Cell Death Dis｜瞄準(zhǔn)MYC驅(qū)動(dòng)TNBC合成致死弱點(diǎn)：EphB4抑制壓低PSMB5，聯(lián)合Bcl-2阻斷誘導(dǎo)腫瘤退縮！(張衛(wèi)東/欒鑫/孫哲—上...

2026年6月26日，上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥功能成分發(fā)現(xiàn)與利用全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、上海中醫(yī)藥大學(xué)交叉醫(yī)藥研究院、曙光醫(yī)院，聯(lián)合廣東藥科大學(xué)、德國(guó)馬克斯·普朗克多學(xué)科科學(xué)研究所、海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院等單位，在Cell Death & Disease（中科院升級(jí)版生物學(xué)1區(qū) Top，JCR Q1，Journal Impact Factor=12.2）在線發(fā)表題為 “EphB4 inhibition defines a druggable synthetic-lethal vulnerability in MYC-driven triple-negative breast cancer” 的研究論文。該文通訊作者為孫哲、張衛(wèi)東和欒鑫；該文于2026年1月15日投稿，2026年5月19日修回，2026年6月12日接收。

該研究聚焦三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）中 MYC 高表達(dá)但難以直接藥物靶向這一治療難點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)受體酪氨酸激酶 EphB4 是 MYC 驅(qū)動(dòng)腫瘤中一個(gè)可藥物干預(yù)的合成致死弱點(diǎn)。研究顯示，無(wú)論通過遺傳敲低還是藥物抑制 EphB4，均可選擇性誘導(dǎo) MYC 激活細(xì)胞和 MYC 高表達(dá) TNBC 細(xì)胞發(fā)生顯著凋亡，而對(duì) MYC 低表達(dá)細(xì)胞影響較小。機(jī)制上，EphB4 抑制會(huì)選擇性下調(diào)蛋白酶體 β5 催化亞基 PSMB5 的轉(zhuǎn)錄，削弱蛋白酶體活性，破壞 MYC 高表達(dá)細(xì)胞對(duì)蛋白穩(wěn)態(tài)維持的高度依賴，最終誘導(dǎo) MYC 依賴性凋亡。更重要的是，該凋亡過程不依賴 p53，并對(duì) Bcl-2 抑制敏感；聯(lián)合 EphB4 抑制劑與 Bcl-2 抑制劑 ABT-199 可在 TNBC 模型中產(chǎn)生協(xié)同促凋亡作用并誘導(dǎo)腫瘤退縮。

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【摘 要】

MYC 癌蛋白可驅(qū)動(dòng)多種癌癥表現(xiàn)出侵襲性腫瘤行為，但由于其本身具有內(nèi)在無(wú)序結(jié)構(gòu)，缺乏明確的藥物結(jié)合口袋，因此直接藥物靶向 MYC 長(zhǎng)期面臨困難?；谘芯繄F(tuán)隊(duì)此前開展的全激酶組 CRISPR 篩選，本研究將受體酪氨酸激酶 EphB4 鑒定為 MYC 驅(qū)動(dòng)癌癥中的一個(gè)可藥物干預(yù)的合成致死弱點(diǎn)。

研究發(fā)現(xiàn)，遺傳性敲除或藥物抑制 EphB4，可選擇性誘導(dǎo) MYC 激活的正常細(xì)胞和 MYC 高表達(dá)三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）細(xì)胞系發(fā)生強(qiáng)烈凋亡，而對(duì) MYC 低表達(dá)細(xì)胞影響較小。這一凋亡反應(yīng)對(duì) Bcl-2 敏感，并且不依賴 p53，從而有望繞過 TNBC 中常見的一個(gè)重要耐藥障礙。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，EphB4 抑制可顯著抑制 MYC 驅(qū)動(dòng)的腫瘤生長(zhǎng)。值得注意的是，將 EphB4 與 Bcl-2 抑制劑 ABT-199 聯(lián)合靶向，可在 TNBC 模型中產(chǎn)生協(xié)同促凋亡作用，并誘導(dǎo)腫瘤退縮。

機(jī)制上，EphB4 抑制會(huì)選擇性抑制 PSMB5 的轉(zhuǎn)錄。PSMB5 是蛋白酶體 β5 催化亞基，參與維持蛋白酶體功能。PSMB5 下調(diào)導(dǎo)致蛋白酶體活性受損，并誘導(dǎo) MYC 依賴性凋亡應(yīng)激。這一發(fā)現(xiàn)揭示了 EphB4 信號(hào)與蛋白穩(wěn)態(tài)維持之間此前未被認(rèn)識(shí)的聯(lián)系。由于 MYC 過表達(dá)細(xì)胞具有更高的生物合成負(fù)荷，因此對(duì)蛋白穩(wěn)態(tài)維持存在更強(qiáng)依賴。與直接靶向 PSMB5 催化活性位點(diǎn)不同，靶向其轉(zhuǎn)錄調(diào)控可能為規(guī)避或延緩傳統(tǒng)蛋白酶體抑制劑耐藥提供潛在策略。

總體而言，本研究定義了 EphB4-PSMB5 軸是 MYC 高表達(dá) TNBC 中一個(gè)機(jī)制獨(dú)特且具有治療可操作性的弱點(diǎn)，并提示 EphB4 抑制可能成為治療 MYC 驅(qū)動(dòng)癌癥的一種有前景策略。

研究意義：本研究發(fā)現(xiàn)，EphB4 抑制可通過破壞 PSMB5 依賴的蛋白穩(wěn)態(tài)，在 MYC 驅(qū)動(dòng) TNBC 中形成一個(gè)可藥物干預(yù)、p53 非依賴性的合成致死弱點(diǎn)，并揭示其與 Bcl-2 抑制聯(lián)合時(shí)具有協(xié)同療效。

01

研究背景及科學(xué)問題

MYC 家族癌蛋白包括 c-Myc、N-Myc 和 L-Myc，在超過一半的人類癌癥中存在失調(diào)，主要機(jī)制包括染色體擴(kuò)增、染色體易位，或調(diào)控 MYC 表達(dá)的上游信號(hào)通路被破壞。作為轉(zhuǎn)錄因子，MYC 可調(diào)控?cái)?shù)千個(gè)與腫瘤核心特征相關(guān)的基因，既能驅(qū)動(dòng)細(xì)胞生長(zhǎng)、抗凋亡和代謝重編程等腫瘤細(xì)胞內(nèi)在過程，也能通過重塑腫瘤微環(huán)境和調(diào)控抗腫瘤免疫等方式影響腫瘤外部環(huán)境。四環(huán)素調(diào)控的 MYC 轉(zhuǎn)基因小鼠模型研究進(jìn)一步顯示，抑制 MYC 可逆轉(zhuǎn)腫瘤進(jìn)展，說明 MYC 對(duì)腫瘤維持具有關(guān)鍵作用，也提示 MYC 抑制可能在多種惡性腫瘤中帶來(lái)廣泛治療獲益。

乳腺癌仍是女性癌癥相關(guān)死亡的重要原因之一，女性一生中乳腺癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)約為12%–13%。HER2 過表達(dá)腫瘤或表達(dá)雌激素受體和/或孕激素受體的腫瘤，已可從成熟的靶向治療中獲益。然而，三陰性乳腺癌（TNBC）缺乏這些受體，約占所有乳腺癌病例的15%–20%，目前仍缺少被廣泛接受的預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物和選擇性治療方案，因此是臨床治療中的重要挑戰(zhàn)。TNBC 常表現(xiàn)出 MYC 表達(dá)升高和 MYC 通路失調(diào)，導(dǎo)致 MYC 通路過度激活并與不良臨床結(jié)局相關(guān)。因此，靶向 MYC 的治療策略在 TNBC 中具有特別潛力。然而，MYC 的“不可成藥性”主要源于其內(nèi)在無(wú)序結(jié)構(gòu)和缺乏明確配體結(jié)合口袋，這使得小分子直接抑制 MYC 面臨巨大困難，目前尚無(wú)小分子 MYC 抑制劑進(jìn)入臨床應(yīng)用。

MYC 失調(diào)腫瘤中的合成致死弱點(diǎn)（MYC synthetic lethality，MYC-SL）為間接靶向 MYC 驅(qū)動(dòng)腫瘤提供了替代策略。這一思路并不是直接抑制 MYC，而是利用 MYC 轉(zhuǎn)化細(xì)胞對(duì)特定基因或通路形成的生存依賴。為發(fā)現(xiàn) MYC 依賴的合成致死相互作用，研究人員通常采用 RNAi 或 CRISPR 等遺傳篩選方法，在 MYC 被實(shí)驗(yàn)性激活但并非唯一轉(zhuǎn)化癌基因的模型中進(jìn)行研究，例如 MYC-雌激素受體融合蛋白（MYCER）誘導(dǎo)系統(tǒng)或 Dox 誘導(dǎo) MYC 表達(dá)系統(tǒng)。

為尋找 MYC 驅(qū)動(dòng)癌癥中新的、可藥物干預(yù)的靶點(diǎn)，研究團(tuán)隊(duì)此前在表達(dá) Dox 誘導(dǎo)型 MYC 構(gòu)建體的非轉(zhuǎn)化 ARPE-19 細(xì)胞模型中開展了全激酶組 CRISPR 敲除篩選。這一模型被認(rèn)為適合用于發(fā)現(xiàn) MYC 合成致死相互作用。篩選中，研究者通過深度測(cè)序定量 sgRNA 豐度，并使用 MaGeCK 流程進(jìn)行分析；候選基因優(yōu)先級(jí)根據(jù)其在 MYC 誘導(dǎo)細(xì)胞中的負(fù)選擇行為、效應(yīng)大小、sgRNA 一致性以及后續(xù)可干預(yù)性進(jìn)行排序。由此，EphB4 被識(shí)別為一個(gè)額外的 MYC 相關(guān)脆弱性候選靶點(diǎn)。

EphB4 是 Eph 家族中的一種受體酪氨酸激酶，可調(diào)控腫瘤血管生成、增殖和轉(zhuǎn)移，因此也是癌癥治療中的潛在靶點(diǎn)。已有多種 EphB4 靶向藥物被開發(fā)，包括進(jìn)入臨床評(píng)價(jià)的可溶性誘餌受體 sEphB4-HSA，以及在臨床前模型中測(cè)試過的選擇性小分子抑制劑 NVP-BHG712 和 AZ12672857。

本研究表明，EphB4 抑制可通過轉(zhuǎn)錄性抑制蛋白酶體亞基基因 PSMB5，從而損害蛋白酶體活性，選擇性誘導(dǎo) MYC 依賴性凋亡。這些發(fā)現(xiàn)揭示了 MYC 驅(qū)動(dòng)腫瘤發(fā)生背景下 EphB4 信號(hào)與蛋白酶體調(diào)控之間此前未被認(rèn)識(shí)的聯(lián)系。更重要的是，這一 MYC 相關(guān)弱點(diǎn)不依賴 p53，并可通過已有 EphB4 抑制劑進(jìn)行模擬，因此具有機(jī)制獨(dú)特性和治療可操作性。鑒于 PSMB5 突變常導(dǎo)致傳統(tǒng)蛋白酶體抑制劑耐藥，靶向 EphB4 通過抑制 PSMB5 轉(zhuǎn)錄而非直接抑制其催化活性，可能為克服或延緩此類耐藥提供可行策略。總體而言，本研究確立了 EphB4-PSMB5 軸是可靶向通路，并強(qiáng)調(diào) EphB4 抑制可能成為 MYC 高表達(dá) TNBC 的潛在治療策略。

02

重要發(fā)現(xiàn)及亮點(diǎn)

EphB4 缺失可誘導(dǎo) MYC 依賴性凋亡

基于研究團(tuán)隊(duì)此前通過 MaGeCK 分析的全激酶組篩選數(shù)據(jù)，EPHB4 被識(shí)別為與 MYC 選擇性脆弱性相關(guān)的候選基因。在該篩選中，與未誘導(dǎo)對(duì)照細(xì)胞相比，靶向 EPHB4 的 sgRNA 在 MYC 誘導(dǎo)細(xì)胞中發(fā)生耗竭，其負(fù)選擇評(píng)分為0.026，log fold change 為 ?0.55。為驗(yàn)證這一相互作用，研究者構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)三條獨(dú)立 Dox 誘導(dǎo)型 EPHB4 shRNA 的 ARPE-19-MYCER 細(xì)胞。Dox 處理可劑量依賴性降低 EphB4 蛋白水平，并特異性降低 4-羥基他莫昔芬（4-hydroxytamoxifen，OHT）激活 MYC 的細(xì)胞活力，而對(duì)未激活 MYC 的 OHT 陰性對(duì)照細(xì)胞影響較小。

為進(jìn)一步確認(rèn)這一觀察結(jié)果，研究者建立了表達(dá) GFP 對(duì)照 shRNA 或三條獨(dú)立 EPHB4 shRNA 的 ARPE-19-MYCER 和 U2OS-MYCER 細(xì)胞。免疫印跡證實(shí)，每條 shRNA 均能有效敲低 EphB4。OHT 激活 MYC 后，EphB4 缺失細(xì)胞相較 GFP 對(duì)照出現(xiàn)明顯凋亡；在 U2OS-MYCER 細(xì)胞中，凋亡程度與 EphB4 沉默程度呈正相關(guān)。克隆形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步顯示，在 MYC 激活的 ARPE-19 細(xì)胞中，EphB4 缺失顯著抑制克隆生長(zhǎng)，而在未激活 MYC 的細(xì)胞中影響很小。

為確定這種 MYC 選擇性凋亡是否源于 EphB4 激酶活性喪失，研究者首先沉默 EphB4 的經(jīng)典配體 EFNB2。EFNB2 可強(qiáng)烈激活 EphB4 的內(nèi)在酪氨酸激酶功能。三條獨(dú)立 EFNB2 shRNA 的敲低均顯著增強(qiáng) OHT 誘導(dǎo)的凋亡，并且凋亡程度與敲低效率相關(guān)。與此一致，使用 EphB4 激酶抑制劑 NVP-BHG712 或 AZ12672857 進(jìn)行藥物抑制，可選擇性誘導(dǎo) OHT 處理的 ARPE-19-MYCER 細(xì)胞凋亡，而不影響未激活 MYC 的對(duì)照細(xì)胞。類似的 MYC 依賴性凋亡反應(yīng)也可在 U2OS-MYCER、HFF-1-MYCER 和 BEAS-2B-MYCER 等多種細(xì)胞類型中復(fù)現(xiàn)?？傮w而言，這些結(jié)果表明，MYC 激活細(xì)胞對(duì) EphB4 激酶功能喪失具有選擇性脆弱性，并提示這種 MYC 增強(qiáng)型依賴性在不同人源細(xì)胞背景中具有一定保守性。

圖1：MYC 依賴的 EphB4 缺失和抑制脆弱性。（A）篩選概念示意圖，顯示 EPHB4 缺失優(yōu)先損害 MYC 過表達(dá)（MYC-OE）細(xì)胞的生存，而不明顯影響 MYC 正常表達(dá)細(xì)胞。（B）有或無(wú) MYC 過表達(dá)條件下 EPHB4 sgRNA 的豐度。（C）免疫印跡分析顯示，在穩(wěn)定表達(dá) Dox 誘導(dǎo)型 EphB4 shRNA（三條獨(dú)立序列）的 ARPE-19-MYCER 細(xì)胞中，使用所示濃度多西環(huán)素（doxycycline，Dox）處理48小時(shí)后，EphB4 蛋白水平呈劑量依賴性下降。（D）C 圖所述細(xì)胞在有或無(wú) 4-羥基他莫昔芬（OHT）條件下，使用所示濃度 Dox 處理5天后的細(xì)胞活力。（E 和 F）表達(dá) Dox 誘導(dǎo)型 GFP shRNA 或三條獨(dú)立 EPHB4 shRNA（、、）的 ARPE-19-MYCER（E）和 U2OS-MYCER（F）細(xì)胞，在有或無(wú) OHT 條件下經(jīng) Dox 處理3天后的凋亡分析（上方）。EphB4 的有效敲低通過免疫印跡確認(rèn)（下方）。（G）E 圖所述 ARPE-19-MYCER 細(xì)胞在有或無(wú) OHT 條件下經(jīng) Dox 處理5天后的結(jié)晶紫染色。（H 和 I）表達(dá) Dox 誘導(dǎo)型 GFP shRNA 或三條獨(dú)立 EFNB2 shRNA（、、）的 ARPE-19-MYCER 細(xì)胞，在有或無(wú) OHT 條件下經(jīng) Dox 處理3天后的凋亡分析（H）。EFNB2 的敲低效率通過 RT-qPCR 確認(rèn)（I）。（J）ARPE-19-MYCER 細(xì)胞在有或無(wú) OHT 條件下，用 DMSO 或 EphB4 抑制劑 NVP-BHG712（2 μM）或 AZ12672857（1 μM）處理3天后的凋亡分析。圖中數(shù)據(jù)以 mean ± SEM 表示；n = 3–4；*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001， < 0.0001。

EphB4 抑制誘導(dǎo)的凋亡對(duì) Bcl-2 敏感且不依賴 p53

哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡主要通過兩條核心機(jī)制執(zhí)行：死亡受體介導(dǎo)的外源性通路，以及線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性通路。為明確 EphB4 抑制觸發(fā)的 MYC 依賴性凋亡究竟由哪條通路介導(dǎo)，研究者分別阻斷這兩條級(jí)聯(lián)反應(yīng)。外源性通路通過 FADD 敲低或顯性負(fù)性 FADD（dominant-negative FADD，DN-FADD）過表達(dá)進(jìn)行抑制；內(nèi)源性通路則通過強(qiáng)制表達(dá) Bcl-2 進(jìn)行抑制。

結(jié)果顯示，在 OHT 處理的 ARPE-19-MYCER 細(xì)胞中，F(xiàn)ADD 缺失或 DN-FADD 表達(dá)僅對(duì) NVP-BHG712 誘導(dǎo)的凋亡產(chǎn)生輕微影響；相反，Bcl-2 過表達(dá)可顯著抑制凋亡。值得注意的是，與 Bcl-2 抑制劑 ABT-199 聯(lián)合處理可逆轉(zhuǎn) Bcl-2 的保護(hù)作用。通過 shRNA 介導(dǎo) EPHB4 敲低后也觀察到一致結(jié)果，免疫印跡證實(shí)了 Bcl-2 的有效表達(dá)。這些結(jié)果說明，EphB4 抑制誘導(dǎo)的凋亡主要經(jīng)由線粒體內(nèi)源性凋亡通路執(zhí)行。

考慮到 p53 功能缺失突變常與 MYC 失調(diào)共同發(fā)生，并協(xié)同推動(dòng)腫瘤進(jìn)展，研究者進(jìn)一步檢測(cè) EphB4 抑制誘導(dǎo)的凋亡是否依賴 p53。通過 CRISPR-Cas9 技術(shù)，研究者構(gòu)建了 p53 敲除 ARPE-19-MYC 細(xì)胞。結(jié)果顯示，EphB4 敲低在 p53 野生型和 p53 缺失細(xì)胞中誘導(dǎo)的凋亡水平相當(dāng)。類似地，NVP-BHG712 或 AZ12672857 對(duì) EphB4 的藥物抑制，在兩種基因型中也產(chǎn)生相近的凋亡反應(yīng)。這說明 EphB4 抑制在 MYC 激活細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡并不依賴 p53 狀態(tài)。

隨后，研究者進(jìn)一步考察這種 MYC 相關(guān)脆弱性是否適用于惡性轉(zhuǎn)化背景。研究使用了團(tuán)隊(duì)此前建立的 ARPE-19-STR 和 HFF-1-STR 成瘤細(xì)胞模型。這些細(xì)胞通過共同表達(dá) hTERT、SV40 早期區(qū)域編碼的大 T 抗原和小 T 抗原，以及活化的 HRASG12V，將正常 ARPE-19 和 HFF-1 細(xì)胞轉(zhuǎn)化為惡性衍生細(xì)胞。正如預(yù)期，這些轉(zhuǎn)化細(xì)胞對(duì) NVP-BHG712 或 AZ12672857 單藥處理基本耐受。然而，外源性 MYC 表達(dá)顯著提高它們對(duì) EphB4 抑制的敏感性，使凋亡率接近80%。

這一基因定義明確的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)進(jìn)一步用于體內(nèi)評(píng)估 MYC 依賴性 EphB4 抑制敏感性。每日腹腔注射 NVP-BHG712（15 mg/kg）顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)，與對(duì)照相比，腫瘤體積約減少89%，腫瘤重量約降低80%，且未引起明顯體重下降，提示其體內(nèi)耐受性較好?？傮w而言，這些數(shù)據(jù)表明，EphB4 抑制可激活一種 Bcl-2 敏感、p53 非依賴的內(nèi)源性凋亡通路，并在 MYC 驅(qū)動(dòng)惡性腫瘤中產(chǎn)生較強(qiáng)且耐受性良好的抗腫瘤作用。

圖2：EphB4 抑制誘導(dǎo) Bcl-2 敏感且 p53 非依賴性的凋亡。（A–C）表達(dá) GFP shRNA（對(duì)照）或 FADD shRNA，或表達(dá)空載體（對(duì)照）或 DN-FADD 的 ARPE-19-MYCER 細(xì)胞，在 OHT 存在條件下用 DMSO 或 NVP-BHG712（2 μM）處理3天后進(jìn)行凋亡分析。FADD 敲低（B）和 DN-FADD 表達(dá)（C）通過免疫印跡確認(rèn)。（D）表達(dá)空載體或 Bcl-2 的 ARPE-19-MYCER 細(xì)胞，在 OHT 和所示化合物處理3天后的凋亡分析。NVP-BHG712 為2 μM；ABT-199 為6 μM。（E）表達(dá)對(duì)照 shRNA（shGFP）或 EPHB4 shRNA（）的 ARPE-19-MYCER 細(xì)胞在 OHT 存在條件下的凋亡分析。細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)空載體或 Bcl-2，并在所示條件下使用 Bcl-2 抑制劑 ABT-199（6 μM）處理。（F）表達(dá)空載體或 Bcl-2 的 ARPE-19-MYCER 細(xì)胞中 Bcl-2 表達(dá)的免疫印跡分析。（G）ARPE-19-MYC 細(xì)胞中 p53 敲除的免疫印跡驗(yàn)證。（H）TP53WT 和 TP53?/? ARPE-19-MYC 細(xì)胞表達(dá) Dox 誘導(dǎo)型 GFP shRNA 或 EPHB4 shRNA ，經(jīng) Dox 處理3天后的凋亡分析。（I）TP53WT 和 TP53?/? ARPE-19-MYC 細(xì)胞用 DMSO、NVP-BHG712（2 μM）或 AZ12672857（1 μM）處理3天后的凋亡分析。（J）穩(wěn)定表達(dá) SV40、hTERT 和 HRASG12V 的 ARPE-19（左）和 HFF-1（右）細(xì)胞，分別命名為 ARPE-19-STR 和 HFF-1-STR，感染表達(dá)空載體或 MYC 的慢病毒。隨后用 NVP-BHG712（2 μM）或 AZ12672857（1 μM）處理3天，并進(jìn)行凋亡檢測(cè)。（K 和 L）通過免疫印跡驗(yàn)證 ARPE-19-STR（K）和 HFF-1-STR（L）細(xì)胞中的 MYC 表達(dá)。（M–O）攜帶 ARPE-19-STR-MYC 異種移植瘤的裸鼠每日腹腔注射載體或 NVP-BHG712（15 mg/kg）。記錄并監(jiān)測(cè)腫瘤體積（M）。第12天剝離腫瘤（N）并稱重（O）。（P）在12天治療期間監(jiān)測(cè)小鼠體重。圖中數(shù)據(jù)以 mean ± SEM 表示；n = 3–4；ns，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義； < 0.0001。

MYC 高表達(dá) TNBC 細(xì)胞對(duì) EphB4 抑制具有脆弱性

鑒于 TNBC 常出現(xiàn) MYC 表達(dá)升高，但缺乏有效靶向治療，研究者進(jìn)一步考察 EphB4 抑制是否可選擇性誘導(dǎo) MYC 高表達(dá) TNBC 細(xì)胞凋亡。為了評(píng)估 MYCER 模型的生理相關(guān)性，并界定本研究所用乳腺細(xì)胞系中的 MYC 表達(dá)狀態(tài)，研究者通過免疫印跡直接比較了 ARPE-19-MYCER 細(xì)胞與一組乳腺細(xì)胞系中的 MYC 蛋白水平。在相同實(shí)驗(yàn)條件下，ARPE-19-MYCER 細(xì)胞中的 MYCER 表達(dá)水平與 MYC 高表達(dá)乳腺癌細(xì)胞系 MDA-MB-468 和 BT-549 中的內(nèi)源性 MYC 水平相當(dāng)，同時(shí)明顯高于 MYC 低表達(dá)乳腺癌細(xì)胞 T47D 和非惡性乳腺上皮細(xì)胞 MCF10A。這表明 MYCER 模型并非極端人工過表達(dá)系統(tǒng)，而是落在 MYC 高表達(dá)乳腺癌細(xì)胞的表達(dá)范圍內(nèi)。

基于上述表達(dá)特征，研究者比較了三種 MYC 高表達(dá) TNBC 細(xì)胞系 MDA-MB-468、SUM-149-PT、BT-549 與 MYC 低表達(dá) MCF10A 細(xì)胞對(duì) EphB4 抑制的凋亡反應(yīng)。三條獨(dú)立 EPHB4 shRNA 可有效降低四種細(xì)胞中的 EphB4 蛋白水平；然而，顯著凋亡僅出現(xiàn)在 MYC 高表達(dá) TNBC 細(xì)胞中，而未見于 MCF10A 細(xì)胞。與此一致，在 OHT 處理后，MCF10A-MYCER 細(xì)胞對(duì) EphB4 缺失變得敏感，凋亡細(xì)胞約占60%。T47D-MYCER 細(xì)胞中也觀察到類似現(xiàn)象，OHT 介導(dǎo)的 MYC 激活顯著增強(qiáng) EphB4 抑制劑 NVP-BHG712 誘導(dǎo)的凋亡。值得注意的是，三種 MYC 高表達(dá) TNBC 細(xì)胞系 MDA-MB-468、SUM-149-PT 和 BT-549 均攜帶 TP53 錯(cuò)義突變。盡管缺乏功能性 p53，這些細(xì)胞仍對(duì) EphB4 抑制高度敏感。這與 ARPE-19-MYC 細(xì)胞中 TP53 敲除并不削弱 EphB4 抑制誘導(dǎo)凋亡的結(jié)果相互印證，進(jìn)一步支持 MYC 相關(guān) EphB4 依賴性不依賴 p53。

為排除脫靶效應(yīng)，研究者分別建立了穩(wěn)定表達(dá)三條獨(dú)立 Dox 誘導(dǎo)型 EPHB4 shRNA 的細(xì)胞系。Dox 誘導(dǎo)后，與 GFP shRNA 對(duì)照相比，EphB4 蛋白明顯下降，并伴隨凋亡增加。為進(jìn)一步確認(rèn)該效應(yīng)的特異性，研究者構(gòu)建了在 shRNA 和 結(jié)合位點(diǎn)含有沉默突變的 EPHB4 cDNA，使其對(duì)相應(yīng) shRNA 產(chǎn)生耐受。表達(dá)這些 shRNA 耐受性構(gòu)建體可挽救相應(yīng) shRNA 誘導(dǎo)的凋亡，證實(shí)該表型來(lái)源于靶向 RNA 干擾效應(yīng)。

隨后，研究者進(jìn)一步詢問這一挽救作用是否依賴 EphB4 激酶活性。研究者在 shRNA 耐受的 EPHB4 cDNA 中引入兩個(gè)激酶失活突變 K647R 和 A742V。重新表達(dá)野生型 EphB4 可阻止 EphB4 敲低誘導(dǎo)的凋亡，而兩個(gè)激酶失活突變體均不能提供保護(hù)，說明 EphB4 激酶活性對(duì)于 MYC 高表達(dá) TNBC 細(xì)胞生存是必需的。與此一致，EFNB2 敲低可誘導(dǎo)相近程度的凋亡。此外，EphB4 激酶抑制劑 NVP-BHG712 可在 MYC 高表達(dá) TNBC 細(xì)胞 MDA-MB-468、SUM-149-PT 和 BT-549 中誘導(dǎo)強(qiáng)烈凋亡，但不影響 MYC 低表達(dá) MCF10A 細(xì)胞。更明顯的是，經(jīng) OHT 處理的 MCF10A-MYCER 細(xì)胞對(duì) NVP-BHG712 變得敏感，凋亡率約為60%。這些結(jié)果說明，EphB4 激酶活性是 MYC 高表達(dá) TNBC 細(xì)胞生存所必需的。

為進(jìn)一步確定 MYC 是否功能性參與 TNBC 細(xì)胞對(duì) EphB4 抑制的凋亡敏感性，研究者在 NVP-BHG712 處理前使用 MYCi975 處理 MDA-MB-468 細(xì)胞。MYCi975 是一種可干擾 MYC-MAX 二聚化的 MYC 抑制劑。結(jié)果顯示，MYCi975 顯著減弱 NVP-BHG712 誘導(dǎo)的凋亡，支持 MYC 對(duì) EphB4 抑制觸發(fā)的凋亡反應(yīng)具有功能性貢獻(xiàn)。

研究者還排除了 EphB4 抑制敏感性僅由高增殖能力導(dǎo)致的可能。雖然 ARPE-19-STR 細(xì)胞對(duì) EphB4 抑制不敏感，但在常規(guī)培養(yǎng)中其增殖似乎快于 MYC 高表達(dá) TNBC 細(xì)胞 MDA-MB-468 和 BT-549。正式比較生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)和 MYC 表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，ARPE-19-STR 細(xì)胞確實(shí)比 MDA-MB-468 和 BT-549 增殖更快，但 MYC 表達(dá)顯著低于這兩種 TNBC 細(xì)胞。由此可見，快速增殖本身不足以賦予 EphB4 抑制敏感性，EphB4 抑制劑敏感性與 MYC 狀態(tài)關(guān)系更密切。

雖然遺傳和藥物性 EphB4 抑制均可誘導(dǎo) MYC 高表達(dá) TNBC 細(xì)胞凋亡，但在相同條件下，TNBC 細(xì)胞中凋亡比例約為30%–40%，低于 MYC 激活的 MCF10A 或其他 MYC 激活正常細(xì)胞中約60%的水平。鑒于 Bcl-2 過表達(dá)可顯著抑制 MYC 激活 ARPE-19 細(xì)胞中 EphB4 抑制誘導(dǎo)的凋亡，研究者推測(cè) TNBC 細(xì)胞中較高的 Bcl-2 表達(dá)可能削弱凋亡反應(yīng)。免疫印跡顯示，與 MCF10A 相比，MDA-MB-468、SUM-149-PT 和 BT-549 細(xì)胞中的 Bcl-2 蛋白水平明顯更高。進(jìn)一步聯(lián)合 Bcl-2 抑制劑 ABT-199 與 EphB4 敲低或藥物阻斷后，ABT-199 單藥僅誘導(dǎo)輕度凋亡，但可顯著增強(qiáng) EphB4 敲低或抑制所觸發(fā)的凋亡。這說明 Bcl-2 與 EphB4 雙重抑制可協(xié)同增強(qiáng) MYC 高表達(dá) TNBC 細(xì)胞凋亡。

為評(píng)價(jià)這一相互作用的體內(nèi)相關(guān)性，研究者在攜帶 MDA-MB-468 異種移植瘤的小鼠中使用 NVP-BHG712、ABT-199 或二者聯(lián)合治療。NVP-BHG712 單藥可產(chǎn)生較強(qiáng)腫瘤抑制作用，使腫瘤在整個(gè)治療期間維持接近基線大小；ABT-199 單藥作用較弱。值得注意的是，聯(lián)合治療可誘導(dǎo)腫瘤退縮，并在終點(diǎn)形成最小的腫瘤負(fù)荷，這與剝離腫瘤質(zhì)量結(jié)果一致。治療過程中未觀察到明顯體重下降，提示耐受性較好。上述結(jié)果說明，MYC 高表達(dá) TNBC 腫瘤在體內(nèi)高度依賴 EphB4 激酶活性，而聯(lián)合抑制 Bcl-2 可進(jìn)一步增強(qiáng)抗腫瘤反應(yīng)。

圖3：MYC 高表達(dá) TNBC 細(xì)胞對(duì) EphB4 抑制敏感。（A）MDA-MB-468、SUM-149-PT、BT-549 和 MCF10A 細(xì)胞裂解液中 MYC 和 GAPDH 的免疫印跡分析。（B 和 C）所示細(xì)胞表達(dá) Dox 誘導(dǎo)型 GFP 或 EPHB4 shRNA（三條獨(dú)立序列），經(jīng) Dox 處理2天后進(jìn)行 EphB4 和 GAPDH 免疫印跡分析（B），或處理5天后進(jìn)行凋亡實(shí)驗(yàn)（C）。（D）表達(dá) Dox 誘導(dǎo)型 GFP 或 EPHB4 shRNA（三條獨(dú)立序列）的 MCF10A-MYCER 細(xì)胞，在有或無(wú) OHT 條件下經(jīng) Dox 處理3天后的凋亡分析。（E）表達(dá) Dox 誘導(dǎo)型 GFP shRNA 或三條獨(dú)立 EPHB4 shRNA（、、）的 BT-549 細(xì)胞，經(jīng) Dox 處理3天后的凋亡分析（上方）。EphB4 敲低通過免疫印跡確認(rèn)（下方）。柱狀圖以 mean ± SEM 表示；n = 3；**P < 0.01，與對(duì)照細(xì)胞相比差異顯著。（F）EphB4 敲低 BT-549 細(xì)胞在有或無(wú) shRNA 耐受性 EPHB4 cDNA 補(bǔ)充條件下的凋亡分析（上方）。EphB4 表達(dá)通過免疫印跡確認(rèn)（下方）。（G 和 H）EphB4 敲低 BT-549 細(xì)胞在有或無(wú) shRNA 耐受性 EPHB4WT、EPHB4K647R 或 EPHB4A742V cDNA 補(bǔ)充條件下的凋亡分析（G）。EphB4 表達(dá)通過免疫印跡確認(rèn)（H）。（I）穩(wěn)定表達(dá) Dox 誘導(dǎo)型 GFP shRNA 或三條獨(dú)立 EFNB2 shRNA（、、）的 BT-549 細(xì)胞，經(jīng) Dox 處理3天后的凋亡分析。柱狀圖以 mean ± SEM 表示；n = 3；**P < 0.01，與對(duì)照細(xì)胞相比差異顯著。（J）所示細(xì)胞用 DMSO 或 NVP-BHG712 處理3天后的凋亡分析。（K）MCF10A-MYCER 細(xì)胞在有或無(wú) OHT 條件下，用 DMSO 或 NVP-BHG712（2 μM）處理3天后的凋亡分析。（L）MDA-MB-468 細(xì)胞在有或無(wú) MYCi975（6 μM）條件下，用 DMSO 或 NVP-BHG712（2 μM）處理后的凋亡分析。（M）MDA-MB-468、SUM-149-PT、BT-549 和 MCF10A 細(xì)胞裂解液中 Bcl-2 和 GAPDH 的免疫印跡分析。（N）穩(wěn)定表達(dá) Dox 誘導(dǎo)型 EPHB4 shRNA 的 MDA-MB-468、SUM-149-PT 和 BT-549 細(xì)胞，用 Dox 誘導(dǎo) EphB4 敲低，并/或使用 Bcl-2 抑制劑 ABT-199（6 μM）處理3天后的凋亡分析。（O–P）攜帶 MDA-MB-468 異種移植瘤的裸鼠每日腹腔注射載體、NVP-BHG712（15 mg/kg）和/或 ABT-199。記錄并監(jiān)測(cè)腫瘤體積（O）。第25天剝離腫瘤（P）。圖中數(shù)據(jù)以 mean ± SEM 表示；n = 3–4。對(duì)于 C、D、E、F、I、J、K、L 和 N 圖，ns 表示無(wú)顯著性差異；*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001， < 0.0001。

PSMB5 下調(diào)參與 EphB4 抑制誘導(dǎo)的凋亡

為闡明 EphB4 抑制誘導(dǎo) MYC 依賴性凋亡的分子基礎(chǔ)，研究者提出假設(shè)：EphB4 抑制可能干擾 MYC 激活的生存基因表達(dá)，從而選擇性削弱 MYC 高表達(dá) TNBC 細(xì)胞的存活。也就是說，尋找那些被 MYC 上調(diào)、但在 EphB4 抑制后被下調(diào)的基因，有助于定位連接 EphB4 信號(hào)與 MYC 驅(qū)動(dòng)細(xì)胞生存的下游效應(yīng)因子。

為此，研究者開展 RNA-seq 分析，鑒定受 MYC 正向調(diào)控但在 EphB4 抑制后被抑制的基因。具體而言，研究者首先比較了有無(wú) OHT 處理的 MCF10A-MYCER 細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組。OHT 可激活 MYC。以 |log2 fold change| > 1 且 adjusted p value < 0.05 為標(biāo)準(zhǔn)，作者鑒定到977個(gè)在 MYC 激活后顯著上調(diào)的基因。同時(shí)，研究者分析了 OHT 處理的 MCF10A-MYCER 細(xì)胞在 EphB4 敲低后的基因表達(dá)變化，并使用相同標(biāo)準(zhǔn)鑒定到152個(gè)相對(duì)于對(duì)照顯著下調(diào)的基因。兩個(gè)數(shù)據(jù)集取交集后得到35個(gè)重疊基因。在這些重疊基因中，作者進(jìn)一步優(yōu)先選擇在 MYC 激活條件下轉(zhuǎn)錄本豐度相對(duì)較高的基因，即 FPKM > 3，進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，最終獲得6個(gè)候選基因：PSMB5、TSR3、PLTP、HES6、MDK 和 PLEK2。RNA-seq 結(jié)果通過 RT-qPCR 得到驗(yàn)證。

為評(píng)估這些候選基因的功能相關(guān)性，研究者分別使用三條獨(dú)立 Dox 誘導(dǎo)型 shRNA 的組合對(duì)每個(gè)基因進(jìn)行沉默，以確保敲低效率和特異性。隨后，在 MYC 開啟和關(guān)閉條件下檢測(cè) MCF10A-MYCER 細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示，在6個(gè)候選基因中，PSMB5 敲低誘導(dǎo)的凋亡反應(yīng)最顯著，在 MYC 激活條件下約60%的細(xì)胞發(fā)生凋亡，而沉默其他基因相較 GFP shRNA 對(duì)照僅誘導(dǎo)輕度凋亡。

為排除潛在脫靶效應(yīng)，研究者構(gòu)建了三種分別穩(wěn)定表達(dá)單條 Dox 誘導(dǎo)型 PSMB5 shRNA（、、）的 MCF10A-MYCER 細(xì)胞系。Dox 誘導(dǎo)后，三種細(xì)胞系均顯示 PSMB5 蛋白顯著降低，并伴隨相較 GFP shRNA 對(duì)照顯著增加的凋亡。值得注意的是，凋亡程度與 PSMB5 缺失程度相關(guān)。與此一致，使用蛋白酶體抑制劑 carfilzomib 或 ixazomib 藥物性抑制 PSMB5，也可選擇性誘導(dǎo) OHT 處理的 MYC 激活 MCF10A-MYCER 細(xì)胞凋亡，而不影響未處理對(duì)照細(xì)胞。綜上，這些結(jié)果將 PSMB5 確定為 EphB4 抑制的關(guān)鍵下游效應(yīng)因子，并提示 PSMB5 轉(zhuǎn)錄受抑參與 MYC 激活細(xì)胞的凋亡脆弱性。

圖4：PSMB5 下調(diào)參與 EphB4 抑制誘導(dǎo)的凋亡。（A 和 B）火山圖顯示 MCF10A-MYCER 細(xì)胞中 MYC 激活（OHT+）細(xì)胞與對(duì)照（OHT?）細(xì)胞之間的差異表達(dá)基因（DEGs）（A），以及 OHT 處理的 MCF10A-MYCER 細(xì)胞中表達(dá) GFP shRNA（Ctrl）或 EPHB4 shRNA 后的差異表達(dá)基因（B）。每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)差異表達(dá)基因，彩色圓點(diǎn)表示顯著上調(diào)或下調(diào)基因；n = 3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。（C）A 圖中 MYC 激活后上調(diào)基因與 B 圖中 EphB4 敲低后下調(diào)基因的交集。用于下游驗(yàn)證的基因中，在 MYC 激活條件下轉(zhuǎn)錄本豐度相對(duì)較高的基因，即 fragments per kilobase of transcript per million mapped reads（FPKM）> 3，被單獨(dú)標(biāo)出。（D）表達(dá) Dox 誘導(dǎo)型 EPHB4 shRNA 的 MCF10A-MYCER 細(xì)胞，在 OHT 和 Dox 單獨(dú)或聯(lián)合處理3天后，所示基因的相對(duì) mRNA 水平。（E）表達(dá)三條獨(dú)立 Dox 誘導(dǎo)型 shRNA（靶向特定基因或 GFP）的 MCF10A-MYCER 細(xì)胞，在有或無(wú) OHT 條件下經(jīng) Dox 處理4天后的凋亡分析。（F）表達(dá) Dox 誘導(dǎo)型 GFP shRNA 或三條獨(dú)立 PSMB5 shRNA（、、）的 MCF10A-MYCER 細(xì)胞，在有或無(wú) OHT 條件下經(jīng) Dox 處理3天后的凋亡分析。（G）MCF10A-MYCER 細(xì)胞在有或無(wú) OHT 條件下，用 DMSO 或 PSMB5 抑制劑 ixazomib（200 nM）或 carfilzomib（100 nM）處理3天后的凋亡分析。圖中數(shù)據(jù)以 mean ± SEM 表示；n = 3–4；***P < 0.001， < 0.0001。

EphB4 抑制在 TNBC 中選擇性下調(diào) PSMB5 轉(zhuǎn)錄并損害蛋白酶體功能

接下來(lái)，研究者評(píng)估在 MCF10A-MYCER 細(xì)胞中觀察到的 EphB4 敲低導(dǎo)致 PSMB5 轉(zhuǎn)錄抑制現(xiàn)象，是否也保留于 TNBC 細(xì)胞中。Dox 誘導(dǎo) EPHB4 沉默后，BT-549、MDA-MB-468 和 SUM-149-PT 細(xì)胞中的 PSMB5 mRNA 水平均明顯降低。與此一致，三條獨(dú)立 EPHB4 shRNA 中任一條的表達(dá)，均可相較對(duì)照細(xì)胞降低 PSMB5 蛋白豐度，并且 PSMB5 降低程度與 EphB4 敲低效率相關(guān)。在挽救實(shí)驗(yàn)中，過表達(dá)含沉默突變、可抵抗 shRNA 或 的 EPHB4 cDNA，可有效阻止 shRNA 誘導(dǎo)的 PSMB5 mRNA 和蛋白水平下降。

由于 PSMB5、PSMB6 和 PSMB7 構(gòu)成20S 蛋白酶體核心顆粒的三個(gè)催化 β 亞基，研究者進(jìn)一步考察 EphB4 抑制是否也影響 PSMB6 或 PSMB7。三條獨(dú)立 EPHB4 shRNA 敲低 EPHB4 后，PSMB5 mRNA 顯著下降，而 PSMB6 和 PSMB7 轉(zhuǎn)錄本水平基本不變。然而，免疫印跡顯示，在 MDA-MB-468、SUM-149-PT 和 BT-549 細(xì)胞中，EphB4 敲低伴隨 PSMB5 缺失，同時(shí)成熟 PSMB6 和 PSMB7 蛋白顯著減少。這可能反映蛋白酶體核心裝配受損，因?yàn)?PSMB5 的正常摻入對(duì)于其他催化 β 亞基的成熟和穩(wěn)定是必要的。

研究者隨后檢測(cè)這些變化是否轉(zhuǎn)化為蛋白酶體功能損害。PSMB5 是20S 蛋白酶體核心顆粒的 β5 催化亞基，具有胰凝乳蛋白酶樣活性，對(duì)于降解泛素化蛋白和維持細(xì)胞蛋白穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。在 BT-549 細(xì)胞中，EphB4 的遺傳性缺失和藥物性抑制均顯著降低熒光底物 Suc-LLVY-AMC 的水解活性，該底物可反映 β5 相關(guān)胰凝乳蛋白酶樣活性，其下降程度與蛋白酶體抑制劑 carfilzomib 處理相近。在 MDA-MB-468 細(xì)胞中，EphB4 抑制也觀察到類似 β5 活性下降。由于免疫印跡顯示 EphB4 敲低后成熟 PSMB6 和 PSMB7 蛋白水平下降，研究者進(jìn)一步檢測(cè)對(duì)應(yīng)蛋白酶體活性是否受到影響。結(jié)果顯示，在 MDA-MB-468 細(xì)胞中，EphB4 抑制除降低 PSMB5 相關(guān)活性外，也顯著降低 PSMB6 相關(guān)的半胱天冬酶樣活性和 PSMB7 相關(guān)的胰蛋白酶樣活性。上述結(jié)果直接證明，EphB4 抑制會(huì)損害 TNBC 細(xì)胞的蛋白酶體功能。

為確定 PSMB5 缺失是否功能性連接 TNBC 細(xì)胞凋亡，研究者進(jìn)一步直接靶向 PSMB5。與 MYC 激活 MCF10A-MYCER 細(xì)胞中的結(jié)果一致，PSMB5 敲低顯著增加 MDA-MB-468、BT-549 和 SUM-149-PT 細(xì)胞凋亡。免疫印跡證實(shí) PSMB5 被有效敲低，而重新表達(dá) shRNA 耐受性 PSMB5 cDNA 可有效挽救 shRNA 誘導(dǎo)的凋亡，確認(rèn)了靶向特異性。此外，在 MDA-MB-468 細(xì)胞中使用 MYCi975 處理，可顯著減弱 carfilzomib 誘導(dǎo)的凋亡，說明 MYC 功能參與了該 TNBC 背景下由直接蛋白酶體抑制觸發(fā)的凋亡脆弱性。綜上，這些結(jié)果表明，EphB4 抑制選擇性下調(diào) PSMB5 表達(dá)，破壞催化 β 亞基成熟和蛋白酶體功能，進(jìn)而促進(jìn) TNBC 細(xì)胞發(fā)生 MYC 依賴性凋亡。

圖5：EphB4 抑制下調(diào) TNBC 細(xì)胞中 PSMB5 轉(zhuǎn)錄并損害蛋白酶體功能。（A）所示 TNBC 細(xì)胞表達(dá) Dox 誘導(dǎo)型 shRNA（三條獨(dú)立序列靶向 EPHB4），經(jīng) Dox 處理2天后的相對(duì) PSMB5 mRNA 水平。數(shù)據(jù)歸一化至 β-actin，并以 mean ± SEM 表示（n = 3）。（B）表達(dá) Dox 誘導(dǎo)型 GFP shRNA 或 EPHB4 shRNA 、、 的 BT-549 細(xì)胞經(jīng) Dox 處理2天。（C 和 D）表達(dá) EPHB4 shRNA 或 的 BT-549 細(xì)胞，在有或無(wú) shRNA 耐受性 EPHB4 cDNA 補(bǔ)充條件下，通過 RT-qPCR 檢測(cè) PSMB5 mRNA 水平（C），或通過免疫印跡評(píng)估 EphB4 敲低和 PSMB5 蛋白水平（D）。（E）表達(dá) Dox 誘導(dǎo)型 GFP shRNA 或三條獨(dú)立 EPHB4 shRNA（、、）的 MDA-MB-468 細(xì)胞，經(jīng) Dox 處理2天后的相對(duì) PSMB5、PSMB6 和 PSMB7 mRNA 水平。柱狀圖為 mean ± SEM； < 0.0001，與對(duì)照細(xì)胞相比差異顯著。（F）表達(dá) Dox 誘導(dǎo)型 EPHB4 shRNA 的 MDA-MB-468、SUM-149-PT 和 BT-549 細(xì)胞，經(jīng) Dox 處理2天后所示蛋白的免疫印跡分析。（G）表達(dá) Dox 誘導(dǎo)型 EphB4 shRNA 的 BT-549 細(xì)胞中胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶體活性檢測(cè)。經(jīng) carfilzomib（100 nM）處理，或經(jīng) Dox 誘導(dǎo) EPHB4 shRNA 表達(dá)2天后，通過 Suc-LLVY-AMC 肽水解進(jìn)行熒光檢測(cè)。（H）BT-549 細(xì)胞用 DMSO、carfilzomib（100 nM）或 NVP-BHG712（2 μM）處理2天后，使用底物 Suc-LLVY-AMC 通過熒光法檢測(cè)胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶體活性。（I 和 J）表達(dá) Dox 誘導(dǎo)型 GFP shRNA 或兩條獨(dú)立 PSMB5 shRNA（、）的 MDA-MB-468、BT-549 和 SUM-149-PT 細(xì)胞，經(jīng) Dox 處理4天后進(jìn)行凋亡分析（I），或經(jīng) Dox 處理2天后通過免疫印跡驗(yàn)證 PSMB5 敲低（J）。柱狀圖為 mean ± SEM；***P < 0.001， < 0.0001，與對(duì)照細(xì)胞相比差異顯著。（K 和 L）PSMB5 敲低 BT-549 細(xì)胞在有或無(wú) shRNA 耐受性 PSMB5 cDNA 補(bǔ)充條件下的凋亡分析（K）。PSMB5 表達(dá)通過免疫印跡確認(rèn)（L）。對(duì)于 A、C、G、H、I 和 K 圖，**P < 0.01，***P < 0.001， < 0.0001。

MYC 廣泛激活蛋白酶體基因轉(zhuǎn)錄并增強(qiáng)蛋白酶體活性

研究者進(jìn)一步提出，MYC 可增強(qiáng)蛋白酶體基因轉(zhuǎn)錄和蛋白酶體活性，以在生物合成需求升高的條件下維持蛋白穩(wěn)態(tài)；而 EphB4 抑制則通過壓低核心催化亞基 PSMB5 的轉(zhuǎn)錄破壞這一過程，導(dǎo)致蛋白酶體功能障礙和 MYC 依賴性凋亡。

為探索這一假設(shè)，研究者首先分析了來(lái)自 ChIP-Atlas 的公開 MYC 染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序（ChIP-seq）數(shù)據(jù)。MYC 在多個(gè)蛋白酶體亞基基因啟動(dòng)子區(qū)域顯示明顯結(jié)合峰；使用 MYC 抑制劑 MYCMI-6 處理后，這種富集明顯減少。MYCMI-6 可選擇性干擾 MYC-MAX 相互作用。作為驗(yàn)證，經(jīng)典 MYC 靶基因 HK2、SLC7A5、PSAT1、LDHA、MCM5、TFRC 和 TYMS 也表現(xiàn)出強(qiáng)烈 MYC 啟動(dòng)子占據(jù)，而這種占據(jù)可被 MYCMI-6 消除。

隨后，研究者重新分析了此前 MCF10A-MYCER 細(xì)胞有無(wú) OHT 處理的 RNA-seq 數(shù)據(jù)，以明確 MYC 如何調(diào)控蛋白酶體。結(jié)果顯示，MYC 激活后幾乎所有編碼蛋白酶體亞基的基因均上調(diào)，PSMD2 是唯一例外。針對(duì)性 RT-qPCR 進(jìn)一步確認(rèn)，OHT 處理細(xì)胞中20S 核心顆粒代表性組分 PSMA1、PSMA3、PSMA5、PSMA6、PSMB5、PSMB6、PSMB7，以及19S 調(diào)節(jié)復(fù)合體代表性組分 PSMC3、PSMC4、PSMC6、PSMD1、PSMD4、PSMD11、PSMD14 的表達(dá)均升高。在蛋白水平上，免疫印跡顯示 MYC 激活的 MCF10A-MYCER 細(xì)胞中 PSMB5、PSMB6 和 PSMB7 同步升高；而在 MDA-MB-468 細(xì)胞中敲低 MYC 后，這些亞基明顯下降。功能上，通過熒光底物水解實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MYC 激活顯著增強(qiáng) MCF10A-MYCER 細(xì)胞中 PSMB5、PSMB6 和 PSMB7 相關(guān)蛋白酶體活性；這一 MYC 誘導(dǎo)的蛋白酶體活性增加可被蛋白酶體抑制劑 MG132 完全消除。這些結(jié)果說明，MYC 可直接驅(qū)動(dòng)蛋白酶體基因的轉(zhuǎn)錄激活，進(jìn)而協(xié)調(diào)上調(diào)蛋白酶體組分并增強(qiáng)蛋白水解能力。

隨后，研究者利用 MDA-MB-468 細(xì)胞中的靶向 CUT&Tag-qPCR 和 MCF10A-MYCER 細(xì)胞中的熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)，檢測(cè) PSMB5 是否直接受 MYC 調(diào)控。位于近端 PSMB5 啟動(dòng)子區(qū)域的三個(gè)預(yù)測(cè) MYC 結(jié)合區(qū)域 P1、P2 和 P3，約位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn) TSS ?400 至 +100 范圍內(nèi)，在 CUT&Tag-qPCR 中均顯示可檢測(cè)的 MYC 富集，支持 MYC 可直接結(jié)合 PSMB5 啟動(dòng)子。與此一致，覆蓋約 TSS ?2000 至 +100 的 PSMB5 啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)，在 MCF10A-MYCER 細(xì)胞中可被 OHT 介導(dǎo)的 MYC 誘導(dǎo)激活，進(jìn)一步支持 MYC 通過 PSMB5 啟動(dòng)子促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄。然而，誘導(dǎo)性 EPHB4 敲低對(duì)這一 MYC 依賴性報(bào)告基因激活影響很小，提示 EPHB4 抑制后 PSMB5 表達(dá)下降，可能并非主要通過改變 MYC 在啟動(dòng)子上的占據(jù)或轉(zhuǎn)錄激活來(lái)實(shí)現(xiàn)。

最后，為評(píng)估研究發(fā)現(xiàn)的臨床相關(guān)性，作者分析了公開乳腺癌數(shù)據(jù)集?；?TCGA 乳腺癌隊(duì)列的 Kaplan–Meier 分析顯示，MYC 高表達(dá)和 EPHB4 高表達(dá)均與5年總體生存顯著較差相關(guān)。聯(lián)合分層進(jìn)一步顯示，同時(shí)具有 MYC 高表達(dá)和 EPHB4 高表達(dá)的患者總體生存較差，而 MYC 低表達(dá)且 EPHB4 低表達(dá)患者預(yù)后最好。此外，GEO 數(shù)據(jù)集 GSE25055 的相關(guān)性分析顯示，MYC 與 EPHB4 表達(dá)之間存在輕度但顯著的正相關(guān)，EPHB4 與 PSMB5 表達(dá)之間也存在顯著正相關(guān)?？傮w來(lái)看，這些數(shù)據(jù)支持本研究發(fā)現(xiàn)的臨床相關(guān)性，并為 MYC、EPHB4 和 PSMB5 之間的關(guān)聯(lián)提供了臨床背景。

圖6：MYC 激活蛋白酶體基因轉(zhuǎn)錄并增強(qiáng)蛋白酶體功能。（A）分析 BT-549 細(xì)胞中公開的 MYC ChIP-seq 數(shù)據(jù)（ChIP-Atlas），細(xì)胞分別接受 DMSO 或 MYCMI-6 處理。（B）MCF10A-MYCER 細(xì)胞有或無(wú) OHT 處理2天后，代表性蛋白酶體亞基基因的 RT-qPCR 分析。數(shù)據(jù)以 mean ± SEM 表示，n = 3；*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001， < 0.0001。（C）免疫印跡分析顯示 MCF10A-MYCER 細(xì)胞有或無(wú) OHT 處理2天后所示蛋白的表達(dá)。（D）MCF10A-MYCER 細(xì)胞有或無(wú) OHT 處理后，在有或無(wú) MG132 條件下，通過熒光底物水解實(shí)驗(yàn)檢測(cè)與 PSMB5、PSMB6 和 PSMB7 相關(guān)的蛋白酶體活性。（E）PSMB5 啟動(dòng)子中檢測(cè)區(qū)域示意圖，以及 MDA-MB-468 細(xì)胞中的 CUT&Tag-qPCR 分析。使用抗 MYC 抗體或?qū)φ?IgG 抗體分析三個(gè)預(yù)測(cè) MYC 結(jié)合區(qū)域 P1、P2 和 P3。（F）穩(wěn)定表達(dá) PSMB5 啟動(dòng)子報(bào)告系統(tǒng)的 MCF10A-MYCER 細(xì)胞中進(jìn)行熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞有或無(wú) OHT 處理，熒光素酶活性歸一化至 Renilla。對(duì)于 D–F 圖，數(shù)據(jù)以 mean ± SEM 表示，n = 3；**P < 0.01，***P < 0.001， < 0.0001。

機(jī)制模型：EphB4-PSMB5 軸揭示 MYC 驅(qū)動(dòng) TNBC 的合成致死弱點(diǎn)

綜合上述結(jié)果，研究提出了一個(gè) MYC 相關(guān) EphB4 抑制脆弱性的機(jī)制模型。在 MYC 驅(qū)動(dòng)癌細(xì)胞中，MYC 可協(xié)調(diào)增強(qiáng)蛋白合成，并激活蛋白酶體亞基轉(zhuǎn)錄，從而提高蛋白酶體處理能力，維持蛋白穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞生存。EphB4 抑制則降低 PSMB5 表達(dá)和蛋白酶體活性，使已經(jīng)升高的蛋白合成無(wú)法與蛋白降解相匹配，導(dǎo)致蛋白穩(wěn)態(tài)失衡，并誘導(dǎo) MYC 依賴性凋亡。這一機(jī)制將受體酪氨酸激酶信號(hào)、蛋白酶體轉(zhuǎn)錄調(diào)控和 MYC 合成致死聯(lián)系起來(lái)，也為 MYC 高表達(dá) TNBC 提供了一個(gè)潛在可干預(yù)治療軸。

圖7：MYC 相關(guān) EphB4 抑制脆弱性的機(jī)制模型。在 MYC 驅(qū)動(dòng)癌細(xì)胞中，MYC 協(xié)調(diào)增強(qiáng)蛋白合成和蛋白酶體亞基轉(zhuǎn)錄，從而提高蛋白酶體容量，維持蛋白穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞生存。EphB4 抑制會(huì)降低 PSMB5 表達(dá)和蛋白酶體活性，使升高的蛋白合成與蛋白降解脫耦，導(dǎo)致蛋白穩(wěn)態(tài)喪失并誘導(dǎo) MYC 依賴性凋亡。

【貢獻(xiàn)】★★★★★

MYC 失調(diào)參與多種人類惡性腫瘤的發(fā)生和維持，但 MYC 本身缺乏容易藥物干預(yù)的結(jié)合口袋，使其長(zhǎng)期難以作為直接治療靶點(diǎn)。為繞過這一問題，越來(lái)越多研究轉(zhuǎn)向?qū)ふ?MYC 驅(qū)動(dòng)細(xì)胞中的選擇性脆弱點(diǎn)。本研究整合遺傳學(xué)、藥理學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，將受體酪氨酸激酶 EphB4 定義為此前未被認(rèn)識(shí)的 MYC 合成致死伙伴。研究顯示，無(wú)論通過遺傳敲低還是小分子抑制，EphB4 抑制均可壓低 PSMB5 轉(zhuǎn)錄，損害蛋白酶體活性，并誘導(dǎo)強(qiáng)烈的 MYC 依賴性凋亡。由于 MYC 會(huì)廣泛提高轉(zhuǎn)錄輸出和生物合成通量，MYC 驅(qū)動(dòng)細(xì)胞對(duì)持續(xù)蛋白酶體功能存在更高依賴。破壞 EphB4-PSMB5 軸會(huì)瓦解這種蛋白穩(wěn)態(tài)韌性，從而解釋其 MYC 選擇性細(xì)胞毒作用。

這一 MYC 相關(guān)依賴性對(duì)于 TNBC 尤其重要。TNBC 缺乏有效分子靶向治療，且常出現(xiàn) MYC 表達(dá)升高。EphB4 抑制劑能夠模擬遺傳敲低效應(yīng)，提示其具有轉(zhuǎn)化應(yīng)用可行性。此外，EphB4 抑制選擇性誘導(dǎo) MYC 高表達(dá) TNBC 細(xì)胞凋亡，而不明顯影響 MYC 低表達(dá)正常上皮細(xì)胞，提示 MYC 表達(dá)或可作為患者篩選的潛在預(yù)測(cè)標(biāo)志物。EphB4 與 Bcl-2 雙重抑制所產(chǎn)生的協(xié)同腫瘤抑制作用，也說明可以進(jìn)一步利用藥物促凋亡預(yù)激策略。鑒于 EphB4 和 Bcl-2 靶向藥物已有進(jìn)入或接近臨床開發(fā)的基礎(chǔ)，這些發(fā)現(xiàn)為后續(xù)臨床轉(zhuǎn)化提供了直接線索。

靶向 EphB4-MYC 依賴軸的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于其不依賴功能性 p53。TP53 突變或缺失在 MYC 驅(qū)動(dòng)癌癥中非常常見，包括 TNBC，并常與治療抵抗和不良預(yù)后有關(guān)。本研究數(shù)據(jù)顯示，EphB4 抑制誘導(dǎo)凋亡不受 p53 狀態(tài)影響，提示治療反應(yīng)主要由 MYC 依賴性而非完整 p53 通路決定。這拓寬了 EphB4 靶向策略的適用人群，尤其是那些對(duì) p53 依賴性細(xì)胞毒治療反應(yīng)較差的患者群體。

從機(jī)制角度看，本研究揭示了 EphB4 信號(hào)與 MYC 驅(qū)動(dòng)癌癥中蛋白酶體調(diào)控之間此前未被探索的聯(lián)系。EphB4 抑制后選擇性壓低 PSMB5 轉(zhuǎn)錄，可模擬直接阻斷 PSMB5 的效應(yīng)，引起蛋白酶體活性下降和 MYC 依賴性凋亡。這一發(fā)現(xiàn)把受體酪氨酸激酶與蛋白酶體穩(wěn)態(tài)維持聯(lián)系起來(lái)，拓展了 MYC 合成致死研究的概念邊界，使其不再局限于傳統(tǒng)的代謝、復(fù)制應(yīng)激或 DNA 損傷反應(yīng)通路。

這些發(fā)現(xiàn)也對(duì)克服臨床蛋白酶體抑制劑耐藥具有啟示意義。硼替佐米、卡非佐米和伊沙佐米等藥物通過直接抑制 PSMB5 的 β5 催化活性發(fā)揮抗腫瘤作用，但其臨床應(yīng)用受到原發(fā)性或獲得性耐藥限制，耐藥常與 PSMB5 突變影響藥物結(jié)合有關(guān)。EphB4 靶向可能繞過這一局限，因?yàn)?EphB4 抑制是下調(diào) PSMB5 轉(zhuǎn)錄，而非直接結(jié)合其催化位點(diǎn)。因此，在傳統(tǒng) PSMB5 抑制劑因 PSMB5 突變而失效的情況下，EphB4 靶向治療可能仍具有作用空間。當(dāng)然，與其他激酶靶向治療類似，EphB4 抑制也可能出現(xiàn)原發(fā)或獲得性耐藥，包括影響藥物結(jié)合的突變或代償信號(hào)通路激活。因此，EphB4 靶向不應(yīng)被理解為“不會(huì)耐藥”的策略，而應(yīng)被視為一種機(jī)制不同的替代方案，尤其可能在直接 PSMB5 抑制失敗時(shí)發(fā)揮作用。

總體而言，本研究將 EphB4 抑制確立為一種機(jī)制獨(dú)特、p53 非依賴且具有藥物可及性的 MYC 驅(qū)動(dòng)癌癥靶向策略。通過連接受體酪氨酸激酶信號(hào)與蛋白酶體調(diào)控，研究勾勒出 EphB4 與 MYC 之間新的合成致死軸。這些發(fā)現(xiàn)不僅完善了 MYC 合成致死的理論框架，也將 EphB4-PSMB5 軸確立為 MYC 高表達(dá) TNBC 以及潛在其他 MYC 成癮型惡性腫瘤中的有前景治療靶點(diǎn)。

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