水務熱點 | 張嵐團隊：實時熒光定量PCR在水源性致病微生物檢測中的應用

導語

【 目的 】 水是維持生命活動的關鍵物質基礎，其質量直接影響生態平衡與人類健康。水源受致病微生物污染引起的水源性疾病嚴重威脅全球公共衛生安全，因此，快速準確檢測致病微生物對水質安全至關重要。【 方法 】 文章綜述熒光定量聚合酶鏈式反應(quantitative PCR,qPCR)在水源性致病微生物檢測中的應用，整合qPCR技術在水源性致病微生物檢測中的關鍵案例與試驗數據,探討其技術優勢、現存挑戰及未來發展方向，為水質安全檢測提供理論支持。 【 結果 】 qPCR基于熒光信號動態監測與循環閾值 ( C t ) 定量分析，顯著提升水源性致病微生物檢測的靈敏度和檢測速度。在細菌檢測中，qPCR可以對靶向細菌特異性基因實現快速定量；對病毒及原蟲可以縮短檢測周期同時提升通量。并且該方法適用于飲用水、廢水及娛樂用水等不同水體的水質檢測，但面臨區分活菌、死菌，應對抑制劑干擾以及優化引物設計等挑戰。 【 結論 】 qPCR憑借高靈敏、檢測快速及適應性廣的優勢，成為水質安全檢測的核心工具。新興技術進一步提升了檢測精度與效率，數字PCR(dPCR)無需標準曲線即可實現絕對定量，多重qPCR(mPCR)通過多靶標同步分析進一步降低檢測成本。未來需要推動多技術聯用、開發自動化檢測平臺及制定國際標準化操作流程，以應對復雜水體環境的大規模檢測需求，為全球水安全提供更高效的技術支撐。

【引文格式】

張星宇, 周婉婷, 邢方瀟, 等.實時熒光定量PCR 在水源性致病微生物檢測中的應用[J].凈水技術, 2025, 44(9): 10-20.

ZHANG X Y, ZHOU W T, XING F X, et al.Application of real-time quantitative PCR in determination of water-borne pathogenic microorganisms[J]. Water Purification Technology, 2025, 44(9): 10-20.

通信作者

張嵐

中國疾病預防控制中心環境所水質量與健康監測室主任、研究員/《凈水技術》期刊編委

中國營養學會飲水與健康分會副主任委員,中華預防醫學會衛生檢驗專業委員會副主任委員,中國地理學會醫學地理專業委員會副主任委員,中國學生營養與健康促進會學校飲水與環境健康分會副主任委員,中華醫學會地方病學分會常務委員,北京理化分析測試學會副理事長,第八屆國家學校衛生標準化專業委員會委員,第二屆全國飲料標準化技術委員會委員,國家健康科普專家庫成員,涉水產品評審專家。從事飲水與健康、飲水檢驗技術、消毒技術等方面研究工作。主持/參與《飲用天然礦泉水標準檢驗方法》《生活飲用水衛生標準》《生活飲用水標準檢驗方法》等多項國家標準,主持/參與多項國家科技重大專項、重點研發、科技支撐項目;負責“全國飲用水中抗生素、全氟化合物、高氯酸鹽、鹵代苯醌、微塑料等新污染物地理分布特征及健康風險評估”“國家城市飲用水衛生監測”“全國城市供水水質普查”等全國性項目的運行及技術支撐;參與《全國城市飲用水衛生安全保障規劃》等國家規劃的編制。獲得國家科技進步二等獎等各類科技獎項7項,發表論文200余篇,主編/參編書籍10余本。

水是地球上生命得以延續的最重要的自然資源之一，水質安全直接關系到全球公共衛生。水中的微生物如細菌、病毒和原蟲等致病微生物是介水傳染病傳播的重要因素，并且水源性致病微生物已在淡水、生活用水及娛樂用水等水體中檢出。水源性疾病在世界范圍內已造成嚴重的發病率和死亡率，成為重要的公共衛生問題。在美國，水源性致病微生物(包括13種細菌、1種病毒和2種原蟲)導致每年約715萬人患病，11.8萬人住院治療，6630人死亡，直接醫療保健費用為3.33億美元。世界衛生組織(World Health Organization,WHO)估計每年約有443832名5歲以下兒童以及50851名5～9歲兒童死于腹瀉，腹瀉疾病多數是由糞便污染的水源所導致。為緩解這一公共衛生事件造成的影響，WHO、美國環保署(EPA)、歐盟、我國以及其他相關國家制定了水源性致病微生物的具體衛生標準限值。

目前，水源性致病微生物的檢測主要以選擇性培養和濾膜法、多管發酵法及免疫磁分離熒光抗體法等標準生化方法為主。在選擇性培養過程中可能會出現菌落的缺失，存在進入活的但不可培養(viable but non-cultureable,VBNC)狀態的細胞。傳統方法還存在檢測到的細胞種類無法精確定位的問題，如濾膜法需借助血清學鑒定和分子生物學鑒定來確定細胞種類，多管發酵法要通過革蘭氏染色及鏡檢和生化鑒定試驗明確細胞種類，額外步驟增加了檢測的復雜性和工作量。此外，傳統方法非常耗時，像大腸埃希氏菌使用傳統濾膜過濾培養和生化鑒定需48～72h，諾如病毒用細胞培養聯合電鏡檢查需要2～4周，賈第鞭毛蟲使用免疫熒光染色鏡檢方法需24h以內的時間。分子檢測技術的引入，改善和簡化了環境中微生物的檢測和鑒定。自1985年，聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)作為應用最廣泛的核酸擴增方法，在微生物的鑒定中發揮了重要作用，它克服了傳統方法檢測速度慢等問題，實現了對特定核酸的快速擴增。隨著技術的不斷發展，在PCR基礎上發展而來的定量聚合酶鏈式反應(quantitative PCR,qPCR)展現出了更多優勢。研究表明，qPCR不僅檢測速度快，還具有靈敏度、準確度、特異性高，動態范圍寬和適用范圍廣等特點，該方法適用于水源性致病微生物特異性遺傳標記的定量測定，為水源性致病微生物檢測提供了更高效、可靠的手段。文章系統總結了qPCR在水源性致病微生物檢測中的應用，綜述其原理、挑戰及未來發展方向。

1 q-PCR技術原理與檢測流程

qPCR是一種通過實時監測脫氧核糖核酸(DNA)擴增過程中熒光信號積累以實現核酸定量的分子技術，其核心在于熒光標記物與擴增產物的動態關聯。與傳統PCR相比，qPCR通過引入熒光染料(如SYBR Green I)或序列特異性探針(如TaqMan探針),可在每個循環中直接捕獲DNA合成量，從而建立初始模板濃度與擴增曲線循環閾值(Ct)的對數線性關系。Ferdous等通過靶向霍亂弧菌的

ctx

qPCR檢測水源性致病微生物主要包括樣本預處理(如濾膜富集低豐度病原體、離心去除顆粒物)、核酸提取與純化、引物/探針設計、擴增及數據分析5個環節。針對RNA病毒，需額外增加逆轉錄步驟生成cDNA，并優化RNA保護策略。擴增曲線分析需關注基線期、指數期與平臺期三階段，閾值通常設定為基線熒光信號標準差的10倍，以規避背景噪聲對Ct值判讀的干擾。圖1為qPCR檢測流程圖。

圖1 qPCR檢測流程

2 q-PCR 在水源性致病微生物檢測中的應用

2.1

常見水源性致病微生物檢測

隨著水傳播疾病風險的增加，qPCR技術憑借其高靈敏度和快速檢測能力，被廣泛應用于檢測水體中細菌、病毒和原蟲。

2.1.1 細菌

水體中致病細菌是引發腹瀉、霍亂、痢疾及皮膚和組織感染等疾病的主要病原體。根據《生活飲用水標準檢驗方法 第12部分:微生物指標》(GB/T 5750.12—2023)，生活飲用水中的微生物主要通過培養法檢測，《飲用水中軍團菌檢測》(SN/T 2528—2010)規定，飲用水中軍團菌的主要檢測方法包括培養法、分子生物學技術及血清學鑒定。傳統方法雖可靠性高，但耗時較長，難以滿足快速檢測需要。qPCR可以通過靶向種屬特異性基因實現快速定量，顯著縮短檢測時間。Walker等開發的ybbW基因qPCR法可在6 h內完成檢測，對大腸氏埃希菌的特異度和靈敏度達100%。為提高低豐度菌檢出率，超濾或免疫磁珠分離可將檢測靈敏度提升10～100倍；Wu等通過超濾qPCR聯用技術，在4～8 h內完成廢水中沙門氏菌的檢測。

2.1.2 病毒

水傳播腸道病毒因其體積小、感染劑量低及環境抗性強，對人類健康構成威脅。雙鏈DNA(dsDNA)病毒因DNA結構穩定性較強，可在水體中存活數周；單鏈DNA(ssRNA)通過頻繁的基因重組可以維持高傳染性。無包膜病毒因為缺乏脂質外層，對氯消毒的抗性高于包膜病毒，增加了處理難度。現行檢測方法

EPA

Method

1615

2.1.3 原蟲

隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲是引發人體腹瀉以及水源性疾病暴發的常見病原體。現行檢測方法

EPA

Method

1622

2.1.4 小結

使用qPCR檢測水源性致病微生物的優點是檢測的靈敏度與檢測效率高，檢測周期短，使用聯用技術可實現高通量檢測。該方法的局限性在于無法有效區分活菌、死菌，易受復雜基質中抑制劑干擾以及引物設計冗余或脫靶風險等。表1為常見水源性致病微生物檢測方法的比較。

表1 常見水源性致病微生物檢測方法比較

2.2

不同水體環境中的應用

2.2.1 飲用水

飲用水中存在的致病微生物可能是通過水源污染、水廠消毒不徹底或管網二次污染等途徑進入供水系統引發水源性疾病。qPCR通過特異性引物或探針，可在4～6 h內實現病原體絕對定量，靈敏度較傳統方法提升1～2個數量級。Wang等證實qPCR對銅綠假單胞菌檢出限低至2 CFU/L。使用RT-qPCR或qPCR結合免疫磁珠富集可將輪狀病毒和賈第鞭毛蟲檢測周期從數周縮短至5 h。在實際應用中，飲用水中的雜質，如腐植酸、金屬離子等，可能會抑制PCR反應；飲用水余氯消毒可能降解病原體DNA，導致qPCR假陰性。研究人員需要采用合適的核酸提取方法，去除雜質的干擾，同時優化PCR反應體系，提高反應的穩定性。

2.2.2 廢水與污水處理廠

廢水與污水處理廠是水源性致病微生物檢測的關鍵節點，其進水主要來源于生活污水、醫療廢水、農業徑流及工業排放，攜帶細菌、病毒、原蟲等多類病原體。Wang等使用qPCR檢測瑞典哥德堡Rya污水處理廠檢出出水中諾如病毒GⅡ型高達1×105 L-1,而傳統細胞培養法因病毒失活無法檢出。針對隱孢子蟲等原蟲，qPCR結合免疫磁珠富集將檢測限降至1 oocysts/(10 L)，較傳統顯微鏡法靈敏度提升100倍。 腐植酸、重金屬及多酚類物質等污水復雜基質可抑制qPCR擴增效率，需通過硅膠膜純化或添加聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone,PVP)改善；病毒基因組重組可能導致引物脫靶，需定期更新靶標設計。Maestre-Carballa等比較了dPCR和qPCR發現，dPCR可以估計拷貝基因的絕對豐度，通過微滴分區實現絕對定量，有更高的靈敏度和精密度，以及更好的抗抑制劑能力，并且無需校準曲線。

2.2.3 其他水體

除飲用水與廢水外，海水及娛樂用水同樣是水源性致病微生物傳播的重要媒介。 Saleem等使用qPCR檢測娛樂用水中的腸球菌，檢測時間縮短至3.5～4.0 h，并且降低檢測結果為假陽性的概率。An等開發并驗證了一種高靈敏度和高特異性HT-qPCR方法，能夠同時對33種人類病原體的68個標記基因以及10種宿主的23種糞便標記物進行定量分析并成功應用于我國廈門海洋娛樂用水樣本中病原體和糞便污染情況的調查。

2.2.4 小結

qPCR在檢測不同水體環境時，具有高靈敏度和高特異性，顯著提升水源性致病微生物的檢測效率。其局限性在于易受復雜基質干擾、需定期更換引物等。改進方向可以結合dPCR提升抗干擾能力與絕對定量精度，優化核酸提取流程，如硅膠膜純化，以及推動標準化操作以增強不同實驗室的檢測可比性與可靠性。表2為不同水體中水源性致病微生物檢測技術的比較。

表2 不同水體中水源性致病微生物檢測技術比較

3 技術挑戰與優化策略

3.1

活菌與死菌的區分

已證明單疊氮化丙啶(propidium monoazide bromide,PMA)和qPCR的組合可有效定量各種微生物中的活細菌 。PMA基于膜完整性的選擇性染色來檢測活細胞,可以從死細胞的DNA擴增中排除假陽性 。Deshmukh等 評估了PMA-qPCR從死細胞中區分活的大腸桿菌O157:H7和大腸桿菌MTCC 3221菌株的潛力，結果表明死細胞的DNA擴增幾乎完全被抑制，并且PMA-qPCR測定能夠檢測低至7 fg大腸桿菌DNA。

3.2

抑制劑干擾與靈敏度提升

環境樣品中存在的腐植酸、黃腐酸、酚類化合物、重金屬和螯合劑等抑制劑會對qPCR產生干擾并降低檢測的靈敏度。解決抑制問題是防止定量水平降低和減少假陰性的關鍵。評估目標基質中是否存在抑制劑，可以進行內部或外部擴增對照或稀釋曲線。EPA推薦的常用外源DNA對照是鮭魚睪丸DNA，它需要加標已知濃度的外源DNA靶標量化豐度，確定抑制對檢測和定量的影響程度。Cao等使用qPCR檢測環境水樣中的腸球菌時沒有準確量化抑制因素，導致目標報告不準確。根據DNA提取物中靶基因拷貝的預期變異性和豐度，可針對樣品的一個子集或者全部樣品來開展稀釋曲線的繪制工作。如果抑制起作用，可以選擇最佳稀釋度，也可以在qPCR反應中添加蛋白酶抑制劑、甲酰胺或牛血清白蛋白等補充劑增強擴增。

3.3

引物設計與假陽性控制

確保qPCR檢測成功需驗證引物以及標準品的準確性，還要依據參考文獻 對檢測性能進行優化。參數沒有得到足夠優化可能導致靶標的非特異性擴增或定量不足，從而導致結果不準確 。為了在qPCR分析過程中獲得特定靶基因，提高測量的準確性，正確設計相應引物是重要因素 。Perez-Bou等 用計算機模擬方式設計了1對靶向 aadA 、 aadB 、 ampC 、 bla SHV 、 bla TEM 、 dfrA 1、 ermB 、 fosA 、 mecA 、 qnrS 和 tetA ( A )基因的新引物組，滿足開發針對qPCR引物的嚴格要求，新引物對和qPCR方案的驗證表明，這些引物具備好的靶標特異性，較高的PCR效率以及寬的線性動態范圍。在靈敏度方面，新引物具有較低的檢測限與定量限值，檢測過程中體現出良好的重現性，能夠確保檢測結果的可靠性與一致性，在極低靶標DNA濃度的樣品中也有很好的穩定性。

4 未來發展方向

4.1

技術創新

4.1.1 dPCR

dPCR是一種對靶核酸進行絕對定量的新型方法。dPCR的定量原理基于分子在大量分區內的隨機分布，這種分布遵循泊松分布規律。在dPCR檢測過程中，每個分區都可被視作一個獨立的PCR微反應器。通過熒光檢測技術，能夠精準識別包含擴增靶序列的分區。依據泊松分布的特性，確定PCR陽性分區在總分區中的占比，精確測定靶序列的濃度，無需依賴傳統的校準步驟。學者將dPCR作為第三代PCR工具，量化水生和陸地生態系統中的微生物。

與qPCR相比，dPCR精度更高、對低拷貝數檢測的靈敏度更高，不需要標準曲線以及對抑制劑耐受性高。在定量檢測廢水中微生物時，許多研究對于檢測痕量水平存在的病原體建議使用dPCR，通過dPCR獲得定量限，效果顯著，表明其在廢水檢測中的潛在有用性。缺點是使用dPCR可能會延長處理時間和增加成本。dPCR因制備與處理流程耗時較長、分區不均，導致假陽性或假陰性風險升高，受限于儀器成本高昂及單個樣本需分割為高密度反應單元，致使總體應用成本高于常規qPCR技術。使用dPCR進行常規微生物水質檢測可能會受成本的限制，在現階段可能不切實際。

4.1.2 微滴式數字聚合酶鏈式反應(droplet digital PCR,ddPCR)

ddPCR是dPCR的子類別，具有更高的檢測精度和高通量分析能力，對標準曲線或內參基因的依賴度低，適用于低豐度目標物檢測。ddPCR在PCR擴增之前將DNA模板分成許多水油乳液液滴，最終的信號讀取在PCR到達擴增終點時進行。ddPCR可定量檢測水樣中人畜共患細菌病原體，如沙門氏菌屬、空腸彎曲菌和單核細胞增生李斯特菌；檢測河流沉積物中低濃度的沙門氏菌。Falzone等使用ddPCR在實驗室環境中模擬水熱處理過程快速檢測嗜肺軍團菌，結果表明，ddPCR能夠準確檢測低濃度的嗜肺軍團菌，與RT-qPCR相比，具有更高的準確性和靈敏度，可以快速檢測并避免可能的軍團病暴發。ddPCR在靈敏度、精度和可重復性方面優于傳統定量PCR，不容易受到PCR抑制劑的影響，并且無需標準曲線即可進行絕對定量。一旦整個操作系統和化學試劑的成本大幅降低，樣品的處理能力或檢測通量和動態范圍得到極大提升，這項技術就可以更廣泛地應用于環境研究。

4.1.3 mqPCR

mqPCR在同一反應體系中設計多組熒光標記探針，單次反應可同步檢測4～6種靶標。 Zhang等結合3個qPCR引物探針組開發優化三重qPCR檢測，該方法同時檢測廢水中空腸彎曲桿菌、大腸彎曲桿菌和拉氏彎曲菌。Li等將mqPCR技術與PMA相結合，在一個反應中同時檢測水樣中活的嗜肺軍團菌、鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌，應用月桂酰肌氨酸鈉增強PMA對死菌通透性，結果表明，具有相當的特異性和靈敏度并且縮短了檢測時間。

mqPCR通過在一次運行中結合多個qPCR反應，顯著提高檢測通量，節省檢測時間和減少成本。但采用此方法時需要注意引物相互作用的可能性高，對引物特異性和所有引物對的兼容性要求高。嚴格的檢測設計和充分的優化對于mqPCR應用于環境調查至關重要。

4.1.4 小結

dPCR與ddPCR通過絕對定量、高精度及抗抑制劑能力，突破了qPCR依賴標準曲線的局限，但高成本與耗時處理限制其廣泛應用；mqPCR通過多靶標同步檢測顯著提升通量，但引物設計復雜度高,易引發交叉反應。未來需結合技術優勢，以ddPCR提升低豐度目標檢測可靠性，mqPCR優化高通量篩查效率，同時推動設備微型化與成本降低，構建多技術聯用體系，并制定標準化流程，以平衡精準性、效率與經濟性，滿足復雜水體的動態監測需求。表3比較了不同PCR的作用機制及優缺點。

表3 不同PCR 方法作用機制及應用特性比較

4.2

標準化與政策推動

不同實驗室在qPCR試驗操作、引物探針設計、結果分析等環節存在差異，導致數據可比性差。國內外相關組織正積極推動標準化進程。國際標準化組織制定了《分子生物標志物分析 農業和食品生產中分子生物標志物分析方法的詞匯表》(ISO 16577:2022)，規定了qPCR術語、試驗流程、性能指標等；《水質 用定量聚合酶鏈反應(qPCR)濃縮和基因擴增法檢測和定量軍團菌和/或嗜肺軍團菌 第2部分:現場方法》(ISO/TS 12869—2:2024)中規定了使用qPCR對軍團菌屬和嗜肺軍團菌進行現場檢測和定量的技術要求。我國也依據國情，出臺了針對水源性微生物檢測的國家標準，如《實時熒光定量PCR儀性能評價通則》(GB/T 42753—2023)；《循環冷卻水中軍團菌的檢測》(GB/T 40392—2021)規定了循環冷卻水中軍團菌qPCR檢測方法，包括水樣采集、保存、運輸，核酸提取，qPCR擴增及結果判定等流程。這些標準化側重于使用qPCR檢測軍團菌，缺少使用qPCR檢測其余水源性致病微生物的標準，需要相關組織和機構加快制定針對其余水源性致病微生物的qPCR檢測標準，進一步完善水體微生物檢測的標準體系，提升檢測結果的準確性、可靠性和一致性。

5 結論

qPCR在檢測水源性致病微生物領域具有重要價值。它基于熒光信號與DNA擴增動態關聯原理，通過精準測定Ct值實現對初始模板的定量分析，依據熒光標記物作用方式的差異，在水源性致病微生物檢測中發揮不同作用。在常見水源性致病微生物檢測方面，qPCR展現出顯著優勢。針對細菌，能靶向特異性基因快速定量，克服傳統培養法的弊端；檢測病毒時，對雙鏈DNA病毒和單鏈RNA病毒都有高靈敏度和特異性，mqPCR技術的出現提升了檢測通量。對于原蟲，可檢測到極低濃度的原蟲DNA，HT-qPCR技術提高了檢測效率，縮短檢測時間。在不同水體環境中，qPCR檢測飲用水時實現高靈敏度，在廢水與污水處理廠以及娛樂用水的檢測中也發揮關鍵作用。對于區分活菌、死菌，應對抑制劑干擾以及優化引物設計等挑戰，研究人員積極探索優化策略，PMA-qPCR技術有效解決了活菌與死菌區分的難題；通過內部或外部擴增對照、稀釋曲線評估抑制劑影響，并采取添加補充劑等措施提升檢測靈敏度；設計特異性引物則有效控制了假陽性問題。

dPCR、ddPCR以及mqPCR等新興技術展現出巨大潛力。dPCR精度高、對低拷貝數檢測靈敏且無需標準曲線；ddPCR檢測精度更高，適用于低豐度目標物檢測；mqPCR提高了檢測通量，節省時間和成本。盡管這些新技術目前存在成本高、引物設計要求嚴格等局限，但隨著技術的不斷發展和完善，有望在水源性致病微生物檢測領域得到更廣泛應用，為保障水體安全和公共衛生提供更強大的技術支撐。

本文來源于《凈水技術》2025年第9期“凈水技術前沿與熱點綜述”欄目，內容略有刪減，原標題為《實時熒光定量PCR在水源性致病微生物檢測中的應用》，作者張星宇,周婉婷,邢方瀟,張 嵐*(中國疾病預防控制中心環境與健康相關產品安全所,傳染病溯源預警與智能決策全國重點實驗室,北京 100050)。

來源：本文源自《凈水技術》2025年第9期“凈水技術前沿與熱點綜述”欄目。

排版：李佳佳

校對：李佳佳

審核：阮辰旼

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