《ACS Nano》西南醫大蔡蕊/趙丹/陶剛團：活性氧響應水凝膠改善骨缺損局部免疫微環境！

前言

糖尿病（DM）是一類以慢性高血糖為特征的代謝性疾病。在糖尿病狀態下，由于高血糖引發的氧化應激、慢性炎癥以及免疫-成骨級聯反應的失調，骨缺損修復過程面臨著明顯的障礙。

骨髓間充質干細胞（BMSCs）的線粒體穩態在維持能量代謝和骨再生平衡中起著核心作用。因此，通過調節免疫微環境來恢復BMSCs的線粒體穩態和成骨潛力，是實現糖尿病骨缺損修復的有效干預策略。

近期，西南醫科大學蔡蕊、趙丹及陶剛團隊合作在國際頂級學術期刊《ACS Nano》上發表了最新研究成果。該工作受傳統建筑結構“草筋泥”的啟發，構建了一種負載多酚類納米顆粒的活性氧（ROS）響應性復合水凝膠（EM@mSF-AP）。在糖尿病大鼠模型中，該水凝膠有效改善了骨缺損局部的免疫微環境，促進了血管生成，并加速了新骨的形成。

背景介紹

糖尿病對骨組織的影響是復雜多面的，主要涉及氧化應激、免疫失調以及血管生成和骨再生功能的受損。巨噬細胞在免疫-成骨級聯反應中起著關鍵調節作用，主要負責介導炎癥期向組織修復期的平穩過渡。然而，長期的血糖異常會加劇巨噬細胞內的氧化應激并導致其極化狀態失衡。

這種由巨噬細胞介導的微環境功能障礙，會通過旁分泌信號進一步損害BMSCs的線粒體穩態，抑制其抗氧化防御系統和正常的能量代謝過程，最終削弱其成骨分化潛力，阻礙骨的再生。

現有的骨修復材料在應對上述復雜病理挑戰時，往往缺乏對微環境的特異性響應能力，且機械性能難以與骨愈合的長時間動態過程相匹配。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）和二甲雙胍（Met）已被證實具有良好的清除自由基和調節線粒體功能的作用，但單獨應用面臨體內半衰期短的問題。因此，開發一種兼具微環境響應性、機械穩定性與多靶點生物活性的遞送系統對糖尿病骨缺損修復具有重要意義。

創新點

1.基于“草筋泥”仿生結構強化水凝膠的機械力學性能。研究引入了表面礦化摻鍶羥基磷灰石的絲素蛋白短纖維（mSF）作為增強相（模擬“草”的支撐作用），與苯硼酸修飾的海藻酸鹽及聚乙烯醇交聯形成的水凝膠基質（模擬“泥”的填充作用）相結合。該結構利用纖維的物理纏結，不僅提升了水凝膠的抗壓性能，還賦予了材料更穩定的藥物緩釋能力。

2.靶向微環境的ROS智能響應釋放機制。水凝膠基質基于動態硼酸酯鍵交聯形成。在糖尿病骨缺損處特有的高ROS微環境中，硼酸酯鍵會發生響應性斷裂，促使水凝膠內部負載的EGCG-Met納米顆粒（EM NPs）得以釋放，實現了針對病理環境的按需給藥。

3. “免疫調節-線粒體穩態”的級聯修復通路。材料釋放的EM NPs通過清除巨噬細胞內的過量ROS，促使其向促修復的M2型極化。這一過程啟動了良性的免疫-成骨級聯調節：通過上調BMSCs中Sod2-Cat軸的表達增強內源性抗氧化能力，恢復線粒體膜電位，并上調ATP合成關鍵酶COX IV，從而系統性地重建了BMSCs的能量代謝與成骨功能。

研究結果

圖1與圖2：EM NPs及復合水凝膠的合成與理化特性表征。研究人員通過分子自組裝技術合成了粒徑均勻（平均直徑約348 nm）、具有較高負表面電位的EM NPs。傅里葉變換紅外光譜（FTIR）和X射線光電子能譜（XPS）等測試證實了EGCG與二甲雙胍通過席夫堿反應成功發生結合。這一結果證明實驗成功制備了具有穩定分散性和清除自由基潛力的納米載體，為后續構建響應性體系奠定了基礎。

圖3：仿生水凝膠的機械抗壓性能與病理微環境響應特性。在水凝膠基質中摻入礦化絲素蛋白短纖維（mSF）后，壓縮抗阻測試顯示其物理承壓能力獲得提升。體外藥物釋放曲線表明，復合水凝膠在含有過氧化氫的模擬病理介質中，其降解速度和EM NPs釋放量均明顯高于中性環境。這證明了引入“草筋泥”的仿生結構設計，既滿足了骨缺損填充所需的物理支撐強度，又賦予了材料針對氧化應激環境進行化學響應釋放的特性。

圖4至圖6：體外巨噬細胞抗氧化保護與極化表型調節。通過DCFH-DA與MitoSox探針熒光成像發現，該水凝膠能明顯降低氧化應激條件下巨噬細胞內的總ROS和線粒體ROS水平，并通過JC-1探針證實其有助于恢復線粒體膜電位。流式細胞術與免疫熒光分析顯示，處理后的巨噬細胞中促炎M1型標志物（iNOS、CD86）表達下降，而促修復M2型標志物（CD206）表達上升。該結果推導得出：水凝膠釋放的活性多酚成分能有效緩解巨噬細胞的氧化損傷，并成功誘導免疫細胞向有利于組織再生的M2表型轉化。

圖7至圖10：BMSCs的轉錄組學分析及線粒體能量代謝恢復。將極化調節后的巨噬細胞與BMSCs進行共培養。對BMSCs的RNA測序（RNA-seq）分析表明，氧化磷酸化、抗氧化防御及TCA循環等通路發生了顯著富集。蛋白與生化檢測進一步證實，BMSCs中Sod2、Cat以及COX IV等關鍵酶的表達上升，ATP產率恢復；相應的成骨標志物（Runx2、OPN、ALP）水平及鈣結節沉積量均有增加。該部分實驗證明，經材料干預的巨噬細胞通過旁分泌途徑，系統性修復了BMSCs受損的線粒體能量代謝和抗氧化防御網絡，從而有效提升了干細胞的成骨分化潛能。

圖11至圖13：活體糖尿病大鼠顱骨缺損修復的療效評估。在糖尿病大鼠顱骨缺損模型中，經過4周和10周的觀察，微CT（Micro-CT）定量掃描顯示，植入EM@mSF-AP復合水凝膠的缺損區域內新骨體積（BV/TV）和骨密度（BMD）均顯著增加。H&E和Masson染色確認了組織形態的重建與膠原纖維的成熟。局部組織切片的免疫熒光染色結果表明，材料在活體內有效促進了巨噬細胞M2極化、促進了血管新生（CD31陽性），并上調了BMSCs線粒體功能蛋白（COX IV）和成骨相關蛋白的表達。這些在體數據直觀地驗證了該水凝膠材料能夠在體內高糖環境中有效調節局部免疫微環境，促進血管化成骨并加速缺損骨的愈合過程。

機理闡釋

EM@mSF-AP復合水凝膠促進骨再生的療效，依賴于材料化學解離與細胞級聯信號傳遞的協同作用機制。

首先，在材料層面，該系統利用了糖尿病組織微環境中固有的異常高水平ROS作為藥物釋放的觸發開關。病灶處高濃度的H2O2與水凝膠交聯網絡中的動態硼酸酯鍵發生反應，導致B-C鍵發生氧化斷裂，使致密的水凝膠網絡產生降解。這一原位響應解離過程使得封裝的EM NPs以及富含Sr2+和Ca2+的mSF降解產物得以定點釋放 。

其次，在免疫調節層面，釋放的EM NPs利用EGCG分子中多酚羥基的高還原性，發揮直接的中和作用以清除過量的ROS。氧化應激的減輕保護了巨噬細胞的線粒體功能，驅動其細胞表型由分泌促炎因子的M1型轉變為分泌促修復因子的M2型 。

最后，在細胞通訊與代謝層面，巨噬細胞表型的轉變啟動了免疫細胞與成骨細胞間的旁分泌信號級聯。該信號作用于周圍的BMSCs，激活了其內部的Sod2-Cat抗氧化軸，緩解了高糖環境對線粒體呼吸鏈的抑制。線粒體膜電位的恢復與COX IV酶表達的上調，使得細胞ATP合成重新活躍。在獲得充足能量代謝支持的基礎上，結合mSF釋放的Sr2+/Ca2+所提供的直接成骨和血管生成刺激，BMSCs的成骨分化程序被全面激活，進而推動缺損骨組織的高效修復。

全文小結

1.該工作提出了一種受“草筋泥”建筑結構啟發的礦化絲素短纖維增強復合水凝膠（EM@mSF-AP），解決了常規環境響應性水凝膠在骨修復應用中物理機械支撐強度不足，以及糖尿病微環境中由于持續氧化應激導致的骨修復停滯等問題。

2.研究證明，該水凝膠作用機理在于利用硼酸酯鍵在ROS環境下的斷裂實現按需釋放活性納米顆粒。釋放的藥物通過清除自由基促使局部巨噬細胞發生M2極化，并借由免疫-成骨級聯通訊機制，激活BMSCs的Sod2-Cat抗氧化軸和COX IV蛋白表達，從而重塑了成骨干細胞的線粒體穩態與能量代謝網絡。

3.該研究的意義在于，其將材料物理結構的仿生設計與細胞代謝通路的微觀重編程相結合。該技術平臺不僅能夠有效地促進糖尿病相關的骨再生修復，也為未來設計基于免疫微環境調節和細胞器穩態恢復的先進生物材料干預策略提供了客觀、科學的參考思路。

參考文獻：DOI：10.1021/acsnano.6c02616