝纖維化是多種慢性肝病向肝硬化、肝衰竭甚至肝癌進(jìn)展的共同病理基礎(chǔ)，其核心特征是細(xì)胞外基質(zhì)異常沉積和肝臟結(jié)構(gòu)破壞。目前臨床上針對(duì)肝纖維化仍缺乏獲批的特異性抗纖維化藥物，治療主要依賴病因控制，如抗病毒、戒酒、減重和改善代謝紊亂等。因此，尋找能夠直接干預(yù)纖維化進(jìn)程的新靶點(diǎn)和新藥物具有重要意義。

肝星狀細(xì)胞是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞。正常情況下，HSCs處于靜息狀態(tài)，主要負(fù)責(zé)儲(chǔ)存維生素A；當(dāng)肝臟長(zhǎng)期受損時(shí)，HSCs被激活并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，表現(xiàn)出增強(qiáng)的增殖、遷移、收縮和細(xì)胞外基質(zhì)分泌能力。近年來(lái)研究表明，誘導(dǎo)活化HSCs發(fā)生鐵死亡，可以抑制其異常增殖和膠原沉積，被認(rèn)為是抗肝纖維化的重要策略。與此同時(shí)，CPT1A作為脂肪酸氧化的限速酶，參與細(xì)胞能量代謝重編程，并與HSCs活化和鐵死亡抵抗密切相關(guān)，因此具有重要的治療靶點(diǎn)價(jià)值。

本研究中，作者首先在TGF-β1誘導(dǎo)的LX2和JS1細(xì)胞模型中發(fā)現(xiàn)，Rub可濃度依賴性抑制HSCs活化，降低α-SMA、Col1A1等纖維化標(biāo)志物表達(dá)。隨后，在CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型中，Rub顯著降低血清ALT、AST水平，改善肝組織病理?yè)p傷，減少M(fèi)asson和Sirius red染色所示的膠原沉積，并降低α-SMA、Col1A1、Col3A1和TGF-β1等纖維化相關(guān)指標(biāo)，提示Rub具有明確的抗肝損傷和抗纖維化作用。

為進(jìn)一步解析其機(jī)制，研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)RNA-seq發(fā)現(xiàn)Rub處理后谷胱甘肽代謝和鐵死亡通路顯著富集，提示鐵死亡可能是Rub抗肝纖維化的核心機(jī)制。后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，Rub可增強(qiáng)活化HSCs中ACSL4表達(dá)，降低GPX4水平，并引起GSH減少、GSSG升高、脂質(zhì)過(guò)氧化、ROS和Fe2?積累，以及線粒體縮小、嵴減少等典型鐵死亡特征。值得注意的是，Rub主要誘導(dǎo)活化HSCs鐵死亡，而對(duì)肝細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的鐵死亡影響相對(duì)有限，體現(xiàn)出一定的細(xì)胞選擇性。

在靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)方面，作者利用PROTAC靶點(diǎn)捕獲技術(shù)篩選Rub的直接作用蛋白，并將CPT1A確定為關(guān)鍵候選靶點(diǎn)。進(jìn)一步通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬、CETSA、DARTS、BLI和位點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Rub可直接結(jié)合CPT1A，并通過(guò)SER592、THR594和THR689等關(guān)鍵位點(diǎn)抑制CPT1A活性。CPT1A敲低或過(guò)表達(dá)均可削弱Rub誘導(dǎo)HSCs鐵死亡的作用，說(shuō)明CPT1A是Rub發(fā)揮抗纖維化效應(yīng)的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

機(jī)制上，Rub通過(guò)靶向CPT1A調(diào)控c-Myc泛素化，進(jìn)而影響NRF2/GPX4抗氧化系統(tǒng)和ACSL4/PL-PUFAs脂質(zhì)過(guò)氧化通路，最終推動(dòng)活化HSCs發(fā)生代謝重編程介導(dǎo)的鐵死亡。換言之，Rub并非單純抑制HSCs活化，而是通過(guò)“靶向CPT1A—重塑脂肪酸代謝—削弱抗氧化防御—增強(qiáng)脂質(zhì)過(guò)氧化—誘導(dǎo)鐵死亡”這一連續(xù)機(jī)制，從源頭上限制纖維化效應(yīng)細(xì)胞的病理功能。

綜上，該研究不僅闡明了Rubimaillin抗肝纖維化的藥效基礎(chǔ)，還揭示了其直接靶點(diǎn)CPT1A及其介導(dǎo)的鐵死亡調(diào)控機(jī)制。該發(fā)現(xiàn)拓展了天然產(chǎn)物干預(yù)肝纖維化的研究思路，也為“靶向活化HSCs鐵死亡”這一治療策略提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。未來(lái)，若能在HSCs特異性CPT1A敲除動(dòng)物模型和更接近臨床病因的肝纖維化模型中進(jìn)一步驗(yàn)證，將有望推動(dòng)Rub及CPT1A靶向策略向抗肝纖維化藥物開(kāi)發(fā)邁進(jìn)。

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【摘要】

肝纖維化是指由于慢性肝損傷導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)蛋白在肝臟中過(guò)度積累。靶向誘導(dǎo)活化肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells, HSCs）發(fā)生鐵死亡，被認(rèn)為是治療肝纖維化的一種有前景的策略。Rubimaillin（Rub）是從傳統(tǒng)中藥茜草（Rubia cordifolia L.）中提取的一種萘醌類化合物，在多種疾病中表現(xiàn)出多樣的藥理活性。本研究旨在探討 Rub 的抗肝纖維化作用、直接蛋白靶點(diǎn)及其分子機(jī)制。

研究結(jié)果表明，在小鼠模型中，Rub 可通過(guò)觸發(fā)活化 HSCs 的鐵死亡，有效改善肝纖維化。隨后，研究者利用 PROTAC 技術(shù)、計(jì)算機(jī)分子動(dòng)力學(xué)模擬、細(xì)胞熱轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)（CETSA）、藥物親和反應(yīng)靶標(biāo)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)（DARTS）、生物層干涉技術(shù)（BLI）以及位點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)，證實(shí) Rub 可直接結(jié)合肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶 1A（CPT1A）的 SER592、THR594 和 THR689 位點(diǎn)，并抑制其活性。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在活化 HSCs 中抑制或缺失 CPT1A 可觸發(fā)由代謝重編程介導(dǎo)的鐵死亡。此外，CPT1A 缺失或過(guò)表達(dá)均可消除 Rub 誘導(dǎo)鐵死亡的作用。從機(jī)制上看，Rub 誘導(dǎo)活化 HSCs 鐵死亡與其靶向 CPT1A 所介導(dǎo)的代謝重編程有關(guān)。綜上，本研究闡明了 Rub 通過(guò)誘導(dǎo)活化 HSCs 鐵死亡改善肝纖維化的有益作用、直接蛋白靶點(diǎn)及分子機(jī)制。

關(guān)鍵詞：Rubimaillin；肝纖維化；肝星狀細(xì)胞（HSCs）；鐵死亡；肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶 1A（CPT1A）。

01

研究背景及科學(xué)問(wèn)題

肝纖維化是多種慢性肝病進(jìn)展過(guò)程中的關(guān)鍵共同病理過(guò)程。當(dāng)肝臟持續(xù)受到損傷，例如受到慢性病毒性肝炎（乙型肝炎和丙型肝炎）、酒精性肝病、代謝功能障礙相關(guān)脂肪性肝病（MAFLD）、自身免疫性肝病等致病因素刺激時(shí)，肝星狀細(xì)胞（HSCs）被激活，細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）成分的合成增加而降解減少。隨后，大量 ECM 在肝組織中異常沉積，逐漸破壞肝臟正常結(jié)構(gòu)，并使肝臟質(zhì)地變硬，從而形成肝纖維化。

隨著生活方式改變，酒精性肝病和 MAFLD 的發(fā)生率急劇上升，再加上慢性病毒性肝炎的持續(xù)影響，肝纖維化患病率逐年增加。然而，肝纖維化領(lǐng)域仍存在未被滿足的臨床需求，目前尚無(wú)獲批用于其治療的特異性化學(xué)藥物或生物制劑。現(xiàn)階段主要治療方式仍是病因治療，例如慢性病毒性肝炎患者接受抗病毒治療，酒精性肝病患者戒酒，MAFLD 患者控制體重并改善代謝紊亂。鑒于現(xiàn)有治療手段的局限性以及肝纖維化形勢(shì)日益嚴(yán)峻，亟需尋找新的治療靶點(diǎn)和候選藥物。

肝纖維化的發(fā)生并非由單一因素導(dǎo)致，而是多種細(xì)胞類型、信號(hào)通路和細(xì)胞外環(huán)境相互交織并協(xié)同作用的結(jié)果。普遍認(rèn)為，HSCs 是肝纖維化中的主要效應(yīng)細(xì)胞，其活化是肝纖維化發(fā)病機(jī)制中的核心事件。在正常肝臟中，HSCs 處于靜息狀態(tài)，主要功能是儲(chǔ)存維生素 A 并維持肝臟正常結(jié)構(gòu)。然而，當(dāng)肝臟遭受持續(xù)損傷時(shí)，多種刺激信號(hào)會(huì)破壞 HSCs 穩(wěn)態(tài)，促使其轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞。活化后的 HSCs 獲得了較強(qiáng)的增殖和遷移能力、收縮特性以及分泌細(xì)胞因子和 ECM 的能力。值得注意的是，HSCs 的增殖和遷移需要大量能量輸入，從而觸發(fā)細(xì)胞代謝重編程。

肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶 1A（CPT1A）是一種位于線粒體外膜的酶，可通過(guò)將長(zhǎng)鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體進(jìn)行 β-氧化來(lái)構(gòu)成脂肪酸氧化的限速步驟，并以 ATP 形式產(chǎn)生能量，在調(diào)控細(xì)胞能量代謝中發(fā)揮重要作用。此外，CPT1A 介導(dǎo)的脂肪酸氧化可通過(guò)核苷代謝促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞增殖。已有研究證實(shí)，在肝纖維化小鼠模型和肝纖維化患者的 HSCs 中，CPT1A 表達(dá)顯著升高；升高的 CPT1A 可誘導(dǎo) HSCs 活化，從而促進(jìn)肝纖維化進(jìn)展。相反，在 HSCs 中通過(guò)藥理或遺傳方式抑制 CPT1A，可通過(guò)抑制 HSCs 活化來(lái)緩解肝纖維化。因此，開(kāi)發(fā)靶向 CPT1A 的化合物可能為肝纖維化治療開(kāi)辟新的途徑。

鐵死亡作為一種新型程序性細(xì)胞死亡方式，近年來(lái)在肝纖維化研究領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。與傳統(tǒng)的細(xì)胞凋亡和壞死不同，鐵死亡主要依賴鐵過(guò)載和脂質(zhì)過(guò)氧化物積累，進(jìn)而破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)并觸發(fā)細(xì)胞死亡。多項(xiàng)研究表明，在肝纖維化過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)鐵代謝失衡、鐵離子攝取增加以及儲(chǔ)存和輸出減少，會(huì)導(dǎo)致 HSCs 鐵過(guò)載，并為鐵死亡發(fā)生提供條件。研究證實(shí)，誘導(dǎo)活化 HSCs 發(fā)生鐵死亡可顯著降低 HSCs 生長(zhǎng)、抑制 ECM 積累，從而緩解肝纖維化。因此，誘導(dǎo)活化 HSCs 鐵死亡正成為一種新的、有前景的肝纖維化治療策略。

目前，CPT1A 被認(rèn)為是鐵死亡抵抗的重要驅(qū)動(dòng)因子，阻斷 CPT1A 可觸發(fā)鐵死亡。近期研究表明，靶向 CPT1A 介導(dǎo)的代謝重編程可通過(guò)兩種關(guān)鍵機(jī)制誘導(dǎo)鐵死亡：一是下調(diào)核因子 E2 相關(guān)因子 2（NRF2）/谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 4（GPX4）抗氧化系統(tǒng)；二是增強(qiáng)長(zhǎng)鏈酰基輔酶 A 合成酶 4（ACSL4）介導(dǎo)的磷脂多不飽和脂肪酸（PL-PUFAs）生成，而這兩者均受 c-Myc 泛素化調(diào)控。因此，考慮到 CPT1A 在活化 HSCs 以及鐵死亡中的作用，作者推測(cè) CPT1A 也可能通過(guò)介導(dǎo)代謝重塑來(lái)誘導(dǎo)活化 HSCs 鐵死亡，從而緩解肝纖維化。簡(jiǎn)言之，靶向 CPT1A 介導(dǎo)的活化 HSCs 鐵死亡具有成為肝纖維化治療策略的潛力。

目前，針對(duì)中藥成分和天然產(chǎn)物的靶標(biāo)捕獲技術(shù)已有多種。親和力基礎(chǔ)靶標(biāo)鑒定可通過(guò)小分子與蛋白之間的固有親和力捕獲靶標(biāo)，操作簡(jiǎn)便，但容易受到非特異性結(jié)合事件的干擾；活性基礎(chǔ)蛋白質(zhì)組學(xué)分析（ABPP）通過(guò)活性探針實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白活性位點(diǎn)的特異性結(jié)合，適用于酶類靶標(biāo)，但應(yīng)用范圍受限；無(wú)標(biāo)記靶標(biāo)鑒定可避免標(biāo)簽干擾并重現(xiàn)靶標(biāo)的生理結(jié)合狀態(tài)，但存在靈敏度低、檢測(cè)成本高等固有不足。

與這些主要聚焦于“靶標(biāo)識(shí)別與鑒定”的傳統(tǒng)靶標(biāo)捕獲技術(shù)相比，PROTAC 靶標(biāo)捕獲技術(shù)作為一種先進(jìn)的靶標(biāo)解析工具，可避免對(duì)天然產(chǎn)物進(jìn)行化學(xué)修飾，并能在活細(xì)胞生理?xiàng)l件下進(jìn)行原位靶標(biāo)捕獲，從而克服傳統(tǒng)方法的局限。因此，該技術(shù)已越來(lái)越多地用于中藥成分和天然產(chǎn)物的靶標(biāo)鑒定，為該研究領(lǐng)域提供了新的高效策略。PROTAC 作為近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的強(qiáng)大內(nèi)源性蛋白降解工具，其核心優(yōu)勢(shì)不僅在于可特異性結(jié)合靶蛋白，還可通過(guò)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)觸發(fā)靶蛋白泛素化及后續(xù)降解，從而進(jìn)一步提高靶標(biāo)鑒定的可靠性。

茜草（Rubia cordifolia L.）的根或根莖是一種傳統(tǒng)中藥，在中國(guó)被廣泛用于治療關(guān)節(jié)炎、子宮出血和慢性肝病。Rubimaillin（Rub，又稱 Mollugin）是從茜草中提取的一種萘醌類化合物，在研究中顯示出抗腫瘤、抗炎和神經(jīng)保護(hù)等多種藥理活性。此外，有報(bào)道顯示 Rub 可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖并驅(qū)動(dòng)鐵死亡。然而，Rub 在肝纖維化中的作用仍未得到充分闡明。鑒于 CPT1A 在 HSCs 活化及其鐵死亡抵抗中發(fā)揮核心作用，同時(shí)考慮到 Rub 調(diào)控鐵死亡的潛力，本研究假設(shè) Rub 可能通過(guò)靶向 HSCs 中的 CPT1A 并誘導(dǎo)其鐵死亡，從而發(fā)揮抗肝纖維化作用。

在本研究中，為評(píng)估 Rub 的抗肝纖維化作用，作者建立了轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β1（TGF-β1）誘導(dǎo)的 HSCs 活化模型和四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)的肝纖維化模型。隨后，研究者通過(guò) RNA 測(cè)序（RNA-seq）分析探索潛在機(jī)制，并通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證實(shí) Rub 可誘導(dǎo)活化 HSCs 鐵死亡。PROTAC、分子對(duì)接和結(jié)合實(shí)驗(yàn)鑒定并驗(yàn)證了 Rub 與 CPT1A 的相互作用。CPT1A 敲低和過(guò)表達(dá)模型進(jìn)一步驗(yàn)證了 Rub 誘導(dǎo)鐵死亡對(duì) CPT1A 的依賴性。最后，研究者分析了 Rub 對(duì) NRF2/GPX4 和 ACSL4/PL-PUFAs 通路的調(diào)控，以闡明其通過(guò)靶向 CPT1A 誘導(dǎo)鐵死亡的機(jī)制。

02

重要發(fā)現(xiàn)及亮點(diǎn)

Rub 在體外抑制 HSCs 活化

為評(píng)價(jià) Rub 在體外對(duì) HSCs 活化的抑制作用，研究者采用 TGF-β1 誘導(dǎo)人 HSCs 細(xì)胞系 LX2 和小鼠 HSCs 細(xì)胞系 JS1 的活化。在評(píng)價(jià) HSCs 活化之前，首先通過(guò) CCK8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè) Rub 對(duì) LX2 和 JS1 細(xì)胞活力的影響。LX2 和 JS1 細(xì)胞在有或無(wú) TGF-β1 誘導(dǎo)的條件下，同時(shí)接受不同濃度 Rub 處理 48 小時(shí)。如圖 1A 所示，在 25–300 μM 范圍內(nèi)，Rub 對(duì) LX2 和 JS1 細(xì)胞活力表現(xiàn)出不同程度的濃度依賴性抑制作用。顯然，Rub 對(duì) TGF-β1 誘導(dǎo)細(xì)胞的活力抑制作用更為顯著。

進(jìn)一步分析細(xì)胞活力抑制率發(fā)現(xiàn)，Rub 對(duì) TGF-β1 刺激的 LX2 和 JS1 細(xì)胞抑制率超過(guò) 20%（范圍：20.94%–31.63%），而對(duì)未受 TGF-β1 刺激的 LX2 和 JS1 細(xì)胞抑制率低于 20%（范圍：2.70%–16.68%），且兩種細(xì)胞系中 TGF-β1 刺激組與未刺激組之間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖 1B）。因此，在 50、100 和 150 μM 濃度下，Rub 不會(huì)改變靜息 HSCs 的細(xì)胞活力。

隨后，研究者在 50、100 和 150 μM 濃度下評(píng)價(jià) Rub 對(duì) HSCs 活化的抑制作用。LX2 和 JS1 細(xì)胞經(jīng) TGF-β1 誘導(dǎo)活化并與 Rub 共孵育后，采用 qPCR 和 Western blot 檢測(cè) HSCs 活化標(biāo)志物 α-SMA 和 Col1A1。結(jié)果顯示，Rub 可顯著降低 LX2 和 JS1 細(xì)胞中 α-SMA 與 Col1A1 的 mRNA 表達(dá)，以及 α-SMA 蛋白表達(dá)，并呈濃度依賴性抑制（圖 1C-D）。此外，研究者還通過(guò)免疫熒光檢測(cè) α-SMA 和 Col1A1 的表達(dá)，結(jié)果顯示，在 TGF-β1 誘導(dǎo)的 LX2 和 JS1 細(xì)胞中，α-SMA 和 Col1A1 陽(yáng)性染色熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)；而不同濃度 Rub 孵育可明顯抑制該熒光增強(qiáng)（圖 1E-F）。綜上，這些結(jié)果證實(shí) Rub 是一種潛在抑制劑，可顯著抑制 HSCs 活化。

圖 1. Rub對(duì) LX2 和 JS1 細(xì)胞中 HSCs 活化的影響。（A）Rub 對(duì) LX2 和 JS1 細(xì)胞活力的影響。（B）Rub 對(duì) LX2 和 JS1 細(xì)胞活力的抑制率。（C）LX2 和 JS1 細(xì)胞中 α-SMA 和 Col1A1 的 mRNA 表達(dá)。（D）LX2 和 JS1 細(xì)胞中 α-SMA 的蛋白表達(dá)。（E）LX2 和 JS1 細(xì)胞中 α-SMA（綠色，比例尺 = 100 μm）和 Col1A1（紅色，比例尺 = 100 μm）的免疫熒光染色。（F）LX2 和 JS1 細(xì)胞中 α-SMA 和 Col1A1 陽(yáng)性染色的熒光強(qiáng)度。所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行 n = 3 次獨(dú)立生物學(xué)重復(fù)。 < 0.05 vs DMSO；*p < 0.05 vs TGF-β1。

Rub 有效改善 CCl4 誘導(dǎo)小鼠的肝損傷和肝纖維化

為考察 Rub 對(duì)肝損傷和肝纖維化的藥理作用，研究者通過(guò)每周 3 次腹腔注射 15% CCl4、持續(xù) 6 周建立小鼠肝纖維化模型，并從第 3 周開(kāi)始給予 Rub（10 和 20 mg/kg）灌胃處理（圖 2A）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，依次評(píng)價(jià)小鼠肝損傷和肝纖維化指標(biāo)。CCl4 組中升高的血清肝損傷標(biāo)志物（如 AST 和 ALT 水平）經(jīng) Rub 處理后顯著降低（圖 2B）。

同時(shí)，肝組織病理學(xué) H&E 染色結(jié)果如圖 2C 所示。與對(duì)照組相比，CCl4 誘導(dǎo)肝纖維化小鼠的肝組織出現(xiàn)明顯組織學(xué)改變，包括正常肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞、肝細(xì)胞腫脹并出現(xiàn)空泡樣變性、肝竇間隙變窄、纖維間隔增寬以及肝組織中明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。然而，這些病理改變可被 Rub 處理顯著改善。

此外，研究者采用 Masson 染色和 Sirius red 染色評(píng)價(jià)膠原纖維沉積。在 CCl4 誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠中，膠原沉積明顯，纖維間隔染色強(qiáng)烈，呈增厚和廣泛分布；同時(shí)，Masson 陽(yáng)性面積和 Sirius red 陽(yáng)性面積均顯著升高。Rub 處理后，纖維化小鼠膠原纖維沉積明顯減輕（圖 2D 和 F）。與此同時(shí)，作為膠原代謝重要指標(biāo)的肝羥脯氨酸（Hyp）含量也被檢測(cè)，結(jié)果顯示 Rub 處理后 Hyp 含量明顯下降（圖 2G）。

HSCs 活化常用于評(píng)價(jià)體內(nèi)肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展。因此，本研究也像體外實(shí)驗(yàn)一樣，通過(guò) qPCR、Western blot 和免疫組織化學(xué)檢測(cè) HSCs 活化相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果見(jiàn)圖 2E 和 H：免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，CCl4 組 α-SMA 陽(yáng)性染色明顯增加，而 Rub 組顯著降低。qPCR 和 Western blot 結(jié)果顯示，CCl4 誘導(dǎo)小鼠肝組織中升高的 α-SMA 和 Col1A1 mRNA 表達(dá)，以及 α-SMA 蛋白表達(dá)，均被 Rub 處理顯著降低（圖 2I-J）。此外，CCl4 組中部分纖維化相關(guān)基因 Col1A3 和 TGF-β1 的 mRNA 表達(dá)也經(jīng) Rub 處理顯著降低（圖 2I）。這些結(jié)果提示，Rub 可抑制 CCl4 誘導(dǎo)小鼠中的 HSCs 活化。值得注意的是，在所有檢測(cè)參數(shù)中，Rub 的治療效果與陽(yáng)性對(duì)照藥物索拉非尼（Sora）相當(dāng)，甚至更優(yōu)。總體而言，這些數(shù)據(jù)表明 Rub 可有效改善 CCl4 誘導(dǎo)小鼠的肝損傷和肝纖維化。

圖 2. Rub 對(duì) CCl4 誘導(dǎo)小鼠肝損傷和肝纖維化的影響。（A）CCl4 注射并接受 Rub 或 Sora 治療小鼠的實(shí)驗(yàn)流程示意圖。（B）血清 ALT 和 AST 活性。（C）H&E 染色（比例尺 = 100 μm 和 50 μm）。（D、F）Masson 和 Sirius red 染色（比例尺 = 100 μm）及其半定量分析。（E、H）α-SMA 免疫組織化學(xué)染色（黃褐色，比例尺 = 100 μm）及其半定量分析。（G）肝臟 Hyp 含量。（I）α-SMA、Col1A1、Col3A1 和 TGF-β1 的 mRNA 表達(dá)。（J）α-SMA 的蛋白表達(dá)。n = 6， < 0.05 vs Control；*p < 0.05 vs CCl4。

RNA-seq 分析顯示 Rub 調(diào)控鐵死亡通路

為探索 Rub 抗肝纖維化作用的分子機(jī)制，研究者對(duì)經(jīng) Rub 處理或未處理的纖維化肝組織進(jìn)行 RNA-seq 分析。差異表達(dá)基因火山圖分析顯示，Rub-vs-CCl4 組的基因表達(dá)譜發(fā)生整體變化，共富集到 722 個(gè)下調(diào)基因和 1034 個(gè)上調(diào)基因（圖 3A）。在 KEGG 通路分析中，谷胱甘肽代謝和鐵死亡通路顯著富集（圖 3B）。

進(jìn)一步采用基因集富集分析（GSEA）對(duì)這兩個(gè)通路進(jìn)行分析，其 NES、P 值和 FDR 分別為：谷胱甘肽代謝（NES = -2.52，p < 0.001，F(xiàn)DR < 0.001）和鐵死亡（NES = -2.28，P < 0.001，F(xiàn)DR = 0.0）（圖 3C），提示這兩個(gè)通路在 GSEA 中同樣顯著富集。谷氨酸代謝參與鐵死亡并與該過(guò)程密切相關(guān)。鐵死亡通路差異表達(dá)基因熱圖如圖 3D 所示；例如，經(jīng) Rub 處理后，Hmox1、Slc7a11 和 Gclc 表達(dá)顯著降低，而 Acsl3、Acsl4 和 Acsl5 表達(dá)顯著升高。綜上，Rub 可在肝纖維化中顯著誘導(dǎo)鐵死亡，這可能是 Rub 抗肝纖維化作用的潛在分子機(jī)制。

圖 3. 基于 RNA-seq 分析的 Rub 對(duì)鐵死亡通路的影響。（A）火山圖顯示 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的 log2 倍數(shù)變化。（B）KEGG 通路富集分析（前 20 位）。（C）谷胱甘肽代謝和鐵死亡通路的 GSEA 分析。（D）基于 GSEA 分析的鐵死亡通路相關(guān)基因表達(dá)譜熱圖。

Rub 誘導(dǎo)活化 HSCs 發(fā)生鐵死亡

為確定 Rub 誘導(dǎo)鐵死亡發(fā)生于哪一類肝細(xì)胞，研究者評(píng)價(jià)了 Rub 對(duì) HSCs、巨噬細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞鐵死亡的影響。考慮到 HSCs 是介導(dǎo)肝纖維化的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞，且越來(lái)越多證據(jù)表明誘導(dǎo)活化 HSCs 鐵死亡是治療肝纖維化的有效措施，研究者首先評(píng)價(jià) Rub 是否可誘導(dǎo)活化 HSCs 鐵死亡。在本研究中，在 Rub 處理的 CCl4 誘導(dǎo)小鼠中觀察到活化 HSCs 的 Rub 誘導(dǎo)鐵死亡。具體而言，免疫熒光染色結(jié)果顯示，在 Rub 處理的纖維化小鼠中，鐵死亡過(guò)程正向調(diào)控因子 ACSL4 與活化 HSCs 標(biāo)志物 α-SMA 的共染顯著上調(diào)（圖 4A 和 B）。

隨后，研究者開(kāi)展一系列實(shí)驗(yàn)，在體外評(píng)價(jià) Rub 對(duì)活化 HSCs 鐵死亡的影響。首先，將 TGF-β1 誘導(dǎo)的 LX2 和 JS1 細(xì)胞與 Rub 及 Fer-1（一種鐵死亡抑制劑）共同孵育，結(jié)果顯示 Fer-1 可消除 Rub 對(duì)細(xì)胞活力的抑制作用（補(bǔ)充材料圖 S1A）。已有研究證實(shí)，在鐵死亡過(guò)程中，細(xì)胞線粒體的形態(tài)學(xué)變化表現(xiàn)為線粒體體積減小、雙層膜密度增加以及線粒體嵴減少或消失。結(jié)果如圖 4C 和補(bǔ)充材料圖 S1B 所示，在 Rub 處理的活化 LX2 和 JS1 細(xì)胞中觀察到與鐵死亡相關(guān)的線粒體形態(tài)改變。

與此同時(shí)，Rub 處理的活化 LX2 和 JS1 細(xì)胞中也出現(xiàn)了其他重要鐵死亡指標(biāo)的變化，表現(xiàn)為 GSH 含量下降，GSSG、LPO、ROS 和 Fe2+ 水平升高（圖 4D-E 和補(bǔ)充材料圖 S1C-D）。此外，Rub 處理可顯著下調(diào) GPX4 蛋白水平，并顯著上調(diào) ACSL4 蛋白水平（補(bǔ)充材料圖 S1E）。研究者還評(píng)價(jià)了 Rub 對(duì) HSCs 凋亡或壞死（兩種最常見(jiàn)的替代性細(xì)胞死亡方式）的影響，結(jié)果顯示 Rub 并未顯著調(diào)控 HSCs 的這兩類細(xì)胞死亡（補(bǔ)充材料圖 S2）。這些結(jié)果提示 Rub 可誘導(dǎo) HSCs 發(fā)生鐵死亡。

根據(jù)鐵死亡關(guān)鍵指標(biāo) ACSL4 的免疫熒光結(jié)果可知，在肝纖維化中，Rub 主要調(diào)控纖維間隔間質(zhì)細(xì)胞中這些蛋白的表達(dá)，提示 Rub 誘導(dǎo)的肝細(xì)胞鐵死亡主要發(fā)生于間質(zhì)細(xì)胞。因此，研究者進(jìn)一步評(píng)價(jià) Rub 對(duì)巨噬細(xì)胞和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞鐵死亡的影響。結(jié)果顯示，Rub 處理組中 ACSL4 與 CD11b（肝 Kupffer 細(xì)胞標(biāo)志物）和 CD34（肝竇內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物）的免疫熒光共染極少，與 CCl4 模型組相比無(wú)顯著差異（補(bǔ)充材料圖 S3A-B）。此外，研究者還在體外評(píng)價(jià) Rub 對(duì)肝細(xì)胞鐵死亡的影響，結(jié)果顯示 Rub 不會(huì)促進(jìn)肝細(xì)胞系 AML12 細(xì)胞發(fā)生鐵死亡（補(bǔ)充材料圖 S4）。綜上，上述結(jié)果證實(shí)，在肝纖維化中 Rub 可誘導(dǎo)活化 HSCs 發(fā)生鐵死亡。

圖 4. Rub 對(duì)活化 HSCs 鐵死亡的影響。（A）CCl4 誘導(dǎo)小鼠肝切片中 ACSL4（綠色）和 α-SMA（紅色）的免疫熒光共染（比例尺 = 100 μm）。（B）ACSL4 和 α-SMA 共染的半定量分析。（C）TGF-β1 誘導(dǎo)的 LX2 細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)變化（比例尺 = 200 nm）。（D、E）TGF-β1 誘導(dǎo)的 LX2 細(xì)胞中 LPO、ROS 和 Fe2+ 的熒光染色（比例尺 = 100 μm）。所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行 n = 3 次獨(dú)立生物學(xué)重復(fù)。 < 0.05 vs Control；*p < 0.05 vs CCl4 或 TGF-β1。

CPT1A 是 Rub-PROTAC 的降解靶標(biāo)

為研究 Rub 在抗肝纖維化中的靶點(diǎn)，研究者采用 PROTAC 靶標(biāo)捕獲技術(shù)在 LX2 細(xì)胞中鑒定其靶標(biāo)。首先，選擇 Rub 合成 PROTAC 分子。為合成 Rub 的 PROTAC，研究者選取活性最強(qiáng)的 Rub 核心骨架結(jié)構(gòu)作為目標(biāo)蛋白（POI）配體，并將 Rub 與連接至沙利度胺的 1-聚乙二醇（1-PEG）連接子偶聯(lián)，獲得 PROTAC 分子（稱為 Rub-PROTAC）（圖 5A 和補(bǔ)充材料方案 S1）。與此同時(shí)，Rub-PROTAC 對(duì) TGF-β1 刺激 LX2 細(xì)胞中 α-SMA 蛋白表達(dá)也表現(xiàn)出顯著抑制活性（圖 5B）。

為研究直接而非間接蛋白降解，LX2 細(xì)胞僅用 Rub-PROTAC 和 DMSO 處理 10 小時(shí)；隨后采用 4D-DIA 蛋白質(zhì)組學(xué)分析 Rub-PROTAC 顯著降解的蛋白（圖 5C）。如圖 5D 和 E 所示，一些蛋白顯著下調(diào)，如 ZC3H11A、CPT1A、PDCD11、ABCF3 和 COPB2。在這些蛋白中，已有研究報(bào)道 CPT1A 對(duì)肝纖維化發(fā)展和鐵死亡過(guò)程至關(guān)重要。在肝纖維化中，CPT1A 缺失可緩解 HSCs 活化和肝纖維化。此外，已有研究表明 CPT1A 缺乏可誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。結(jié)合分析結(jié)果與 Rub 的藥理作用，研究者最終將研究重點(diǎn)集中于 CPT1A。

為驗(yàn)證蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果，研究者將 LX2 和 JS1 細(xì)胞與不同濃度 Rub-PROTAC 共孵育 10 小時(shí)。結(jié)果顯示，Rub-PROTAC 以濃度依賴性方式增強(qiáng) CPT1A 泛素化（Ub-CPT1A），并以濃度依賴性方式降解 CPT1A 蛋白（圖 5F）。隨后，研究者將經(jīng) Rub-PROTAC 處理的細(xì)胞與泛素化抑制劑 MG132 共孵育，結(jié)果顯示 MG132 可消除 Rub-PROTAC 介導(dǎo)的 Ub-CPT1A 增強(qiáng)和 CPT1A 蛋白降解（圖 5G）。進(jìn)一步地，研究者在 LX2 和 JS1 細(xì)胞中同時(shí)共孵育 Rub 和 Rub-PROTAC，以評(píng)價(jià)是否存在對(duì) CPT1A 的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。結(jié)果顯示，Rub 可部分逆轉(zhuǎn) Rub-PROTAC 對(duì) CPT1A 蛋白的降解作用（圖 5H）。總之，上述結(jié)果證實(shí) Rub-PROTAC 通過(guò)泛素化通路降解 CPT1A 蛋白，且 CPT1A 可能是 Rub 的結(jié)合靶標(biāo)。

圖 5. 利用 PROTAC 技術(shù)在 LX2 細(xì)胞中分析并確定 Rub 靶蛋白。（A）Rub 探針與 PROTAC 分子（Rub-PROTAC）的合成。（B）Rub 和 Rub-PROTAC 處理 LX2 細(xì)胞后 α-SMA 的蛋白表達(dá)。（C）基于 4D-DIA 蛋白質(zhì)組學(xué)分析的靶標(biāo)鑒定流程。（D）差異蛋白火山圖。（E）log2FoldChange < -1 的降解蛋白。（F）Rub-PROTAC 處理 LX2 和 JS1 細(xì)胞中 CPT1A 蛋白的濃度依賴性泛素化與降解。（G）MG132 和 Rub-PROTAC 處理 LX2 和 JS1 細(xì)胞中 CPT1A 蛋白的泛素化與降解。（H）Rub-PROTAC 與 Rub 共處理 LX2 和 JS1 細(xì)胞 10 小時(shí)后 CPT1A 的蛋白水平。所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行 n = 3 次獨(dú)立生物學(xué)重復(fù)。 < 0.05 vs DMSO；*p < 0.05 vs TGF-β1 或 Rub-PROTAC。

Rub 在 HSCs 中直接靶向 CPT1A

為確認(rèn) CPT1A 是 Rub 的直接靶點(diǎn)，研究者首先選擇 CPT1A-Rub 復(fù)合物和 CPT1A 進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，以評(píng)價(jià) Rub 與 CPT1A 的結(jié)合。在整個(gè)模擬過(guò)程中（200 ns），CPT1A 的 Cα 主鏈均方根偏差（RMSD）基本穩(wěn)定在 3 ?，說(shuō)明該系統(tǒng)在模擬過(guò)程中達(dá)到平衡狀態(tài)。CPT1A-Rub 復(fù)合物的 Cα 主鏈 RMSD 從模擬初期升至 6 ?，隨后在模擬中期降至 5 ?，并在模擬后期穩(wěn)定維持在 5 ? 以下，提示該結(jié)合構(gòu)象具有較高熱力學(xué)穩(wěn)定性（圖 6A）。

從均方根波動(dòng)（RMSF）結(jié)果可見(jiàn)，CPT1A 活性位點(diǎn)氨基酸殘基的 RMSF 基本低于 2.0–2.5 ?，提示 CPT1A-Rub 的配體結(jié)合可穩(wěn)定活性位點(diǎn)的局部構(gòu)象（圖 6B）。同時(shí)，研究者還監(jiān)測(cè)了 CPT1A-Rub 系統(tǒng)中的氫鍵數(shù)量、旋轉(zhuǎn)半徑（Rg）和溶劑可及表面積（SASA）變化（圖 6C-E）。這些結(jié)果進(jìn)一步表明，Rub 在整個(gè)模擬過(guò)程中可穩(wěn)定結(jié)合 CPT1A；CPT1A-Rub 的氫鍵數(shù)量保持穩(wěn)定，且氫鍵結(jié)合位點(diǎn)也一致。此外，自由能景觀（FEL）分析顯示，PC1(20)/PC2(-20) 是一個(gè)低能量凹陷，提示此時(shí) Rub 和 CPT1A 的構(gòu)象穩(wěn)定（圖 6F）。這些數(shù)據(jù)表明 Rub 可在整個(gè)模擬過(guò)程中穩(wěn)定結(jié)合 CPT1A。

隨后，研究者分別采用細(xì)胞熱轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)（CETSA）、藥物親和反應(yīng)靶標(biāo)穩(wěn)定性（DARTS）實(shí)驗(yàn)和生物層干涉（BLI）實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià) Rub 與 CPT1A 的結(jié)合能力。在 CETSA 實(shí)驗(yàn)中，Rub 明顯提高 LX2 和 JS1 細(xì)胞中 CPT1A 蛋白的細(xì)胞熱穩(wěn)定性（圖 6G）。在 DARTS 實(shí)驗(yàn)中，Rub 孵育后 LX2 和 JS1 細(xì)胞中 CPT1A 的降解顯著減少（圖 6H）。在 BLI 實(shí)驗(yàn)中，Rub 與 CPT1A 的平衡解離常數(shù)（KD）為 3.77E-04 mol/L（圖 6I）。此外，研究者評(píng)價(jià)了 Rub 對(duì) CPT1A 活性的影響，發(fā)現(xiàn) Rub 可顯著抑制 LX2 和 JS1 細(xì)胞中的 CPT1A 活性（圖 6J 和補(bǔ)充材料圖 S5A）。

進(jìn)一步地，研究者進(jìn)行分子對(duì)接模擬以研究 Rub-CPT1A 復(fù)合物的結(jié)合模式。結(jié)果顯示，Rub 可能與 CPT1A 的 SER592、THR594 和 THR689 形成氫鍵網(wǎng)絡(luò)（圖 6K）。最后，在 shRNA 介導(dǎo)內(nèi)源性 CPT1A 敲低的 LX2 細(xì)胞中，將 SER592、THR594 和 THR689 系統(tǒng)性突變?yōu)楸彼幔㈦S后過(guò)表達(dá)野生型 CPT1A。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些位點(diǎn)突變顯著削弱了 Rub 對(duì) CPT1A 活性的抑制作用，提示 SER592、THR594 和 THR689 是 Rub 抑制 CPT1A 活性的關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)（圖 6L）。

為評(píng)價(jià) Rub 相較其他肝細(xì)胞類型對(duì) HSCs 的特異性，研究者在 150 μM 濃度下檢測(cè) Rub 對(duì) TGF-β1 活化 LX2 細(xì)胞、正常小鼠肝細(xì)胞（AML12）、LPS 極化小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞（iBMDM）以及 VEGF 刺激的人肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（HHSEC）中 CPT1A 活性的影響，并比較不同細(xì)胞間的活性抑制率。結(jié)果顯示，Rub 在 LX2 細(xì)胞中對(duì) CPT1A 活性的抑制效率顯著高于 AML12、iBMDM 和 HHSEC 細(xì)胞（補(bǔ)充材料圖 S5B-C）。同時(shí)，研究者檢測(cè)了 Rub 處理后肝組織中 CPT1A 的表達(dá)，結(jié)果顯示 Rub 可顯著降低 CCl4 誘導(dǎo)肝纖維化中的 CPT1A 蛋白水平（補(bǔ)充圖 S5D）。綜上，這些結(jié)果提示 CPT1A 是 Rub 在 HSCs 中的直接藥理靶點(diǎn)。

圖 6. Rub 直接靶向 CPT1A 的驗(yàn)證。（A）采用均方根偏差（RMSD）評(píng)價(jià) Rub-CPT1A 結(jié)合穩(wěn)定性。（B）均方根波動(dòng)（RMSF）。（C）模擬過(guò)程中的氫鍵數(shù)量。（D）旋轉(zhuǎn)半徑（Rg）。（E）溶劑可及表面積（SASA）。（F）自由能景觀（FEL）分析。（G、H）采用 CETSA 和 DARTS 實(shí)驗(yàn)檢測(cè) LX2 和 JS1 細(xì)胞中 CPT1A 的蛋白水平。（I）BLI 實(shí)驗(yàn)中 Rub 與 CPT1A 的結(jié)合動(dòng)力學(xué)。（J）Rub 對(duì) LX2 細(xì)胞中 CPT1A 活性的影響。（K）Rub 與 CPT1A 之間的分子對(duì)接模擬。（L）位點(diǎn)突變 LX2 細(xì)胞中 Rub 對(duì) CPT1A 活性的影響。所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行 n = 3 次獨(dú)立生物學(xué)重復(fù)。 < 0.05 vs Ctr 或 DMSO；*p < 0.05 vs TGF-β1 或 Rub-PROTAC。

Rub 通過(guò)靶向 CPT1A 誘導(dǎo)活化 LX2 細(xì)胞發(fā)生鐵死亡

基于此前關(guān)于 CPT1A 缺失可在肝纖維化過(guò)程中緩解 HSCs 活化，并可在腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)鐵死亡的報(bào)道，研究者推測(cè) CPT1A 同樣在誘導(dǎo)活化 HSCs 鐵死亡中發(fā)揮作用。為驗(yàn)證這一假設(shè)，研究者進(jìn)行了 CPT1A 活性抑制劑 Etomoxir 處理和 CPT1A 敲低實(shí)驗(yàn)，以探討 CPT1A 在 TGF-β1 誘導(dǎo) LX2 細(xì)胞中誘導(dǎo)鐵死亡的作用。首先，LX2 細(xì)胞用不同濃度 Etomoxir 培養(yǎng) 48 小時(shí)；結(jié)果顯示，在無(wú) TGF-β1 刺激的 LX2 細(xì)胞中，Etomoxir 對(duì)細(xì)胞活力無(wú)抑制作用，但在 50 和 100 μM 濃度下對(duì) TGF-β1 刺激的 LX2 細(xì)胞活力具有顯著抑制作用，尤其在 100 μM 時(shí)，細(xì)胞活力低于 80%（補(bǔ)充圖 S6A）。然而，F(xiàn)er-1 可消除 Etomoxir 介導(dǎo)的 LX2 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制（補(bǔ)充圖 S6B）。

隨后，研究者觀察到明顯的鐵死亡線粒體形態(tài)學(xué)改變；在 TGF-β1 刺激的 Etomoxir 處理 LX2 細(xì)胞中，NADPH 和 GSH 含量顯著下降，GSSG、LPO、ROS 和 Fe2+ 水平顯著升高（補(bǔ)充圖 S6C-E）。此外，在 TGF-β1 誘導(dǎo)的 Etomoxir 處理 LX2 細(xì)胞中，ACSL4 蛋白表達(dá)顯著升高，而 GPX4 蛋白表達(dá)顯著降低（補(bǔ)充圖 S6F）。如預(yù)期，在 TGF-β1 誘導(dǎo)的 LX2 細(xì)胞中，CPT1A 敲低結(jié)果與 Etomoxir 處理結(jié)果一致（補(bǔ)充圖 S6C-F）。

此外，磷脂是構(gòu)成細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的基本成分，可根據(jù)其頭基分為磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰絲氨酸（PS）、磷脂酰肌醇（PI）和磷脂酸（PA）。PL-PUFAs 是脂質(zhì)過(guò)氧化的主要底物，由 ACSL4 生成，被認(rèn)為是鐵死亡的驅(qū)動(dòng)因素。因此，研究者進(jìn)行了非靶向脂質(zhì)組學(xué)以分析 PL-PUFAs 的代謝狀態(tài)。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染 shCPT1A 的 LX2 細(xì)胞中，PL-PUFAs 水平升高，尤其是 PC-PUFAs、PE-PUFAs 和 PI-PUFAs（補(bǔ)充圖 S6G）。總之，這些數(shù)據(jù)提示阻斷 CPT1A 可誘導(dǎo)由代謝重編程介導(dǎo)的活化 HSCs 鐵死亡。

為驗(yàn)證 Rub 誘導(dǎo)活化 HSCs 鐵死亡是否由靶向 CPT1A 介導(dǎo)，研究者進(jìn)行 CPT1A 敲低實(shí)驗(yàn)，以探索 CPT1A 在 TGF-β1 誘導(dǎo) LX2 細(xì)胞中 Rub 誘導(dǎo)鐵死亡中的作用。如圖 7A-E 所示，在 TGF-β1 刺激的 LX2 細(xì)胞中，Rub 可明顯誘導(dǎo)鐵死亡線粒體形態(tài)變化，顯著降低 NADPH 和 GSH 含量，升高 GSSG、LPO、ROS、Fe2+ 和 PL-PUFAs 水平，同時(shí)增加 ACSL4 蛋白表達(dá)并抑制 GPX4 蛋白水平。隨后，研究者將靶向 CPT1A 的 shRNA 轉(zhuǎn)染入 TGF-β1 誘導(dǎo)的 LX2 細(xì)胞，再進(jìn)行 Rub 孵育。結(jié)果顯示，加入 shCPT1A 后，Rub 誘導(dǎo)鐵死亡的顯著變化被明顯消除（圖 7A-F）。換言之，Rub 未能進(jìn)一步加重 shCPT1A 轉(zhuǎn)染 LX2 細(xì)胞中的鐵死亡。

此外，研究者還評(píng)價(jià)了 CPT1A 過(guò)表達(dá)對(duì) Rub 誘導(dǎo)鐵死亡的影響。與 CPT1A 敲低結(jié)果類似，CPT1A 過(guò)表達(dá)同樣消除了 Rub 在 LX2 細(xì)胞中誘導(dǎo)鐵死亡的作用（補(bǔ)充材料圖 S7A-D）。這些數(shù)據(jù)表明，CPT1A 敲低和 CPT1A 過(guò)表達(dá)均可消除 Rub 誘導(dǎo) HSCs 鐵死亡的作用。綜上，這些結(jié)果證明 Rub 的鐵死亡誘導(dǎo)效應(yīng)依賴于 CPT1A 介導(dǎo)的代謝重編程。

圖 7. CPT1A 缺失對(duì) Rub 誘導(dǎo) TGF-β1 誘導(dǎo) LX2 細(xì)胞鐵死亡的影響。（A）LX2 細(xì)胞中 NADPH、GSH 和 GSSG 水平。（B、C）LX2 細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)變化（比例尺 = 200 μm）、LPO、ROS 和 Fe2+ 的熒光染色（比例尺 = 100 μm）。（D）LX2 細(xì)胞中 GPX4 和 ACSL4 的蛋白表達(dá)。（E、F）LX2 細(xì)胞中 PL-PUFAs 水平變化。所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行 n = 3 次獨(dú)立生物學(xué)重復(fù)。*p < 0.05 vs shNC。

Rub 通過(guò)靶向 CPT1A 調(diào)控 c-Myc 泛素化介導(dǎo)的 NRF2/GPX4 和 ACSL4/PL-PUFAs 通路

接下來(lái)，研究者繼續(xù)探索 Rub 如何通過(guò) CPT1A 在 HSCs 中誘導(dǎo)鐵死亡。已有報(bào)道顯示，靶向 CPT1A 可通過(guò)抑制 c-Myc 泛素化，調(diào)控 NRF2/GPX4 抗氧化系統(tǒng)和 ACSL4/PL-PUFAs 通路，從而介導(dǎo)代謝重塑并誘導(dǎo)肺癌干細(xì)胞鐵死亡。結(jié)合本研究上述結(jié)果，作者假設(shè) Rub 誘導(dǎo)鐵死亡與活化 HSCs 中 CPT1A 泛素化介導(dǎo)的 NRF2/GPX4 和 ACSL4/PL-PUFAs 通路密切相關(guān)。因此，研究者評(píng)價(jià)了 Rub 對(duì)這些通路的影響。

Western blot 結(jié)果顯示，Rub 處理的 TGF-β1 誘導(dǎo) LX2 細(xì)胞中 GPX4 和核 NRF2 蛋白水平降低，而 c-Myc 泛素化（Ub-c-Myc）、胞質(zhì) NRF2 和 ACSL4 蛋白水平升高（圖 8A），并伴隨 PL-PUFAs 水平升高（圖 7E）。隨后，研究者將靶向 CPT1A 的 shRNA 轉(zhuǎn)染入 TGF-β1 誘導(dǎo)的 LX2 細(xì)胞，以進(jìn)一步研究 CPT1A 在 Rub 調(diào)控 c-Myc 泛素化以及 NRF2/GPX4 和 ACSL4/PL-PUFAs 通路中的作用。Western blot 結(jié)果顯示，靶向 CPT1A 的 shRNA 顯著消除了 Rub 在 TGF-β1 誘導(dǎo) LX2 細(xì)胞中調(diào)控 c-Myc 泛素化以及 NRF2/GPX4 和 ACSL4/PL-PUFAs 通路的能力（圖 7E、圖 8C 和 D）。總之，研究結(jié)果證實(shí)，Rub 可通過(guò)促進(jìn) CPT1A 介導(dǎo)的 c-Myc 泛素化，并調(diào)控 NRF2/GPX4 和 ACSL4/PL-PUFAs 通路，在活化 HSCs 中誘導(dǎo)由代謝重編程介導(dǎo)的鐵死亡（圖 9）。

圖 8. Rub 對(duì) LX2 細(xì)胞中 c-Myc 泛素化介導(dǎo)的 NRF2/GPX4 和 ACSL4/PL-PUFAs 通路的影響。（A、B）Rub 和 Etomoxir 對(duì) LX2 細(xì)胞中 GPX4、ACSL4、核 NRF2、胞質(zhì) NRF2、c-Myc 泛素化和 c-Myc 蛋白水平的影響。（C、D）Rub 對(duì) LX2 細(xì)胞中 GPX4、ACSL4、核 NRF2、胞質(zhì) NRF2、Ub-c-Myc 和 c-Myc 蛋白水平的影響。所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行 n = 3 次獨(dú)立生物學(xué)重復(fù)。*p < 0.05 vs DMSO 或 shNC。

圖 9. Rub 通過(guò)靶向 CPT1A，在活化 HSCs 中誘導(dǎo)代謝重編程介導(dǎo)的鐵死亡，從而改善肝纖維化。在肝纖維化過(guò)程中，活化 HSCs 中 CPT1A 升高，可通過(guò)增強(qiáng) NRF2/GPX4 通路介導(dǎo)的抗氧化能力，并抑制 ACSL4 介導(dǎo)的 PL-PUFAs 生成，阻止活化 HSCs 發(fā)生鐵死亡。經(jīng) Rub 處理后，Rub 可通過(guò)靶向 CPT1A，在活化 HSCs 中誘導(dǎo)由代謝重編程介導(dǎo)的鐵死亡，從而改善肝纖維化；這一過(guò)程與 c-Myc 泛素化介導(dǎo)的 NRF2/GPX4 和 ACSL4/PL-PUFAs 通路調(diào)控密切相關(guān)。

【Citation】:Zhang, D., Tang, Q., He, X., Wen, C., Zhou, F., Wei, X., Wang, Z., Wang, J., Liu, W., Xu, Y., Jiang, Y., & Yin, H. (2026). Rubimaillin ameliorates liver fibrosis by triggering the ferroptosis of activated hepatic stellate cells through targeting CPT1A.International journal of biological sciences, 22(4), 2065–2084.

【貢獻(xiàn)】★★★★★

綜上，在本研究中，作者討論并證明 Rub 可在體內(nèi)和體外通過(guò)誘導(dǎo)代謝重編程介導(dǎo)的活化 HSCs 鐵死亡，從而有效改善肝纖維化。研究者利用 PROTAC 靶標(biāo)捕獲技術(shù)鑒定 CPT1A 為 Rub 的靶點(diǎn)，并通過(guò)計(jì)算機(jī)分子動(dòng)力學(xué)模擬、CETSA、DARTS、BLI 和位點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 Rub 可直接結(jié)合 CPT1A。

此外，研究者不僅證明 CPT1A 是誘導(dǎo)活化 HSCs 鐵死亡的重要調(diào)控因子，也證實(shí)其是 Rub 誘導(dǎo)鐵死亡的關(guān)鍵靶點(diǎn)。進(jìn)一步結(jié)果顯示，Rub 通過(guò)靶向 CPT1A 在活化 HSCs 中誘導(dǎo)代謝重編程介導(dǎo)的鐵死亡，這可能與 c-Myc 泛素化介導(dǎo)的 NRF2/GPX4 和 ACSL4/PL-PUFAs 通路有關(guān)。然而，本研究也存在一定局限性，尤其是關(guān)于 Rub 通過(guò) CPT1A 介導(dǎo)對(duì) HSCs 的特異性靶向驗(yàn)證，仍需要利用體內(nèi) HSCs 特異性 CPT1A 敲除模型進(jìn)一步確認(rèn)。

總之，Rub 可通過(guò)靶向 CPT1A 誘導(dǎo)代謝重編程介導(dǎo)的活化 HSCs 鐵死亡，從而改善肝纖維化，為肝纖維化治療提供了一種有前景的策略。

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